1.本技术属于胶原制备技术领域，具体涉及一种壳-核微孔挤出装置及其制备难溶性纤维胶原的方法。
背景技术：
2.我国制革工业每年都会产生大量的废弃皮胶原材料(如原皮修边边角料、碱灰皮边角料等)。这些边角料主要成分为胶原蛋白，且不含重金属离子铬，比较容易实现胶原蛋白的提取及利用，若将其直接丢弃无疑是对生物质资源的巨大浪费。因此，如何利用制革边角料提取优质胶原蛋白，并将其开发为高附加值产品具有重要的经济效应和社会意义。
3.胶原蛋白是一种优质的天然生物质资源，具有生物相容性好、止血和凝血作用强等优点，可长时间用以覆盖于受创表面，进而促进血小板凝集，是制备创面敷料较为理想的天然高分子材料。因此，将胶原蛋白应用于多功能创面敷料的制备，是提高废弃胶原资源附加值的途径之一。在敷料与组织相互作用的过程中，其特有的三维结构可以为细胞生长和代谢提供一个良好微环境，调控细胞的命运，进而诱导组织再生。研究表明，真皮层中定向的胶原纤维能够调控细胞的排列与特定表型的表达。取向性纤维可以缩短炎症周期，诱导巨噬细胞向m2极化，促进组织修复。此外，多孔结构由于虹吸原理能够快速吸收创面的血液和组织渗液，迅速吸附血小板、释放凝血因子，达到快速止血的作用。基于以上分析：取向性多孔纤维可同时兼具快速止血、吸收渗液以及适当的细胞表型调节等功能，是较为理想的多功能敷料。
4.目前，大多数研究采用静电纺丝和3d打印来制备取向性多孔胶原纤维等，这些技术在一定程度上能够实现胶原蛋白微纤维的宏观及微观取向，但它们均只能采用可溶性胶原(soluble collagen，sc)作为成型材料。与sc相比，难溶性胶原纤维(insoluble collagen fibers，icfs)中的原胶原、微纤维、纤维、纤维束等结构经过逐级自主装后排列构象，其组装程度远高于sc，具有更为优良的结构稳定性和力学性能。因此，icfs更适用于创面敷料的制备，但现今关于icfs的加工技术报道较少。目前，在现有的报道中反向旋转挤出技术(counter-rotating extrusion，cre)和注射挤出(injection extrusion，ie)可以实现对icfs的加工和取向。但这两种技术加工出来的薄膜/纤维均为致密无孔结构，且单纯采用icfs原料加工处理的薄膜/纤维材料力学性能有限。
技术实现要素：
5.提供了本技术以解决背景技术中所提到的技术问题，因此需要一种壳-核微孔挤出装置及其制备复合难溶性胶原纤维的方法，以高效合理利用生物质资源为目的，采用高附加值组织工程产品转化的策略，自主设计制造一套适用于icfs的壳-核微孔挤出装置。然后，将微孔挤出与冷冻干燥相结合，优化相关参数，制备取向性多孔胶原纤维。最后，以天然的表皮层和真皮层结构为启示，将壳-核微孔挤出与静电纺丝技术相结合制备非对称湿润
性敷料，并初步探索该材料在多功能医用敷料领域中的应用，相关结果为富含胶原蛋白副产物等资源利用开辟了一条新的有效途径。
6.本技术的目的之一在于提供一种微孔挤出装置，包括：
7.注射泵，用于挤出核层材料；
8.步进电机；
9.挤出模具，所述步进电机连接所述挤出模具，用于挤出icfs物料；
10.后处理机构；
11.导管，所述导管的一端连接所述注射泵，其另一端连接所述后处理机构，所述导管的中部连接所述挤出模具。
12.进一步地，所述挤出模具包括：
13.压头，所述压头连接所述步进电机的输出端；
14.压身，所述压身用于填充icfs物料，所述压头活动设置于所述压身内；
15.底座，所述压身设置于所述底座的上端；
16.挤出针头，所述挤出针头设置于所述底座的下端，所述挤出针头与所述压身内部连通，以通过所述压头挤压所述压身内的icfs物料从所述挤出针头排出至所述导管中。
17.进一步地于，还包括：
18.l形挤压板，所述l形挤压板设置于步进电机的滑轨上，用于挤压挤出模具以挤出icfs物料；
19.模具支架，所述模具支架上安装所述挤出模具；
20.步进电机卡槽箱体，所述步进电机卡槽箱体上安装所述步进电机。
21.进一步地，所述后处理机构包括恒温水浴锅，所述恒温水浴锅内设置成纤缓冲液或去离子水。
22.进一步地，所述恒温水浴锅包括依次管道连接的第一锅体和第二锅体，所述第一锅体内设置成纤缓冲液，所述第二锅体内设置去离子水。
23.本技术的目的之二在于提供一种制备难溶性纤维胶原的方法，基于如上所述的微孔挤出装置，所述方法包括：
24.取牛皮真皮样本，放入nacl溶液中；
25.放入丙酮中以脱脂，再进行通风静置；
26.冷冻后用切片机切碎，取适量切碎后的牛皮，放入去离子水中，用hac调节ph；
27.酸化后，将牛皮匀浆至无碎粒为止，匀浆后加入nacl以及胃蛋白酶，放入4℃下酶解；
28.将酶解后的材料离心，弃掉上清液，将材料加到去离子水中，并匀浆至完全散开，调节ph至6.8-7.2，冷藏静置；
