沉香提取物在制备防治肝癌药物中的应用-j9九游会真人

1.本发明涉及沉香领域，特别涉及沉香提取物在制备防治肝癌药物中的应用。


背景技术：

2.肝癌(liver cancer)是指发生于肝脏或从肝脏开始的恶性肿瘤。癌症也可能从其他部位转移到肝脏，称为肝转移瘤，其比例比肝脏原生性的肿瘤要高。肝癌的症状包括肋骨架右侧下方的肿块或疼痛、腹水、黄疸、容易瘀伤、体重减轻以及身体的虚弱。
3.肝癌的主要原因是因为乙型肝炎、丙型肝炎或是酒精造成的肝硬化。其他原因包括黄曲毒素、非酒精性脂肪肝疾病及肝吸虫。最常见的是肝细胞癌(hcc)，占总病例的八成，其次的是胆管癌。其他较少见的有粘液性囊性肿瘤及导管内乳头状胆道肿瘤。可以透过血液检验及医学影像来诊断，并透过组织活检来证实。
4.沉香，中药名，是由瑞香科沉香属植物木质部组织和植物分泌的物质共同组成，常指白木香，是广泛应用于香道、饰品及收藏品等方面的高价值木材，同时也是一种珍贵的药材。沉香作为中药治疗病症最早发生在梁代，《名医别录》将其列为木部上品。历代医典和本草如汉代《华佗神方》、魏晋南北朝《雷公炮炙论》等也对沉香的药效加以记载。沉香味辛、微温，能行气止痛、止呕和纳气平喘，可以使用沉香来治疗胸腹胀闷、胃寒呕吐和呼吸困难等症状。
5.沉香含有倍半萜、色酮等化学成分，具有良好的镇静镇痛、抗菌、抗肿瘤和抑制乙酰胆碱酯酶等药理活性，因而被用于消化系统、呼吸系统、心血管系统和中枢神经系统相关疾病的治疗。
6.沉香提取物具有较强的抗肿瘤活性，可对多种肿瘤细胞系产生抑制作用，具有良好的治疗前景。hashim等检测出沉香精油对人乳腺癌细胞(mcf-7)的抑制作用很强。陈晓颖等发现氯仿提取的人工沉香化学组分对四种肿瘤细胞株的抗肿瘤活性优于天然沉香。郭佩怡等研究发现，能对人相关肿瘤细胞系具有细胞毒性的沉香化合物多达16种。其他研究也发现2-(2-苯乙基)色酮二聚体类化合物可以对人骨髓性白血病细胞系(k562)产生抑制作用。但对某些肿瘤抑制作用不强，对人胃癌细胞mgc-803和人卵巢癌细胞ov-90具有较弱的细胞毒活性。
7.目前肝癌常用治疗手段包括手术治疗、局部治疗、放射治疗、化疗、分子靶向治疗、中医药治疗及免疫治疗。但是由于肝癌早期诊断困难，发展迅速，大部分患者就诊时已是中晚期或出现转移，导致肝癌预后相对较差。
8.沉香含有倍半萜、色酮等化学成分，具有良好的镇静镇痛、抗菌、抗肿瘤和抑制乙酰胆碱酯酶等药理活性，因而被用于消化系统、呼吸系统、心血管系统和中枢神经系统相关疾病的治疗。中药具有多靶点和多机理的特点，并且中药具有毒副作用小，安全性高，有着化学合成药物无可比拟的优势。最新的研究报道，沉香提取物具有较强的抗肿瘤活性，但在肝癌模型中尚未报道。


技术实现要素：

9.鉴于此，本发明提出沉香提取物在制备防治肝癌药物中的应用。
10.本发明的技术方案是这样实现的：
11.沉香提取物在制备防治肝癌药物中的应用。
12.奇楠沉香提取物或/和白木沉香提取物在制备防治肝癌药物中的应用。
13.奇楠沉香提取物或/和白木沉香提取物在制备肝癌细胞迁移抑制剂中的应用。
14.奇楠沉香提取物或/和白木沉香提取物在制备肝癌细胞克隆形成抑制剂中的应用。
15.奇楠沉香提取物或/和白木沉香提取物在制备肝癌细胞凋亡促进剂中的应用。
16.奇楠沉香提取物或/和白木沉香提取物在制备用于huh7、hepg2、hep3b细胞的抑制迁移和克隆、促进凋亡的药剂中的应用。
