利于烤烟生长及根际土壤微生物烤烟品种和肥料配施方法-j9九游会真人

1.本发明属于烤烟种植技术领域，尤其涉及一种利于烤烟生长及根际土壤微生物的烤烟品种和肥料配施方法。


背景技术：

2.目前，生物肥是指土壤富含大量有益菌，并利用这种有益菌在土壤中的生物功能，改善土壤土质，增加土地营养，从而提高农作物生长的一种施肥，包括细菌肥料和微生物菌剂。其中，细菌肥料中有复合微生物肥和生物有机肥。复合微生物肥是一种新型肥料，作用机理是将有机和无机养分与特定的功能菌相结合。生物有机肥是一种生物肥料，通过将多种有益微生物与充分分解、发酵的有机肥相结合。复合微生物肥是将特定功能菌与无机、有机营养成分相结合的新型肥料，具有有机肥营养成分全面、有机质含量高以及微生物的优点，还具有有机肥的长效、无机肥的速效以及微生物的增效作用；复合微生物肥不但可以产生更有利的微生物生长的条件，而且还可以提高化肥效率1.5～5倍。
3.生物质炭(biochar)是由生物质在全部或部分的情况下产生的氧热解碳化高度芳香耐火材料的固体材料，高的热稳定性和具有吸附性质，无环境污染的优点。经前期资料查阅发现，生物质炭能够改善土壤环境，改善土壤微生物环境，提高土壤肥力，提高肥料的利用率，且对环境友好。同时，生物质炭对土壤的改良与烟草青枯病发病情况呈现一定的相关性。目前在烟草种植生产中，生物质炭在修复植烟土壤、促进烤烟生长方面的作用已有一定研究和应用，其不但增强了烟草的抗性，且符合环境友好、烟草生产的发展方向。
4.烟草是云南省乃至整个国家重要的经济税收支柱，稳产增产十分必要。烟草青枯病是一种世界性流行的土传病害，在烟草生长中经常发生，其病原的侵染具有多样性和复合性，是威胁世界烟草生产的一大毁灭性病害。在中国南方烟区常年发生，造成严重损失，近年来病害发生趋势逐步扩大，云南烟区危害较为严重。因此了解云南烟草青枯病的发病情况，并通过研究生物质炭与青枯病的相关联系，利用生物质炭改良土壤，从而减少青枯病造成的经济损失，创造优质烟叶的生产有利条件，实现烟叶品质的改善，能够探索一条指导预测和综合预防、控制病害的新方向，为烟区合理施肥提供一定的理论依据。
5.为了减轻烟草青枯病造成的重大损失，目前的主要防治措施是抗病性研究、化学防治、生物防治和农业防治，抗病育种、生物药剂应用等已成为最重要的手段之一。但由于烟草病害种类繁多、发病时间长以及病原复杂多样，导致其防控效果难以控制。其中，抗病育种是一种相对经济、可行的预防措施，强调通过结合分子生物学、将抗病基因引入寄主、培育抗病性品种、利用植物与病原菌的相互作用等途径，达到有效的预防效果。但是，目前选用的抗病品种抗病性不是很好，目前生产的化学防治药物大多是为了延缓病虫害的高峰期，减少病虫害的发生，没有有效的药物来防止烟草枯萎病的发生，而化学制剂的使用很容易污染环境，产生有害物质；生物防治主要通过拮抗菌青枯菌如芽孢杆菌、xc4菌株等实现，借助减少病原性菌的总数，增加有益菌的多样化，或诱导植株的自身免疫应答青枯病，但拮抗性菌具有定植率低、成本高、防护困难等缺点。农业防治的重点是加强田间管理和预防工
作，如适当轮作、及时清除病株残体和实现农业生产工具标准化，是一项对环境友好的农业预防性技术。对于青枯病，特别是烟叶青枯病综合防控问题不易突破，亟需探索出经济、高效、环保的整体综合性安全防控路径，在农业技术方面的防控策略应当强调以预防措施为先、整体综合性安全防控，并注重于运用农业栽培方法预防措施，透过选用适宜的药物控制疾病传播，尽量减少青枯病所造成的经济损失。
6.随着巴西亚马逊河流域“黑土壤”(terra preta)的发现，生物质炭已成为人们关注的焦点聚焦到了生物质炭。近年来，过度使用肥料和不当利用肥料，导致农田土壤肥力衰退，土壤生态环境污染，也因为各种肥料和杀虫剂的不合理应用，使生态环境日益下降，开辟生物肥料的部分肥料越来越受到重视。所以，生物质炭和生物肥料是当前研究的重点，目前对生物质炭和生物肥料的研究很多，但是在生物质炭和生物肥料结合应用方面却寥寥无几。同时目前栽种的烤烟品种有很多，不同的烤烟品种的生长情况和抗病性有着差异。