29.再次离心，弃掉上清液，将剩余材料加入到hac溶液中，匀浆至完全散开，冷藏或冷冻静置；
30.调节ph至7.0-7.4左右，冷藏静置；
31.再次离心(10000r/min，10min，4℃)，弃掉上清液，将沉淀进行多次清洗、透析后冷冻干燥得到难溶性纤维胶原。
32.进一步地，通过如下方法确定用hac调节ph的酸化ph值：
33.将酸化ph值设置三个梯度，分别为2.5、3.0、3.5，以最终胶原提取率作为优化指标，筛选出牛皮酸化的最优ph。
34.进一步地，通过如下方法确定酶解浓度：
35.将酶解浓度设置三个梯，分别为1％、1.5％、2％，以最终胶原提取率作为优化指标，筛选出最优的酶解浓度。
36.进一步地，通过如下方法确定酶解时间：
37.将酶解时间设置三个梯度：24h、36h、48h，以最终胶原提取率作为优化指标，筛选出牛皮酶解的最优时间。
38.进一步地，所述方法还包括：
39.以sa与cll共混作为核层材料，所述sa与cll的浓度配比根据曲线计算应力应变、断裂强度、断裂伸长率以及弹性模量表征材料的力学性能来进行确定；
40.将难溶性纤维胶原填充至所述挤出模具中，通过挤出模具挤出难溶性纤维胶原，以及注射泵泵出所述核层材料，得到壳-核结构，
41.将所述壳核结构浸没于ffb溶液中进行后处理，所述ffb溶液中至少包括氯化钠、乙磺酸、磷酸氢二钠以及聚乙二醇。
42.本技术的有益之处在于：
43.(1)胶原提取方案经优化后，最佳的条件分别是：酸ph为3.0、酶解浓度为1.5％、酶解时间为72h。
44.(2)提取的胶原材料经表征后明，结构完整与市售相似且热稳定性高，表明制的提取方案无误。
45.(3)挤出参数经优化后，各的最适值分别是：胶原浓度6％、挤出针头s2-1：17g、sa(5％ cll)、壳核层挤压速率3mm/s。
46.(4)基于上述优化挤出参数，采用自主研发的壳-核微孔挤出装置可以实现制备取向性多孔复合难溶性胶原纤维。
附图说明
47.图1为本技术实施例的一种微孔挤出装置的整体结构示意图。
48.图2为本技术实施例的壳-核挤出模具结构示意图；(a)挤出模具整体3d建模图；(b)压头；(c)压身；(d)底座；(e)挤出针头。
49.图3为本技术实施例的核挤出模具实物图。
50.图4为本技术实施例的壳层挤出控制装置的电路原理图。
51.图5为本技术实施例的挤出模具支架整体建模图。
52.图6为本技术实施例的支架主要部件三视图；(a)支架箱体；(b)挤出模具支架；(c)l形挤压板。
53.图7为本技术实施例的微孔挤出装置的实物图。
54.图8为本技术实施例的网格划分图。
55.图9为本技术实施例的不同孔径的压力分布云图：a-13g(外2.4mm，内1.9mm)；b-15g(外1.8mm，内1.4mm)、c-17g(外1.47mm，内1.07mm)
56.图10为本技术实施例的不同孔径的剪切力分布云图：a-13g；b-15g；c-17g。
57.图11为本技术实施例的胶原提取方案参数优化结果图；(a)酸化ph优化；(b)酶浓度优化；(c)酶解时间优化；(d)提取胶原外部宏观图。
58.图12为本技术实施例的胶原红外光谱图。
59.图13为本技术实施例的胶原sds-page图：(a)商售胶原；(b)icfs。
60.图14为本技术实施例的dsc分析图：(a)商售胶原；(b)igfs。
61.图15为本技术实施例的胶原浓度优化挤出效果图及sem图；(a)胶原挤出浓度4％、5％、6％宏观图；(b)扫描电镜，从左往右浓度依次为4％、5％、6％；(c)浓度4％、5％、6％多孔结构孔径分布区间图。
62.图16为本技术实施例的浓度4％、5％、6％的吸水率及保水率柱状图，*p《0.05，**p《0.01。
63.图17为本技术实施例的各孔径挤出针头对比图。
64.图18为本技术实施例的针头孔径优化，从左至右依次为13g、15g、17g；(a)13g、15g、17g宏观图；(b)扫描电镜图；(c)多孔结构纤维取向角度分布区间图。
65.图19为本技术实施例的核层组分优化图；(a)直径测试；(b)应力应变曲线。
66.图20为本技术实施例的壳核层速率优化挤出效果图；(a)壳核层速率为6mm/s；(b)壳核层速率为3mm/s；(c)壳核层速率1mm/s。
67.图21为本技术实施例的壳-核结构胶原基纤维的宏观形貌图(a)、微观形貌图(表面，b)和(横截面，c)。
具体实施方式
68.以下列举的部分实施例仅仅是为了更好地对本发明进行说明，但本发明的内容并不局限在应用于所举的实施例中。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整而应用于其他实施例中，仍在本发明的保护范围之内。