17.本发明还提供一种沉香提取物的制备方法，包括以下步骤：(1)取奇楠沉香或白木沉香，粉碎，得沉香粉末，用85％～90％v/v乙醇溶液浸提，减压浓缩，得浸膏；(2)将浸膏分散于水中，采用乙酸乙酯萃取，收集萃取液，减压浓缩，得浓缩物；(3)将浓缩物与夹带剂混合，置超临界co2萃取设备中，进行超临界co2萃取，收集萃取液，即得沉香提取物；
18.进一步的，步骤(1)中，沉香粉末与乙醇溶液的料液质量体积比g/ml为1：7～9，浸提温度为58～62℃，浸提时间为20～40min。
19.进一步的，步骤(2)中，浸膏与乙酸乙酯的质量体积比g/ml为1：4～6。
20.进一步的，步骤(3)中，超临界co2萃取的co2流量为15～18l/h，萃取压力为14～16mpa，萃取温度为40～43℃，萃取时间为40～60min，所述夹带剂为无水乙醇，所述浓缩物与夹带剂的质量比g/ml为1：0.1～0.2。
21.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
22.(1)本发明进行大量研究发现白木沉香提取物和奇楠沉香提取物对抗肝癌细胞具有较高的活性，可较好地应用于制备防治肝癌药物，不但能够促进肝癌细胞凋亡，抑制肝癌细胞克隆增殖，抑制肝癌细胞迁移等，较大程度降低肝癌细胞的危害。
23.(2)白木沉香提取物和奇楠沉香提取物不但能够抑制huh7、hepg2、hep3b细胞的迁移，而且能够抑制肝癌细胞克隆增殖，还能够促进肝癌细胞凋亡，可较好地应用于制备huh7、hepg2、hep3b细胞的迁移抑制剂，肝癌细胞克隆抑制剂、肝癌细胞凋亡促进剂。
附图说明
24.图1cck8法检测白木沉香提取物、奇楠沉香提取物的体外抗肝癌细胞活性。
25.图2奇楠沉香提取物体外抑制肝癌细胞克隆形成。
26.图3白木沉香提取物体外抑制肝癌细胞株迁移。
27.图4奇楠沉香提取物体外抑制肝癌细胞株迁移。
28.图5白木沉香提取物、奇楠沉香提取物transwell细胞迁移实验检测肝癌细胞迁移率。
29.图6流式细胞术检测白木沉香提取物、奇楠沉香给药后huh7细胞凋亡情况。
30.图7流式细胞术检测白木沉香提取物、奇楠沉香给药后hep3b细胞凋亡情况。
具体实施方式
31.为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
32.本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
33.本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
34.实施例1-沉香提取物的制备
35.(1)取白木沉香，粉碎，得沉香粉末，用90％v/v乙醇溶液浸提，料液质量体积比g/ml为1：8，浸提温度为60℃，浸提时间为30min，减压浓缩，得浸膏；
36.(2)将浸膏分散于水中，采用乙酸乙酯萃取，浸膏与乙酸乙酯的质量体积比g/ml为1：5，收集萃取液，减压浓缩，得浓缩物；
37.(3)将浓缩物与夹带剂无水乙醇混合，该浓缩物与无水乙醇的质量比g/ml为1：0.15，置超临界co2萃取设备中，进行超临界co2萃取，超临界co2萃取的co2流量为17l/h，萃取压力为15mpa，萃取温度为42℃，萃取时间为50min，收集萃取液，即得白木沉香提取物。
38.实施例2-沉香提取物的制备
39.(1)取奇楠沉香，粉碎，得沉香粉末，用90％v/v乙醇溶液浸提，料液质量体积比g/ml为1：8，浸提温度为60℃，浸提时间为30min，减压浓缩，得浸膏；
40.(2)将浸膏分散于水中，采用乙酸乙酯萃取，浸膏与乙酸乙酯的质量体积比g/ml为1：5，收集萃取液，减压浓缩，得浓缩物；