7.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：长期的农事操作及人为干预，导致目前烤烟生产实际中植烟土壤质量下降，烟株对养分利用效率降低，田间病害防效有待提高，烟农生产成本不断投入，生产效益增加有所减少。因此，在目前的生产实际中，如何提高烟株对肥料利用率，增强烟株对病害的抵抗力，降低生产成本投入，增加烟农收益，稳定烟农种烟信心，是目前生产中亟待解决的问题。本项目中所采用的生物质炭及生物肥料在改善植烟土壤质量的同时，生物肥料对环境的友好也是不可忽视的优势。


技术实现要素：

8.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种利于烤烟生长及根际土壤微生物的烤烟品种和肥料配施方法。
9.本发明是这样实现的，一种利于烤烟生长及根际土壤微生物的烤烟品种和肥料配施方法，利于烤烟生长及根际土壤微生物的烤烟品种和肥料配施方法包括：确定试验地点及时间，供试土壤为红壤；确定供试生物炭、复合微生物肥以及解淀粉芽孢杆菌；选择烤烟k326和红花大金元为供试品种，并进行裂区试验设计；采集样品，并分别进行养分测定、烤烟农艺性状测定、酶活性测定、青枯病害病情测定、茄科雷尔氏菌荧光定量qpcr以及根际土壤微生物的测定；将试验数据统计采用spss 26.0进行统计分析，并采用origin 2022进行绘图。
10.进一步，利于烤烟生长及根际土壤微生物的烤烟品种和肥料配施方法包括以下步骤：
11.步骤一，确定供试生物质炭性质和微生物肥；
12.步骤二，确定供试品种并进行裂区试验设计；
13.步骤三，进行样品采集与测定；
14.步骤四，进行数据统计与分析。
15.进一步，步骤一中的供试生物质炭性质和微生物肥的确定包括：
16.生物炭ph 9.32，有机碳169.94g/kg，n 10.42g/kg，p 1.93g/kg，k33.2g/kg，c/n 16.4；复合微生物肥的有益菌有效活菌数≥2
×
107cfu/g，总养分n p2o5 k2o≥8％，有效有机质≥60％；解淀粉芽孢杆菌2
×
10
10
cfu/g。
17.进一步，步骤二中的供试品种为烤烟k326和红花大金元。
18.采用裂区试验设计，主因素为品种k326、红花大金元；副因素为肥料配施，分别为常规施肥ck、烟杆生物质炭s、烟杆生物质炭 解淀粉芽孢杆菌sj、烟杆生物质炭 复合微生物肥sf、烟杆生物质炭 解淀粉芽孢杆菌 复合微生物肥sjf，设3次重复，共30个处理；每个处理设15个盆钵，每盆用土10kg。
19.其中，常规施肥ck：无添加；烟杆生物质炭s：生物质炭100g/株；烟杆生物质炭 解淀粉芽孢杆菌sj：生物质炭100g/株 解淀粉芽孢杆菌0.5g/株；烟杆生物质炭 复合微生物肥sf：生物质炭100g/株 复合微生物肥60g/株；烟杆生物质炭 解淀粉芽孢杆菌 复合微生物肥sjf：生物质炭100g/株 复合微生物肥60g/株 解淀粉芽孢杆菌0.5g/株。k326施纯n量7g/株，红花大金元施纯n量5g/株，基追肥比例为4：6；其余管理措施依据当地优质烤烟生产规范进行，于4月底进行移栽，在移栽后47d接种茄科雷尔氏菌1
×
107cfu/ml。
20.进一步，步骤三中的样品采集与测定包括：
21.(1)养分测定
22.在移栽后84d，移栽后100d，移栽后115d，采用5点法采集土壤样品，去除植物枯落物和碎石块等，自然风干过0.25mm和0.15mm筛后保存于密封袋中，对土壤ph、土壤有机质、土壤碱解氮、土壤速效钾和土壤有效磷进行测定。
23.在移栽后47d、移栽后84d、移栽后100d和移栽后115d分别每个重复采集3株烟，将盆栽烟株根系冲洗干净后，取样后整株分别放置于105℃烘箱内杀青30min，85℃烘干至恒重；再将烟株粉碎过筛，过筛烟粉用于测定植株全氮、全磷、全钾的含量。
24.(2)烤烟农艺性状测定
25.在移栽后47d、移栽后74d、移栽后99d和移栽后115d，选取具有代表性的植株3～5株，进行农艺性状测定。
26.(3)酶活性测定
27.在移栽后47d、移栽后84d、移栽后100d和移栽后115d测定土壤酶活性。
28.1)土壤脲酶：靛酚蓝比色法；
29.2)土壤酸性磷酸酶：磷酸笨二钠比色法；
30.3)土壤蔗糖酶：硫代硫酸钠滴定法；
31.4)土壤过氧化氢酶：高锰酸钾滴定法。
32.在移栽后84d，移栽后100d，移栽后122d测定植株酶活性。
33.1)mda：硫代巴比妥酸比色法；
34.2)pod：愈创木酚法。
35.(4)青枯病害病情测定
36.不同施肥处理在烟株移栽后74d，每隔14d记录一次发病情况，移栽后88d和102d，共3次，计算病害的发病率、病情指数以及防治效果。