69.现在结合说明书附图对本发明做进一步的说明。
70.实施例1：
71.众所周知，人体大多数组织(如皮肤、血管、肌腱等)ecm的纤维具有明显的取向性。在组织工程领域，对表现出与ecm相似特性的生物相容性材料有相当大的需求。胶原蛋白是人体组织ecm的结构蛋白，具有良好的力学性能、生物可降解性、低免疫原性等特点，以及良好的细胞附着和生长的能力，是一种在伤口愈合和组织再生领域很有前景的生物材料。而如何使胶原蛋白仿生天然组织ecm，使其能够调控细胞的命运，则是组织再生的关键。
72.我国的制革领域每年会产生大量的原皮及灰碱皮的边角料，其主要成分为胶原蛋白，若将其提取并转化为高附加值的医用敷料，具有较大的经济效益和社会价值。胶原蛋白分为可溶性胶原和难溶性胶原(insoluble collagen fibers，icfs)，后者的自组装程度和机械性能比前者更接近天然的胶原蛋白ecm，更适用于医用敷料的制备。目前市场上比较成熟的加工胶原蛋白的技术主要为3d打印和静电纺丝技术，但它们更适用于可溶性胶原蛋白分子。在前期报道中，反向旋转挤出技术和注射技术可以实现对icfs的成型和取向性调控，但这两种技术成型材料均为致密无孔结构，且单纯采用icfs原料加工处理的薄膜/纤维材料力学性能有限。
73.基于此，本实施例设计开发了一套适用于icfs的全自动壳-核微孔挤出装置。我们
进一步采用ansys软件对不同孔径(13g、15g、17g)微孔的剪切力和压力进行流体力学模拟分析，为后续指导微孔挤出对icfs纤维取向的调控实验奠定一定的理论基础。
74.以医用注射器为启示，并在此基础上进行改进，如图1所示，提出一种微孔挤出装置。将挤出模具设计为壳-核结构，壳层是以水溶体系的icfs为基材的天然高分子材料，核层是适用于挤出成型的其它任意高分子材料或无机非金属材料，它们可以与壳层icfs结合提高其力学性能，通过挤出得到一体成型的胶原基纤维。其中，步进电机为壳层物料挤出装置，注射泵为核层物料的挤出装置，挤压装置都为自动化，减小手动挤出过程中因速率不均等造成的实验误差。挤出后，为了进一步提高胶原基纤维的力学强度和稳定性，需进行纤维自组装、交联、清洗等后处理。因此，在挤出装置下方设置为成纤缓冲浴及去离子水浴，并通过恒温水浴锅进行自动控温。
75.挤出模具结构如图2所示，上半部分采用了注射器的原理，使得icfs挤压成型，其中压头、压身组成模具的上半部分(如图2，b、c所示)，模具的压身是的icfs物料填充区。下半部分分为底座和挤出针头(如图2，d、e所示)，其中针头为壳核结构。在最初设计时，针头在壳层前端为直筒型，且底座与针头不可拆分，使得icfs在挤出过程中极易发生堵塞，极大影响实验进程。而后在最初设计的基础上，将挤出针头改为可拆卸型，针头与底座也可拆分，便于清理的同时，还可使得粘流性的核层材料以及icfs不易发生堵塞，有效推动实验进程。基于icfs物料特性(高粘度、酸性)，采用316l不锈钢材质，实物图如图3所示。
76.该装置可以实现自动化，如图4所示，提供自动化控制的电路原理图。自动化挤压装置主要由控制电源、驱动器、运动控制器、两相步进电机、直线模组滑台、行程接近开关组成。按照电路原理图将各部分进行组装。
77.进一步，根据步进电机、挤出模具的尺寸对连接支撑和固定装置进行设计和加工。如图5和图6所示，整体分为三个部分：l形挤压板、挤出模具支架以及步进电机卡槽箱体。l形挤压板是镶嵌在步进电机滑轨上，用于挤压icfs材料。挤出模具支架是用以放置并固定挤出模具，防止在挤出过程中，模具发生脱落。
78.模具支架整体设备长约50cm、宽约30cm、高约23cm，中间正方形凹槽为步进电机放置点。前方为挤出模具支架，整体呈几字型，长约30cm、宽约18cm、高约22cm，支架表面为挤出模具的圆环形卡槽，通过拧动y字形螺杆上的螺帽来固定挤出模具，挤出模具针头可从中间长条形孔槽。
79.后方箱体为步进电机驱动器、控制电源、控制器等放置点，防止在电机运行过程中，因电元件归置不当造成电路故障。整体挤出设备实物图如图7所示。
80.对该装置的微孔挤出的流体力学模拟分析如下：
81.1、网格分析
82.网格划分是有限元仿真分析必不可少又至关重要的一部分，为了提高计算的精度和计算效率，需要对网格进行划分，有效网格的质量会影响计算结果的精度、求解的收敛性以及求解速度。几何模型如图8所示，两种粘流性流体通过两种流道在出口位置附近汇合。为了顺利开展模拟，提取内部流体区域，在流体进口位置设置为inlet进口边界，在流体出口位置设置为outlet出口边界条件。
83.此次网格划分采用fluent meshing划分的多面体网格。划分的多面体网格是一种在三维空间中使用多边形(如四边形、五边形等)划分物体表面并形成网格的方法。与传统