41.(3)将浓缩物与夹带剂无水乙醇混合，该浓缩物与无水乙醇的质量比g/ml为1：0.15，置超临界co2萃取设备中，进行超临界co2萃取，超临界co2萃取的co2流量为17l/h，萃取压力为15mpa，萃取温度为42℃，萃取时间为50min，收集萃取液，即得奇楠沉香提取物。
42.实施例3
43.1.1研究对象
44.沉香提取物，包括白木沉香提取物(实施例1)、奇楠沉香提取物(实施例2)。
45.1.2实验材料
46.dmem培养基购于美国thermo、胎牛血清(fbs)购于以色列bioind、青-链霉素双抗、无edta的胰酶、丙酮酸钠均购于美国gibco公司、cck-8试剂盒购于biosharp公司、结晶紫购于北京索莱宝科技有限公司，细胞凋亡试剂盒购于贝博公司。
47.1.3主要仪器
48.多功能酶标仪(型号：1510，美国thermo fisher scientific)；显微镜(型号：bx51，日本olympus)；流式细胞仪(型号：cytoflex，美国贝克曼库尔特公司)；电热鼓风干燥箱(型号：dhg-9075a，上海一恒科学仪器有限公司)；co2细胞培养箱(型号：4111，美国thermo公司)；倒置显微镜(型号：bds15010137，重启奥特光学)，电子天平(型号：ja5003，上海天平仪器厂)。
49.1.4药物配置
50.用电子天平精密称取白木沉香提取物、奇楠沉香提取物100mg置于1.5mlep管内，并加入1ml dmso，涡旋振荡混匀后即得白木沉香提取物、奇楠沉香提取物100mg/ml母液，以20μl/管分装避光保存于4℃冰箱，避免反复冻融。工作液用dmem稀释白木沉香提取物、奇楠沉香提取物母液至5、10、20、40、80μg/ml备用。
51.1.5实验方法
52.细胞培养：将hepg2、huh7、hep3b细胞接种于细胞培养皿中，用rpmi-1640培养基(含胎牛血清10％、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素)于37℃、5％ co2培养箱中培养，细胞呈单层贴壁生长，每2d传代一次，0.25％胰酶消化传代。1.5.1体外抗肝癌活性测定
53.采用cck8法测定对肝癌细胞增殖抑制活性，分别在96孔板上接种100μl浓度约5
×
104个/ml的待测细胞，培养24h后，加入100μl待测药物溶液，药物浓度分别为0、10、20、40、80μg/ml，继续培养48h，置于显微镜下观察每孔细胞的形态。之后，向每孔细胞中加入cck8溶液，37℃条件下反应2h后，在450nm波长下测定每孔的od值，按以下公式计算肝癌细胞增殖抑制率，并计算ic
50
值。对照组：dmso溶剂。
[0054][0055]
1.5.2克隆形成实验
[0056]
取对数生长期的各组细胞，分别用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10％胎牛血清的dmem培养液中备用。取6孔板或小皿按每孔500、1000、2000个细胞铺板，使细胞分散均匀成单个。置37℃5％ co2及饱和湿度的细胞培养箱中培养3天后换30％fbs 培养基继续培养2周。经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用pbs小心浸洗2次。加4％多聚甲醛固定细胞120min。然后去固定液，加适量0.1％的结晶紫染液染色30分钟，然后用pbs洗去染液，拍照。
[0057]
1.5.3划痕实验
[0058]
(1)细胞铺板：处于对数生长期的细胞，胰蛋白酶消化成单细胞悬液，接种于6孔培养板；视细胞大小与生长速度铺板2