37.按照下列公式计算：
38.发病率(％)＝(发病株数/总株数)
×
100；
39.病情指数＝∑[病级数
×
该级病株(叶)数]/最高病级数
×
调查总株(叶)数
×
100；
[0040]
防治效果＝[(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数]
×
100％。
[0041]
(5)茄科雷尔氏菌荧光定量qpcr
[0042]
在移栽后115d取土样于液氮中，用于测定茄科雷尔氏菌荧光定量。
[0043]
1)dna提取：选用土壤dna提取试剂盒凯杰dneasy powersoil kit 10012888-100提取dna，按照试剂盒说明书进行操作，dna冷冻保存于-20℃；
[0044]
2)荧光定量qpcr标准曲线的建立：以无菌水10倍梯度稀释的标准品为模板，以各梯度稀释质粒拷贝数的对数值为横坐标，各梯度稀释质粒所对应的仪器读数ct为纵坐标，制作标准曲线；
[0045]
3)荧光定量上机检测：提取的dna样品适量稀释后作为qpcr模板，以擎科2
×
t5 fast qpcr mix sybr green i进行扩增；其中，荧光定量qpcr反应体系为：2
×
t5 fast qpcr mix sybr green i 10μl，10μm primer f 1μl，10μm primerf 1μl，template gdna 1μl，ddh2o 7μl，共计20μl。
[0046]
(6)根际土壤微生物的测定
[0047]
在移栽后115d取土样于液氮中，用于测定土壤微生物多样性16srrna。
[0048]
使用试剂盒soil dna kit提取微生物群落总dna，完成基因组dna抽提后，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组dna，使用nanodrop2000测定dna浓度和纯度。
[0049]
使用338f：actcctacgggaggcagcag和806r：ggactachvgggtwtctaat对16srrna基因v3～v4区进行pcr扩增。
[0050]
将同一样本的pcr产物混合后，使用2％琼脂糖凝胶回收pcr产物；使用试剂盒axyprep dna gel extraction kit进行回收产物纯化，2％琼脂糖凝胶电泳检测，用quantifluor
tm-st对回收产物进行检测、定量。
[0051]
使用nextflex rapid dna-seq kit进行建库。
[0052]
进一步，步骤四中的数据统计与分析包括：试验数据统计采用microsoft excel 365，采用spss 26.0进行统计分析，采用origin 2022进行绘图。
[0053]
结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
[0054]
第一，烟草是我国重要的经济作物，生物质炭和生物肥料目前广泛用于农业生产。为探明添加生物质炭及生物肥料对烤烟生长及根际土壤微生物的影响，本发明以云南主栽烤烟品种为主要研究对象，以品种和肥料配施为两个因素，进行裂区试验设计，主因素为品种，即k326和红花大金元；副因素是肥料配施，设有常规施肥(ck)、添加生物质炭(s)、添加生物质炭和解淀粉芽孢杆菌(sj)、添加生物质炭和复合微生物肥(sf)和添加生物质炭、解淀粉芽孢杆菌和复合微生物肥，共10个处理，3次重复。以此来探究品种、肥料配施对烤烟生长发育以及根际土壤微生物的影响。本发明的主要结果如下：
[0055]
(1)在整个烟株生长过程中，不同烤烟品种在肥料配施条件下差异显著。对于k326品种而言，sf对其主要生育期下各项农艺性状的指标均显著优于其他处理。对于红花大金元而言，不同肥料配施对红花大金元的株高、茎围、节距和最大叶面积有着不同程度的促进作用，sj可以显著提高节距，sf则可以显著提高最大叶面积。
[0056]
(2)通过对烤烟主要生育期下植烟土壤养分含量的分析测定结果可以看出，就k326品种而言，添加了生物质炭和复合微生物肥(sf)处理下的植烟土壤有机质、土壤碱解氮、土壤速效钾和土壤有效磷含量均显著优于其他处理。对于红花大金元而言，sf和sjf下的土壤有机质、土壤碱解氮、土壤速效钾和土壤有效磷含量均显著优于其他处理。
[0057]