的四面体网格相比，它具有以下优势：
84.(1)更高的网格质量：多面体网格可以在表面和内部自适应地生成多种不同形状和大小的多边形，从而可以更好地捕捉物体的几何形状，减少网格扭曲和失真。
85.(2)更高的网格效率：多面体网格可以在同样数量的网格单元的情况下，提供更高的网格分辨率，从而减少了计算资源的需求。
86.(3)更容易生成：相比于四面体网格，多面体网格的划分方式更加简单，易于自动生成。
87.(4)更适用于复杂几何形状：在处理复杂的几何形状时，多面体网格通常比四面体网格更具有优势，因为它可以更好地适应表面形状，并且可以通过调整单元大小来保证几何细节的准确性。
88.使用fluent meshing划分网格的简要步骤如下：在fluent meshing中导入需要进行网格划分的几何模型，导入ug文件，创建几何模型；使用初始网格生成器创建初始网格；在进行后续的网格划分之前，对初始网格进行修剪和分离(移除不需要的部分，进行域的分离)；使用多面体划分器对网格进行划分；调整网格大小、网格分辨率等网格参数；在完成网格划分之后，采用网格扭曲、网格尺寸分布、网格单元质量对网格进行质量检查，以确保生成的网格质量符合要求；导出网格文件，以供后续的fluent模拟使用。
89.2、孔径分析
90.(1)压力模拟分析
91.采用了cfd数值计算方法，各规格挤出针头的压力云图如图9所示。在此次模拟分析中，挤出针头可类比为高分子流动模型中的管道模型。由于高分子流体层间的黏滞阻力及与管道的摩擦阻力的作用，沿管道流动过程中会出现压力变化，而流道的截面形状和尺寸改变也会引起高分子流体中压力、体积流量等的变化。如本次模拟分析中孔径的改变则会对胶原材料的压力产生变化。从图中可以看出，不同大小孔径的模型具有的分布规律，核层针头和壳层针头均呈现自入口到出口压力逐渐降低的规律，这是因为出入压差提供了流体流动的动能，在流体流动过程中压力能转化为了流体动能。
92.17g的模型核层针头的入口压力为16433.05pa，壳层针头的入口压力58221.46pa；15g的模型核层针头的入口压力为16371.96pa，壳层针头的入口压力为22226.69pa；13g的模型核层针头的入口压力为16412.25pa，壳层针头的入口压力17067.12pa。可以看出随着壳层针头孔径的增加，壳层针头入口压力逐渐降低，核层针头入口压力无较大变化，可能是因为没改变内针头孔径，在保证入口流体流速为定值时，模型入口压力及出口压力不发生较大变化。而壳层针头出口压力随着孔径增加逐渐增大，13g时为19.60pa，15g时为87.73pa，17g时为645.84pa。
93.(2)剪切力模拟分析
94.采用cfd数值计算方法，各规格挤出针头的剪切力分布云图如图10所示。胶原材料在锥形挤出针头中的流动方式是一种收敛流动，即高分子流体在截面积逐渐变小的流道中流动。这种流动不仅受到剪切作用，而且还受到拉伸作用。从图中可以看出，不同孔径下的壁面剪切力呈现类似的规律，即管径数值较小的位置更易形成更大的剪切力，这是因为流体流动遵循质量守恒定律，孔径小的地方流体流速更大，对壁面的剪切作用更强形成较大的剪切力。分别研究各个孔径下的模型的壁面剪切力分布，壳层出口位置的剪切力随着孔
径减小逐渐增大，13g时为87.73pa，15g时为241.20pa，17g时为3236.87pa
95.挤出孔径对于胶原材料挤出的影响：在多数情况下，高分子流体表现出稳定的层流流动并服从幂律定律，在符合这个定律的情况下，剪切应力与挤出孔半径呈线性关系，与流体的种类无关。即在一定范围内，挤出孔径越小，对胶原的剪切力越大，胶原的取向性越好。
96.本实施例的所提出的装置主要由注射泵、步进电机挤压装置、挤出模具、模具连接和固定支架、后处理浴组成。注射泵为挤出壳核结构中核层材料的挤压装置，设备行程距离是10cm，挤出核层材料时，实验速率可设置为1mm/s
–
100mm/s的范围。步进电机是挤出壳核结构中壳层icfs挤压装置，由驱动器、控制器、控制电源、电机、模组滑台、行程开关等组成，设备行程距离是20cm，挤出胶原材料时，实验速率为0.1mm/s-100mm/s。
97.提前设定后处理浴的温度，待其稳定后，可进行材料的挤出成型。将icfs凝胶装入壳-核微孔挤出模具(如图3)中，将模具放置于支架的圆环形卡槽中(如图6)，并通过拧动y字形螺杆上的螺帽来固定模具。同时，将核层材料装入医用注射器中，并固定于注射泵中。然后，分别设置步进电机和注射泵的速率，启动程序。将胶原基纤维材料挤出后处理浴中，待纤维满足所需长度后关闭电源。
98.该装置具有以下优势：
99.(1)根据icfs的物料特性，采用316l不锈钢为原材料，以挤出模具为核心、步进电机和注射泵为挤出驱动模块，恒温水浴锅为后处理温控设备，设计制造了一套可拆卸式、自动化壳-核微孔挤出装置，可实现具有壳-核结构的胶原基纤维的一体化成型。