×
106个细胞/孔，以确保第2天细胞能够长满，每孔加培养基2ml；
[0059]
(2)细胞培养：37℃、5％co2培养箱中培养24h。
[0060]
(3)划痕：第二天用100μl枪头的枪尖比着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕，枪头要垂直，每孔划三道。
[0061]
(4)划痕后清洗：pbs洗细胞3次，去除划下的细胞，并换无血清培养基；
[0062]
(5)拍照：4倍镜下进行拍照，保证划痕居中且垂直。在0h，24h，48h时间点取样，拍照。
[0063]
1.5.4transwell细胞迁移实验
[0064]
(1)细胞处理：处于对数生长期的细胞，消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用无血清培养基重悬。
[0065]
(2)铺板：24孔板下加入750μl含10％ fbs的培养基，取细胞悬液200μl加入transwell小室，每孔2*104个细胞。
[0066]
(3)细胞培养：37℃、5％co2培养箱中培养24h。
[0067]
(4)固定：取出transwell小室，弃去孔中培养液、用无钙的pbs洗2遍，4％多聚甲醛固定60min甚至过夜。
[0068]
(5)染色：0.1％结晶紫染色30min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用pbs洗3遍。100倍显微镜下拍照。
[0069]
(6)拍照：100倍显微镜下，最多选取五个非重复视野进行拍照，并且进行计数。
[0070]
1.5.5流式细胞术
[0071]
(1)6孔板铺板，细胞密度为1
×
106/孔。
[0072]
(2)取出6孔板，培养液分别吸入相应的流式管。
[0073]
(3)分别用1ml pbs洗，并吸入流式管。
[0074]
(4)加入500μl无edta胰酶，将所有贴壁细胞消化下来。
[0075]
(5)用移液枪将细胞吹下来，收集到相应的流式管。
[0076]
(6)吸取流式管内的细胞液冲洗6孔板，尽量收集细胞。
[0077]
(7)离心1000rpm，5min，弃去上清(确认管底是否有细胞沉淀)
[0078]
(8)加1ml pbs，离心1000rpm，5min，弃去上清，此操作重复2次。
[0079]
(9)用400μl 1x binding buffer悬浮细胞，浓度大约为1x10
6 cells/ml。
[0080]
(10)在细胞悬浮液中加入5μl annexin v-fitc，轻轻混匀后于2-8℃避光条件下孵育15分钟。
[0081]
(11)加入10μl pi后轻轻混匀于2-8℃避光条件下孵育5分钟。
[0082]
(12)在1小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。
[0083]
1.6实验结果
[0084]
1.6.1沉香提取物体外抗肝癌活性
[0085]
如图1所示，cck8法检测白木沉香提取物、奇楠沉香提取物的体外抗肝癌细胞活性，结果表明，沉香提取物在huh7、hepg2、hep3b细胞的ic
50
分别为26.66、34.04、21.28μg/ml，奇楠沉香提取物在huh7、hepg2、hep3b细胞的ic
50
分别为27.05、23.34、13.81μg/ml，cck8结果表明沉香和奇楠沉香提取物在体外均有良好的抗肝癌细胞活性。
[0086]