(3)在整个烟株生长过程中，对于k326品种而言，sf处理能够显著提高土壤脲酶和土壤蔗糖酶活性。对于红花大金元而言，sf和sjf处理能够显著提高土壤脲酶和土壤酸性磷酸酶活性。
[0058]
(4)在整个烟株生长过程中，对于k326品种而言，s和sf处理能够显著提高植株养分含量。对于红花大金元而言，sj、sf处理能够显著提高植株养分含量，sjf处理能够显著提高植株全氮和全钾含量。
[0059]
(5)在整个烟株生长过程中，对于k326品种而言，sjf处理能够在显著提高pod活性的同时显著降低mda含量。对于红花大金元而言，s处理能够在显著提高pod活性的同时显著降低mda含量。
[0060]
(6)在整个烟株生长过程中，对于k326品种而言，肥料配施对其青枯病害影响不显著。对于红花大金元而言，sj处理的病情指数最低，防治效果最好，同时s、sf和sjf也有较好的防治效果。
[0061]
(7)通过对不同时期各个指标相关性分析发现，在移栽后84d，土壤有机质、土壤碱解氮、土壤有效磷、土壤速效钾和土壤脲酶活性、土壤酸性磷酸酶活性之间呈显著或极显著正相关，在移栽后115d，土壤ph和土壤脲酶活性、土壤蔗糖酶活性之间呈显著或极显著负相关，土壤有机质、土壤碱解氮、土壤有效磷、土壤速效钾和土壤脲酶活性、土壤蔗糖酶活性、土壤过氧化氢酶活性之际呈显著或极显著正相关。
[0062]
(8)通过对根际土壤微生物的分析，添加生物质炭和复合微生物肥均能提高k326和红花大金元的土壤细菌物种丰富度和均匀度；其中对于k326，添加生物质炭和复合微生物肥能够显著降低actinobacteriota(放线菌门)和gemmatimonadota(芽单胞菌门)丰度，显著提高bacteroidota(拟杆菌门)和firmicutes(厚壁菌门)丰度；对于红花大金元添加生物质炭和解淀粉芽孢杆菌或添加生物质炭和复合微生物肥能够显著降低proteobacteria(变形菌门)丰度，显著提高firmicutes(厚壁菌门)丰度。
[0063]
综上所述，对于k326和红花大金元两个品种而言，sf处理下，有利于提升烟株农艺性状、土壤理化性质、植株养分含量、土壤酶活性以及植株酶活性，同时改善土壤微生物环境，适宜烟株整体生长。
[0064]
第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
[0065]
本发明在目前生产施肥的基础上，将生物质碳与生物肥料配施，对不同种类烤烟生长发育和根际土壤微生物状况加以探讨，通过添加生物质碳与生物肥料，在改善烟株生长发育的同时，防止烟草青枯病的发生，营造绿色烟草生产环境，并为今后的烤烟生产提供理论依据。
[0066]
第三，本发明的技术方案是否克服了技术偏见：
[0067]
本发明的目的是针对现有生产中单一重视肥料施用的技术偏见，提供一种复合施肥的技术。长期以来，烟草种植户始终将肥料的施用量作为决定烤烟产值量及后期生产收益的主要因素加以考虑，这大大影响了优质烤烟生产。单一的施肥技术，在一定程度上，虽然对烤烟产量产值没有明显负面效应，但长期的肥料施用，使得植烟土壤质量下降，田间病害加重，导致烤烟生产过程中生产成本增加。本发明通过生物质碳与肥料配施，在改善植烟土壤质量的同时，减少田间青枯病害发生，降低农药的投入量，对烤烟生产成本有所控制的
同时，也为营造环境友好烤烟生产环境提供一定的理论依据。
附图说明
[0068]
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0069]
图1是本发明实施例提供的利于烤烟生长及根际土壤微生物的烤烟肥料配施方法流程图；
[0070]
图2是本发明实施例提供的品种与肥料配施对烤烟不同时期农艺性状的影响示意图；
[0071]
图3是本发明实施例提供的不同品种和肥料配施对烤烟不同时期植烟土壤ph的影响示意图；
[0072]
图4是本发明实施例提供的不同品种和肥料配施对烤烟不同时期植烟土壤有机质含量的影响示意图；
[0073]
图5是本发明实施例提供的不同品种和肥料配施对烤烟不同时期土壤碱解氮含量的影响示意图；
[0074]
图6是本发明实施例提供的不同品种和肥料配施对烤烟不同时期土壤有效磷含量的影响示意图；
[0075]
图7是本发明实施例提供的不同品种和肥料配施对烤烟不同时期土壤速效钾含量的影响示意图；
[0076]