100.(2)建立壳-核微孔三维模型，采用ansys fluent meshing进行多面体网格划分和边界条件设定，然后进行fluent胶原挤出微孔的压力和剪切力模拟分析。结果表明：在入口流速一定的情况下，随着孔径的减小，压力和剪切力逐渐增大。
101.实施例2：
102.根据提取方法，胶原蛋白主要分为可溶性胶原(sc)和难溶性胶原(icfs)。其中，sc的提取方法较为成熟，主要包括酸法、碱法、盐溶法、酶解法、酸酶结合法等。此外，超声及微波处理能够辅助提高胶原蛋白的提取率、缩短提取时间。其中，盐溶法的提取率较低，且会受到盐的种类、浓度、温度等多种因素的影响。碱法提取的胶原蛋白水解严重，且有致畸致癌的可能。因此，在生物医用领域中这两种方法提取的产物不能满足要求。酸法和酶法，前者通过破坏胶原分子的离子键和shiff键，达到增溶提取的目的；而后者可特异性地作用于胶原蛋白分子的端肽，达到提取的目的。两种方法提取的胶原蛋白均能完整保留其三股螺旋结构，满足生物医用领域的要求。酸-酶结合法顾名思义是将酸法和酶法进行结合的提取方法，可结合两者的优点，使用更为广泛。目前icfs的提取和成型制备的报道较少，而与sc相比，icfs的组装程度更高具有更为优良的结构稳定性和力学性能，更适合于医用敷料的制备。因此，本实施例拟采用牛皮真皮层为原料，采用酸酶结合法，探索icfs的提取条件(主要包括酸化ph、酶解浓度、酶解时间)，优化参数提取icfs。
103.进一步，在已经设计制造一套壳-核微孔挤出装置的基础上，设计挤出方案。海藻酸钠(sodium alginate，sa)和纤维素(cellulose，cll)都是天然高分子材料，具有价格低廉、良好的生物相容性、生物可降解性和力学性能等优点。且sa与多价阳离子(如ca
2
)溶液接触后，可交联形成网络结构，瞬时凝胶化。将两种组分混合(sa/cll)，通过挤出技术成型
可制备高强度、强韧性的纤维材料。因此，sa/cll适合作为壳-核微孔挤出的核层组分。基于此，本实施例采用icfs凝胶为壳层组分，sa/cll为核层组分，优化变量参数(主要包括壳层胶原浓度、壳层挤出孔径、核层组分浓度以及壳核层挤压速率)，结合冷冻干燥技术制备具有壳核结构的取向性多孔胶原基纤维，为进一步在医用敷料上的应用奠定基础。
104.实验材料和实验仪器如表1和表2所示：
105.表1.实验材料
106.材料厂家牛皮屠宰场氯化钠(nacl)重庆万盛川东化工丙酮(c3h6o)重庆万盛川东化工冰醋酸(hac)重庆万盛川东化工氢氧化钠(naoh)成都市科隆化学品胃蛋白酶北京索莱宝科技乙磺酸上海麦克林生化科技磷酸氢二钠(na2hpo4)上海麦克林生化科技无水乙醇重庆万盛川东化工胶原蛋白上海麦克林生化科技盐酸(hcl)重庆东方化学试剂磷酸盐缓冲溶液(pbs)北京biosharp海藻酸钠(sa)北京索莱宝纤维素(cll)北京索莱宝氯化钙(cacl2)北京索莱宝
107.表2.实验仪器
[0108][0109]
实验方法：
[0110]
1)难溶性胶原纤维的提取
[0111]
(1)取牛皮真皮样本，去除表面的杂质，用去离子水洗净，放入0.9％的nacl溶液中，置于4℃下24h；
[0112]
(2)用去离子水洗净，放入丙酮中24h用以脱脂，再放到通风橱静置过夜；
[0113]
(3)放入冰箱，冷冻后用切片机切碎(约1mm碎粒)，取5g切碎后的牛皮，放入300ml去离子水中，用0.5mol/l hac调节ph(酸化ph待优化)，酸化24h后；
[0114]
(4)酸化后，将牛皮放入高速乳化机中匀浆，匀浆至无碎粒为止(约30min)，匀浆后加入nacl以及胃蛋白酶(酶解浓度待优化)，使得溶液浓度为1mol/l nacl，放入4℃下酶解(酶解时间待优化)；
[0115]
(5)将酶解后的材料放入低温离心机离心(10000r/min，10min，4℃)，弃掉上清液，将材料加到300ml去离子水中，然后用高速乳化机将材料匀浆至完全散开(约10min)，接着用1mol/l的naoh溶液调节ph至7.0左右，放入冰箱静置过夜；
[0116]
(6)再次离心(10000r/min，10min，4℃)，弃掉上清液，将剩余材料加入到300ml 0.1mol/l hac溶液中，用高速乳化机将材料匀浆至完全散开(约10min)，放入冰箱静置过夜；
[0117]
(7)用1mol/l的naoh溶液调节ph至7.2左右，放入冰箱静置过夜；
[0118]
(8)再次离心(10000r/min，10min，4℃)，弃掉上清液，将沉淀用去离子水多次清洗后透析3d，最后冷冻干燥。
[0119]
2)难溶性胶原纤维提取条件优化