1.6.2沉香提取物体外抑制肝癌细胞克隆形成
[0087]
如图2所示，细胞克隆实验表明，20μg/ml奇楠沉香提取物处理肝癌细胞24h后，十四天后观察肝癌细胞的克隆形成情况，结果显示奇楠沉香提取物显著抑制了肝癌细胞克隆形成。
[0088]
1.6.3沉香提取物体外抑制肝癌细胞株迁移
[0089]
划痕实验表明：白木沉香提取物处理组，分别在剂量为40、20μg/ml时显著抑制了huh7、hep3b细胞的迁移率，如图3所示。奇楠沉香提取物处理组，在剂量为20μg/ml时显著抑制了huh7和hep3b细胞的迁移率，如图4所示。1.6.4transwell细胞迁移实验检测肝癌细胞迁移率
[0090]
如图5所示，transwell细胞迁移实验表明：在剂量为20μg/ml时，白木沉香提取物和奇楠沉香提取物处理组，均显著抑制了肝癌细胞的迁移，呈剂量依赖性。
[0091]
1.6.5流式细胞术检测沉香提取物给药后肝癌细胞株凋亡情况
[0092]
如图6-7所示，肝癌细胞凋亡流式结果表明，奇楠沉香提取物和白木沉香提取物具有促进肝癌细胞凋亡活性，沉香提取物浓度在40μg/ml时，促肝癌细胞凋亡效果最好。奇楠沉香提取物在20μg/ml时，促细胞凋亡效果最好。白木沉香和奇楠沉香提取物对huh7细胞以及3b细胞均有良好的促凋亡作用，白木沉香促凋亡效果好于奇楠沉香。
[0093]
综上，奇楠沉香提取物或/和白木沉香提取物不但能够抑制huh7、hepg2、hep3b细胞的迁移，抑制肝癌细胞株迁移，而且能够抑制肝癌细胞克隆，还能够促进肝癌细胞凋亡，可应用于制备huh7、hepg2、hep3b细胞的迁移抑制剂，肝癌细胞株迁移抑制剂，肝癌细胞克
隆抑制剂、肝癌细胞凋亡促进剂。可较好地应用于制备防治肝癌药物。
[0094]
实施例4
[0095]
沉香提取物的制备方法：(1)取白木沉香，粉碎，得沉香粉末，用85％v/v乙醇溶液浸提，料液质量体积比g/ml为1：9，浸提温度为58℃，浸提时间为20min，减压浓缩，得浸膏；(2)将浸膏分散于水中，采用乙酸乙酯萃取，浸膏与乙酸乙酯的质量体积比g/ml为1：4，收集萃取液，减压浓缩，得浓缩物；(3)将浓缩物与夹带剂混合，所述夹带剂为无水乙醇，该浓缩物与夹带剂的质量比g/ml为1：0.1，置超临界co2萃取设备中，进行超临界co2萃取，超临界co2萃取的co2流量为15l/h，萃取压力为14mpa，萃取温度为40℃，萃取时间为40min，收集萃取液，即得白木沉香提取物。该白木沉香提取物也能够抑制huh7、hepg2、hep3b细胞的迁移，抑制肝癌细胞克隆增殖，促进肝癌细胞凋亡。
[0096]
实施例5
[0097]
沉香提取物的制备方法：(1)取奇楠沉香，粉碎，得沉香粉末，用90％v/v乙醇溶液浸提，料液质量体积比g/ml为1：7，浸提温度为62℃，浸提时间为40min，减压浓缩，得浸膏；(2)将浸膏分散于水中，采用乙酸乙酯萃取，浸膏与乙酸乙酯的质量体积比g/ml为1：6，收集萃取液，减压浓缩，得浓缩物；(3)将浓缩物与夹带剂混合，所述夹带剂为无水乙醇，该浓缩物与夹带剂的质量比g/ml为1：0.2，置超临界co2萃取设备中，进行超临界co2萃取，超临界co2萃取的co2流量为18l/h，萃取压力为16mpa，萃取温度为43℃，萃取时间为60min，收集萃取液，即得奇楠沉香提取物。该奇楠沉香提取物也能够抑制huh7、hepg2、hep3b细胞的迁移，抑制肝癌细胞克隆增殖，促进肝癌细胞凋亡。
[0098]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。