图8是本发明实施例提供的不同品种和肥料配施对烤烟不同时期土壤脲酶活性的影响示意图；
[0077]
图9是本发明实施例提供的不同品种和肥料配施对烤烟不同时期土壤蔗糖酶活性的影响示意图；
[0078]
图10是本发明实施例提供的不同品种和肥料配施对烤烟不同时期土壤酸性磷酸酶活性的影响示意图；
[0079]
图11是本发明实施例提供的不同品种和肥料配施对烤烟不同时期土壤过氧化氢酶活性的影响示意图；
[0080]
图12是本发明实施例提供的不同品种与肥料配施对烤烟不同时期植株养分含量的影响示意图；
[0081]
图13是本发明实施例提供的不同品种与肥料配施对烤烟不同时期烟叶膜脂过氧化相关保护酶的影响示意图；
[0082]
图14是本发明实施例提供的青枯菌荧光定量qpcr标准曲线、扩增谱图及溶解曲线图；
[0083]
图15是本发明实施例提供的rosl基因拷贝数示意图；
[0084]
图16是本发明实施例提供的根际土壤细菌群落组成图；
[0085]
图17是本发明实施例提供的根际土壤细菌群落门水平上的群落heatmap图；
[0086]
图18是本发明实施例提供的根际土壤细菌群落之间在门水平上的组间差异显著
性分析示意图；
[0087]
图19是本发明实施例提供的根际土壤微生物细菌群落差异的主坐标分析图；
[0088]
图20是本发明实施例提供的根际土壤微生物细菌群落与土壤养分关联分析示意图；
[0089]
图21是本发明实施例提供的根际土壤微生物细菌群落与土壤酶活性关联分析示意图。
具体实施方式
[0090]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0091]
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种利于烤烟生长及根际土壤微生物的烤烟品种和肥料配施方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
[0092]
如图1所示，本发明实施例提供的利于烤烟生长及根际土壤微生物的烤烟品种和肥料配施方法包括以下步骤：
[0093]
s101，确定试验地点及时间；确定供试生物质炭性质和微生物肥；选择烤烟k326和红花大金元为供试品种，并进行裂区试验设计；
[0094]
s102，采集样品并进行养分测定、烤烟农艺性状测定、酶活性测定、青枯病害病情测定、茄科雷尔氏菌荧光定量qpcr以及根际土壤微生物测定；
[0095]
s103，数据统计与分析：试验数据统计采用microsoft excel 365，采用spss 26.0进行统计分析，采用origin 2022进行绘图。
[0096]
本发明实施例提供的生物炭(ph 9.32，有机碳169.94g/kg，n 10.42g/kg，p 1.93g/kg，k 33.2g/kg，c/n 16.4)由安徽拜尔福生物科技公司提供，复合微生物肥(有益菌有效活菌数≥2
×
107cfu/g，总养分n p2o5 k2o≥8％，有效有机质≥60％)、解淀粉芽孢杆菌(2
×
10
10
cfu/g)由广东博沃特生物技术有限公司提供。
[0097]
本发明实施例提供的试验为裂区试验设计，主因素为品种，即：k326、红花大金元；副因素为肥料配施，分别为常规施肥(ck)、烟杆生物质炭(s)、烟杆生物质炭 解淀粉芽孢杆菌(sj)、烟杆生物质炭 复合微生物肥(sf)、烟杆生物质炭 解淀粉芽孢杆菌 复合微生物肥(sjf)，设3次重复，共30个处理。每个处理设15个盆钵，每盆用土10kg。
[0098]
常规施肥(ck)：无添加；
[0099]
烟杆生物质炭(s)：生物质炭(100g/株)；
[0100]
烟杆生物质炭 解淀粉芽孢杆菌(sj)：生物质炭(100g/株) 解淀粉芽孢杆菌(0.5g/株)；
[0101]
烟杆生物质炭 复合微生物肥(sf)：生物质炭(100g/株) 复合微生物肥(60g/株)；
[0102]
烟杆生物质炭 解淀粉芽孢杆菌 复合微生物肥(sjf)：生物质炭(100g/株) 复合微生物肥(60g/株) 解淀粉芽孢杆菌(0.5g/株)。
[0103]
k326施纯n量7g/株，红花大金元施纯n量5g/株，基追肥比例为4:6。其余管理措施依据当地优质烤烟生产规范进行，于2021年4月30日进行移栽，在移栽后47d接种茄科雷尔氏菌(1
×
107cfu/ml)，茄科雷尔氏菌由云南农业大学细菌实验室提供。