[0120]
(1)酸化ph的优化：
[0121]
将酸化ph设置三个梯度：2.5、3.0、3.5，以最终胶原提取率作为优化指标，筛选出牛皮酸化的最优ph。
[0122]
(2)酶解浓度的优化：
[0123]
将酶解浓度设置三个梯度：1％、1.5％、2％，以最终胶原提取率作为优化指标，筛选出牛皮最优的酶解浓度。
[0124]
(3)酶解时间的优化：
[0125]
将酶解时间设置三个梯度：24h、36h、48h，以最终胶原提取率作为优化指标，筛选出牛皮酶解的最优时间。
[0126]
3)难溶性胶原纤维的结构和组成表征
[0127]
基于上述优化的条件后，将提取的胶原材料与市售胶原(麦克林，上海)进行如下表征，并对照分析。
[0128]
(1)ftir
[0129]1–
2mg icfs样品，剪碎，与200mg kbr粉末混合，在玛瑙乳钵中研磨细后压制成片(16mpa，2min)。记录在4000
–
400cm-1
范围内的谱图。
[0130]
(2)sds-page
[0131]
用0.5mol/l hac配制为浓度1mg/ml的胶原溶液备用；制胶(6％分离胶和5％浓缩胶)，并依次进上样、电泳、考马斯亮蓝染色、分析各条带分子量。
[0132]
(3)氨基酸分析
[0133]
精确称取15-20mg的胶原纤维，置入安培管中，加入适量6mol/l hcl溶液使其溶解，熔封管口，在110℃条件下水解18h-24h，蒸干。加入流动相反应，再经过正己烷萃取，稀释，过滤膜等处理，采用hplc进行氨基酸组成分析。
[0134]
(4)dsc
[0135]
称取胶原纤维样品3～5mg，以空白坩埚作为对照。在n2保护条件下，升温速率10℃/min，温度范围20℃～160℃。
[0136]
4)挤出参数的优化
[0137]
(1)胶原浓度优化
[0138]
首先，配制成纤缓冲液(fibre formation buffer,ffb)：135mm氯化钠、30mm乙磺酸、30mm磷酸氢二钠、10％聚乙二醇。
[0139]
然后，参照前文所述的优化的条件，提取icfs。以0.5％mol/l hac为溶剂，配制浓度为4％、5％、6％的icfs凝胶。采用自主研发的壳-核微孔挤出装置(只通入壳层icfs凝胶，不通入核层材料，)，15g挤出针头，3mm/s挤压速率，挤出成型。将成型纤维浸没于ffb溶液中(35℃、60min)，去离子水冲洗3次后，浸没于pbs溶液中(22℃、15min)，去离子水冲洗3次，冷冻干燥，并对胶原纤维进行如下表征：
[0140]
①
sem
[0141]
将10mm长的纤维材料用导电胶带粘贴于载物台上，喷金20s处理，采用sem观察并记录拍照(电压3kv)。进一步，随机选取3-5个视野，通过image j对材料表面的孔径进行统计，每个样本测量孔径数量》60。通过origin作孔径分布图，并进行高斯曲线拟合。
[0142]
②
吸水率
[0143]
将30-40mm长的胶原纤维(初始质量记为m0)放置在烧杯中，加入5ml pbs。30min
后，轻轻用滤纸擦干敷料表面的液体，测量其质量并记录为m1。吸水率按以下公式计算：
[0144]
吸水率＝(m
1-m0)/m0×
100％
[0145]
③
保水率
[0146]
将30-40mm长的胶原纤维浸没于pbs溶液中30min，将其置于离心管内，在管底填充滤纸以吸收离心所脱去的pbs。离心(1200rpm，15min)，称量并记录质量m2，再将材料置于烘箱中烘干至恒重并记录其质量m3，保水率按以下公式计算：
[0147]
保水率＝(m
2-m3)/m2×
100％
[0148]
综合对比挤出后三种浓度材料的形貌、sem、吸水率、保水率及挤出过程，选取最为合适的浓度。
[0149]
(2)挤出针头孔径优化
[0150]
采用不同孔径规格(13g、15g、17g)的挤出针头，挤出方法(其它参数为：6％胶原，3mm/s挤压速率)和后处理，其中后处理在前文已经阐述，此处直接按照前文所述的后处理方式进行。采用sem对胶原纤维的表面形貌进行观察。
[0151]
进一步，随机选取3-5个视野，通过image j对材料表面纤维的取向进行统计(将y轴方向定义为0
°
，顺时针方向夹角为θ，逆时针方向夹角为-θ)，每个样本测量数量》60。通过origin作孔径分布图，并进行高斯曲线拟合。
[0152]
最后，根据挤出过程、可清理程度、宏观形貌及微观形貌综合对比，优化针头孔径。
[0153]
(3)核层组分配比优化
[0154]