cycle)为纵坐标，制作标准曲线；
[0131]
3)荧光定量上机检测：提取的dna样品适量稀释后作为qpcr模板，以擎科2
×
t5 fast qpcr mix(sybr green i)进行扩增；其中，荧光定量qpcr反应体系为：2
×
t5 fast qpcr mix sybr green i 10μl，10μm primer f 1μl，10μm primer f 1μl，template gdna 1μl，ddh2o 7μl，共计20μl。
[0132]
(6)根际土壤微生物的测定
[0133]
在移栽后115d取土样于液氮中，用于测定土壤微生物多样性16srrna。
[0134]
使用试剂盒soil dna kit(omega bio-tek，norcross，ga，u.s.)提取微生物群落总dna，完成基因组dna抽提后，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组dna，使用nanodrop2000测定dna浓度和纯度。
[0135]
使用338f(actcctacgggaggcagcag)
[0136]
806r(ggactachvgggtwtctaat)
[0137]
对16srrna基因v3～v4区进行pcr扩增。
[0138]
将同一样本的pcr产物混合后，使用2％琼脂糖凝胶回收pcr产物，使用试剂盒axyprep dna gel extraction kit(axygen biosciences，union city，ca，usa)进行回收产物纯化，2％琼脂糖凝胶电泳检测，用quantifluor
tm-st(promega，usa)对回收产物进行检测、定量。
[0139]
使用nextflex rapid dna-seq kit进行建库。
[0140]
测序工作由上海美吉生物医药科技有限公司使用illumina公司的miseqpe300平台完成。
[0141]
二、应用实施例。为了证明本发明的技术方案的创造性和技术价值，该部分是对权利要求技术方案进行具体产品上或相关技术上的应用实施例。
[0142]
本发明在云南省楚雄彝族自治州楚雄市子午镇以当地常规种植品种红花大金元及烤烟k326为研究对象，采用裂区试验设计，主因素为品种，副因素为肥料配施，进行生物质炭和生物肥料配施田间试验，以期探究品种、肥料配施对烤烟生长发育以及根际土壤微生物的影响。
[0143]
本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。
[0144]
1、材料和方法
[0145]
1.1试验地点及时间
[0146]
表1基础土壤养分含量
[0147][0148]
于2021年4月～10月在云南省楚雄市子午镇进行盆栽试验，供试土壤为红壤，其基本养分情况见表1。
[0149]
2.2供试生物质炭性质和微生物肥
[0150]
生物炭(ph 9.32，有机碳169.94g/kg，n 10.42g/kg，p 1.93g/kg，k33.2g/kg，c/n 16.4)由安徽拜尔福生物科技公司提供，复合微生物肥(有益菌有效活菌数≥2
×
107cfu/g，总养分n p2o5 k2o≥8％，有效有机质≥60％)、解淀粉芽孢杆菌(2
×
10
10
cfu/g)由广东博沃特生物技术有限公司提供。
[0151]
1.3供试品种
[0152]
供试品种为烤烟k326和红花大金元。
[0153]
1.4试验设计
[0154]
本试验为裂区试验设计，主因素为品种，即：k326、红花大金元；副因素为肥料配施，分别为常规施肥(ck)、烟杆生物质炭(s)、烟杆生物质炭 解淀粉芽孢杆菌(sj)、烟杆生物质炭 复合微生物肥(sf)、烟杆生物质炭 解淀粉芽孢杆菌 复合微生物肥(sjf)，设3次重复，共30个处理。每个处理设15个盆钵，每盆用土10kg。
[0155]
常规施肥(ck)：无添加；
[0156]
烟杆生物质炭(s)：生物质炭(100g/株)；
[0157]
烟杆生物质炭 解淀粉芽孢杆菌(sj)：生物质炭(100g/株) 解淀粉芽孢杆菌(0.5g/株)；
[0158]
烟杆生物质炭 复合微生物肥(sf)：生物质炭(100g/株) 复合微生物肥(60g/株)；
[0159]
烟杆生物质炭 解淀粉芽孢杆菌 复合微生物肥(sjf)：生物质炭(100g/株) 复合微生物肥(60g/株) 解淀粉芽孢杆菌(0.5g/株)。