以sa与cll共混作为核层材料(记为sa/cll)，它们的不同配比对力学性能有较大的影响，应对其进行优化。称取2g sa溶于100ml去离子水中，设置四组不同浓度(2％、5％、8％、10％)的cll与2％sa混合。采用注射泵通过注射器挤出成型(挤出速率为6mm/s)制备sa/cll纤维。同时，为了便于观察核层挤出的稳定性，在核层溶液中加入10mg台盼蓝。进一步，采用万能力学试验机，对sa/cll纤维进行力学拉伸测试(夹具中间距离为20mm
±
1mm，拉伸速率为5mm/min)，记录力-位移曲线。在倒置显微镜下拍照，采用image j统计纤维的平均直径，计算截面积。
[0155]
进一步，根据曲线计算应力应变、断裂强度、断裂伸长率以及弹性模量等参数表征材料的力学性能，最后综合分析选出最为合适的浓度配比。
[0156]
(4)壳核层挤出速率优化
[0157]
在上述优化实验的基础上，以6％ icf凝胶为壳层材料，sa/cll(5％)为核层材料17g挤出针头进行挤出实验。使壳层与核层材料同步保持速率挤出，设置三个不同梯度，分别为：1mm/s、3mm/s、6mm/s，最后根据挤出整体壳核结构材料的宏观形貌优化挤出速率。
[0158]
实验结果：
[0159]
如图11所示，酸化ph和酶解浓度对icfs的提取率均表现为先升高后降低的相似趋势。酸化ph和酶解浓度分别在3.0和1.5％时，提取率最高，分别可达37.45％，38.35％。在优化酶解时间实验中，设置梯度24h，36h，48h，60h，72h，84h六个梯度，如图11所示，酶解时间在60h后，胶原提取率上升趋势减缓，在72h达到峰值38.18％，说明在胶原提取过程中，72h为最佳酶解时间。综上，以上几个优化实验中最佳的胶原提取条件分别是：酸化ph3.0、酶浓度1.5％、酶解时间72h。
[0160]
难溶性胶原纤维的结构和组成表征：
[0161]
(1)ftir
[0162]
傅里叶变换红外光谱可以反映胶原的二级构象，为了表征此次提取胶原的二级结构，将其与商售胶原蛋白进行了ftir光谱分析比较，如图12所示。3270cm-1
处的强吸收是由于酰胺a带的n-h基团的伸缩振动(氢键)峰，在2934cm-1附近的弱吸收主要是酰胺b带的c-n基团伸缩振动引起的特征吸收峰。酰胺i带通常在1631cm-1
左右，主要由c＝o基团的伸缩振动引起，而酰胺ii带出现在1529cm-1
左右由c-n伸缩振动耦合和n-h弯曲振动引起。如图12所示，与商售胶原类似，提取的icfs出现了上述提及的特征性吸收峰(酰胺a带：3289cm-1
vs 3270cm-1
，酰胺b带：2934cm-1
vs 2934cm-1
，酰胺i带：1629cm-1
vs 1631cm-1
，酰胺ii带：1543cm-1
vs 1529cm-1
，酰胺ⅲ带：1285cm-1
vs 1243cm-1
)。结果显示：两种胶原蛋白样品的特征峰是在相似的波数处得到的，表明制备的icfs具有胶原的结构特征。酰胺ⅲ带对胶原蛋白的二级结构变化非常敏感，当样品在1235-1450cm-1
处存在吸收峰，且酰胺ⅲ带与1450cm-1
附近处的吸光度比值为1时，胶原蛋白具有完整的三股螺旋结构。由图可见，在1285cm-1
、1448cm-1
处存在吸收峰，且比值为0.9926，表明胶原的提取结构完整。
[0163]
(2)sds-page
[0164]
图13为所提取胶原纤维材料的sds－page分析图，其中a泳道为麦克林胶原，b泳道为难溶性胶原(icfs)。胶原纤维电泳依次得到3条分离带，分别为β、α1及α2，其中β分子质量约为170kda，α2分子质量约为115kda。α2链以下没有多余的电泳带，说明所提取的胶原纤维中没有小分子的胶原多肽。
[0165]
(3)氨基酸分析
[0166]
由表3可以看出：商售胶原与提取icfs的氨基酸组成相似，即它们均不含色氨酸，甘氨酸(31.9％vs 32.5％)和亚氨酸(羟脯氨酸(9.6％vs 10.1％)、脯氨酸(12.2％vs 13.1％))含量接近，与文献报道一致。结果表明，提取icfs胶原蛋白的一级结构特征。
[0167]
表3.胶原的氨基酸组成分析
[0168][0169][0170]
(4)dsc
[0171]
如图14所示，将麦克林胶原与提取的难溶性胶原进行差式扫描热量分析对比。由图14中可知，两个样品的吸热峰均尖锐陡峭，表明样品纯度较高。难溶性胶原的热变性温度高于麦克林胶原(107.34℃vs 73.37℃)。胶原蛋白的热吸收峰反映的是胶原蛋白分子的三股螺旋结构逐渐被破坏，分子由伸展有序状态转变为无序卷曲状态的难易程度。因此，在一定程度上可以反应出难溶性胶原的结构稳定性高于对照组，在实际应用时不会轻易变性。
[0172]
胶原浓度：
[0173]