[0160]
k326施纯n量7g/株，红花大金元施纯n量5g/株，基追肥比例为4:6。其余管理措施依据当地优质烤烟生产规范进行，于2021年4月30日进行移栽，在移栽后47d接种茄科雷尔氏菌(1
×
107cfu/ml)，茄科雷尔氏菌由云南农业大学细菌实验室提供。
[0161]
1.5样品采集与测定
[0162]
1.5.1养分测定
[0163]
在移栽后84d，移栽后100d，移栽后115d，采用5点法采集土壤样品，去除植物枯落物和碎石块等，自然风干过0.25mm和0.15mm筛后保存于密封袋中，对土壤ph、土壤有机质、土壤碱解氮、土壤速效钾和土壤有效磷进行测定，测定方法参照《土壤农化分析》鲍士旦进行。
[0164]
在移栽后47d、移栽后84d、移栽后100d和移栽后115d分别每个重复采集3株烟，将盆栽烟株根系冲洗干净后，取样后整株分别放置于105℃烘箱内杀青30min，85℃烘干至恒重，再将烟株粉碎过筛，过筛烟粉用于测定植株全氮、全磷、全钾的含量，测定方法参照李春丽等进行。
[0165]
1.5.2烤烟农艺性状测定
[0166]
在移栽后47d、移栽后74d、移栽后99d和移栽后115d，选取具有代表性的植株3～5株，进行农艺性状测定，测定方法参照烟草行业标准烟草农艺性状调查测定方法(yc-t/42-2010)。
[0167]
1.5.3酶活性测定
[0168]
在移栽后47d、移栽后84d、移栽后100d和移栽后115d测定土壤酶活性。
[0169]
(1)土壤脲酶：靛酚蓝比色法；
[0170]
(2)土壤酸性磷酸酶：磷酸笨二钠比色法；
[0171]
(3)土壤蔗糖酶：硫代硫酸钠滴定法；
[0172]
(4)土壤过氧化氢酶：高锰酸钾滴定法。
[0173]
测定方法参照《土壤酶及其研究法》关松荫进行。
[0174]
在移栽后84d，移栽后100d，移栽后122d测定植株酶活性。
[0175]
(1)mda：硫代巴比妥酸比色法；
[0176]
(2)pod：愈创木酚法。
[0177]
测定方法参照《植物生理生化实验原理和技术》李合生进行。
[0178]
1.5.4青枯病害病情测定
[0179]
不同施肥处理在烟株移栽后74d，之后每隔14d记录一次发病情况，即移栽后88d和102d，共3次，计算病害的发病率、病情指数以及防治效果。病情指数的分级调查按照《gb/t23222-2008烟草病虫害分级及调查方法》进行。
[0180]
按照下列公式计算：
[0181]
发病率(％)＝(发病株数/总株数)
×
100；
[0182]
病情指数＝∑[病级数
×
该级病株(叶)数]/最高病级数
×
调查总株(叶)数
×
100；
[0183]
防治效果＝[(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数]
×
100％。
[0184]
1.5.5茄科雷尔氏菌荧光定量qpcr
[0185]
在移栽后115d取土样于液氮中，用于测定茄科雷尔氏菌荧光定量。
[0186]
(1)dna提取：选用土壤dna提取试剂盒凯杰dneasy powersoil kit(100)12888-100提取dna，按照试剂盒说明书进行操作，dna冷冻保存于-20℃；
[0187]
(2)荧光定量qpcr标准曲线的建立：以无菌水10倍梯度稀释的标准品为模板，以各梯度稀释质粒拷贝数的对数值为横坐标，各梯度稀释质粒所对应的仪器读数ct(threshold cycle)为纵坐标，制作标准曲线；
[0188]
(3)荧光定量上机检测：提取的dna样品适量稀释后作为qpcr模板，以擎科2
×
t5 fast qpcr mix(sybr green i)进行扩增，扩增体系各组分如表2。
[0189]
表2荧光定量qpcr反应体系
[0190][0191]
1.5.6根际土壤微生物的测定
[0192]
在移栽后115d取土样于液氮中，用于测定土壤微生物多样性16srrna。
[0193]
使用试剂盒soil dna kit(omega bio-tek，norcross，ga，u.s.)提取微生物群落总dna，完成基因组dna抽提后，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组dna，使用nanodrop2000测定dna浓度和纯度。