当胶原浓度为4％时，挤出过程顺畅，但胶原因黏度过低导致挤出时较易破裂和挤出不均匀，如图15中的(a)中圈内所示。当胶原浓度为5％时，挤出过程顺畅，胶原整体挤出状况良好，整体挤出形态良好，破裂情况减少，但也会存在挤出不均匀的状况。当胶原浓度为6％时，挤出较为顺畅，挤出时因胶原因黏度较高，挤出时胶原紧密度及形态良好，整体质地比较均匀，基本没有发生破裂。根据图15中的(b)的sem结果对比，4％、5％、6％的胶原都存在一定的取向性。对其表面孔径进行半定量分析(如图15中的(c))，浓度4％和5％多孔结构相似，孔径主要分布在4-6μm且孔之间的连通性好；而6％中的孔径范围主要集中于0-4μ
m。理论上，较小的孔径更容易出现微孔虹吸作用，具有更好的吸收渗液的作用。另一方面，较大且连通性好的孔隙结构在创面修复时，成纤维细胞更容易迁移至孔隙结构中，可能发生敷料与皮肤创面的粘连，导致二次伤害。
[0174]
因此，我们进一步对不同浓度纤维材料的吸水率及保水率进行检测。结果如图16所示，5％、6％吸水率相当，且均显著大于4％。而随着胶原浓度的增加，保水率成上升趋势，表明6％具有较好的吸收渗液的作用，与理论分析一致。因此，综合挤出过程、胶原宏观形态、微观形貌以及吸水率和保水率等指标，胶原浓度在6％时，实验效果最佳，适合用于后续敷料制备实验等。
[0175]
挤出针头孔径：
[0176]
在实验前期，我们采用将挤出针头焊接在挤出头底部(s1)，以此来保证挤出时的密闭性，实验过程中发现，以此制作的挤出模具，针头不易清洗，容易堵塞。
[0177]
进一步，设计并加工了转接头，(s2)以便于更换不同规格的针头。为更好地优化支架挤出参数，我们采用多种型号的挤出针头进行挤出对比实验，如图17所示，从左往右s2-1，s2-2，s2-3，s2-4依次为锥形针头外径17g(1.07mm)、锥形针头15g(1.40mm)、锥形针头13g(1.90mm)、直型针头17g。内径不变，22g(0.40mm)，我们将实验过程中阻碍胶原材料挤出成型的实验现象按照5级评分系统进行评分，如模具的挤出流畅度、堵塞程情况以及清洁情况，阻碍程度随数字的增大而提高，胶原成型率分为3级，第一级，胶原成型不均匀或易散开；第二级，胶原挤出较为均匀，胶黏形态良好；第三级，胶原挤出均匀，整体胶原挤出形态良好。
[0178]
实验结果如表4、图18所示，当挤出针头为13g时，挤出过程顺畅，但因孔径较大，挤出时的压力对胶原束缚力较小，导致容易挤出不均匀，由sem观察发现，胶原纤维之间比较松散，取向性较差；当挤出针头为15g时，挤出过程较为顺畅，且挤出压力对胶原的束缚力增大，挤出不均匀减少，但由sem观察发现，整体胶原取向性不如17g；当挤出针头为17g时，挤出过程较为困难，但因挤出压力对胶原的束缚力再次增大，整体挤出胶原均匀，挤出胶原形态良好，由sem观察，取向性好，胶原纤维紧密度高。经半定量统计发现(如图18中(c)所示)，随着针头孔径的减小，纤维取向程度呈递增趋势，该结果与第2章中对微孔的剪切力流体力学结果趋势一致(图10)。综上所述，s2-1在保证挤出流畅度、堵塞情况、清洁情况都处在中上水平的前提下，还有较高的胶原成型率，是五个针头型号中最为合适的针头。
[0179]
表4.针头型号对胶原成型的影响
[0180][0181]
核层组分优化：
[0182]
如图19所示为2％、5％、8％、10％的直径测试，依次为：0.590mm
±
0.006mm、
0.585mm
±
0.008mm、0.587mm
±
0.011mm、0.620mm
±
0.010mm。通过应力-应变曲线图计算各力学性能参数，并归纳于表5中。结果显示，5％组的断裂拉力、弹性模量以及断裂强度由于其四组，为最优配比。
[0183]
表5.内层海藻酸钠-纤维素力学拉伸性能
[0184][0185]
注：实验数据表示为平均值
±
标准偏差，n≥3
[0186]
壳核层挤出速率优化：
[0187]
由图20所示，壳核层速率为6mm/s时，由于速率较快，外层胶原明显有破裂现象，如图20中(a)圆圈所示，无法满足实验所需要求；当壳核层速率在3mm/s时，速率较为适中，壳核层材料挤出较为均匀，整体形态良好；当壳核层速率在1mm/s时，整体挤出时会因速率过慢导致回旋缠绕，影响整体壳核材料的取向性，如图20中(c)圆圈所示。速率优化实验说明，壳核层速率在3mm/s左右时，整体材料挤压速率较为适宜。
[0188]
基于上述优化结果，成功制备壳-核结构胶原纤维。如图21中(a)所示，在加入tb后，可以明显的看到中间的sa/cll纤维，很好的与壳层胶原融为一体，符合我们的制备预期。如图21中(b)、(c)所示，胶原表面纤维排列紧密，具有明显的纤维取向以及孔隙结构，从横截面观察可发现，胶原纤维内部排列疏松且连通性较好，有利于细胞的迁移及水、营养物质输运。
[0189]
以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。