[0194]
使用338f(actcctacgggaggcagcag)
[0195]
806r(ggactachvgggtwtctaat)
[0196]
对16srrna基因v3～v4区进行pcr扩增。
[0197]
将同一样本的pcr产物混合后，使用2％琼脂糖凝胶回收pcr产物，使用试剂盒axyprep dna gel extraction kit(axygen biosciences，union city，ca，usa)进行回收产物纯化，2％琼脂糖凝胶电泳检测，用quantifluor
tm-st(promega，usa)对回收产物进行检测、定量。
[0198]
使用nextflex rapid dna-seq kit进行建库。
[0199]
测序工作由上海美吉生物医药科技有限公司使用illumina公司的miseqpe300平台完成。
[0200]
1.6数据统计与分析
[0201]
试验数据统计采用microsoft excel 365，采用spss 26.0进行统计分析，采用origin 2022进行绘图。
[0202]
2、结果与分析
[0203]
2.1品种、肥料配施对烤烟主要生育期农艺性状的影响
[0204]
图2是不同烤烟品种在不同肥料配施下对烟株主要生育期农艺性状的影响。从图中可以看出，不同肥料配施对不同烤烟品种的影响不同。对于烤烟k326品种而言，肥料配施对烟株株高的影响主要集中在移栽后47d和74d，而在烟株生育后期的影响不显著。如在移栽后47d，ck下的株高比sj处理下的株高显著提高了39％，但ck和sf之间在株高上的差异不显著。对于茎围而言，主要影响在移栽后47d、74d和115d，其中115d，sf下的茎围显著高于其他处理。在对于节距和最大叶面积而言，都具有显著影响。从图2中可以看出，sf对k326主要生育期下各项农艺性状的指标显著优于其他处理。
[0205]
对于红花大金元来说，肥料配施对烟株株高的影响一直持续到烤烟收获前。肥料配施对烟株茎围、节距和最大叶面积的影响一直持续到烤烟收获前。在移栽后47d，ck下的株高比sf处理下显著提高了84％，但s、sj和sjf之间在株高上的差异不显著。对于茎围而言，在移栽后47d，s下的茎围显著高于其他处理，比sf显著提高了27％。对于节距而言，在移栽后99d和115d，sj下的节距显著高于其他处理，其中115d，sj下的节距比s处理显著提高了18％。对于最大叶面积而言，在移栽后47d和74d，s和sj下的最大叶面积显著高于其他处理，在移栽后115d，sf下的最大叶面积显著高于其他处理，比sjf处理显著提高了49％。在添加了生物质炭和生物肥料后对红花大金元的株高、茎围、节距和最大叶面积有着不同程度的促进作用。
[0206]
表3是不同品种和不同肥料配施之间的交互作用对烤烟主要生育期农艺性状的影响。从表中可以看出，除在移栽后47d的茎围和移栽后74d的最大叶面
[0207][0208]
理的茎围均大于k326。对于节距而言，在移栽后47d，k326品种的ck下的节距显著高于其他处理，同时k326所有处理的节距均大于红花大金元，在移栽后74d，红花大金元品
种的s、sj处理显著高于k326各处理，在移栽后99d和115d，红花大金元品种的sj处理显著高于k326各处理。对于最大叶面积这一农艺性状指标而言，在移栽后99d和115d，红花大金元品种的ck、sf处理显著高于k326各处理。
[0209]
2.2品种、肥料配施对烤烟不同时期植烟土壤养分的影响
[0210]
2.2.1品种和肥料配施对烤烟不同生育期植烟土壤ph的影响
[0211]
大量的试验结果表明，青枯病易发于偏酸性土壤中。图3是不同品种和肥料配施对烤烟主要生育期下植烟土壤酸碱度的影响。由图3可知，肥料配施后对烤烟k326根际土壤ph值的影响主要集中在移栽后100d，在移栽后100d时，sj处理下植烟土壤ph值显著高于sjf处理，但与其他处理差异不显著。对于红花大金元来说，不同肥料配施处理对移栽后84d和移栽后100d下植烟土壤ph值有显著影响，如在移栽100d时，sj、sf、sjf处理下土壤ph值显著高于与s和ck处理下土壤ph值。
[0212]
2.2.2品种和肥料配施对烤烟不同生育期植烟土壤有机质含量的影响
[0213]
土壤有机质是土壤中除土壤矿物质以外的物质，是土壤中最活跃的部分，是土壤肥力的基础，是衡量土壤肥力的重要指标之一。由图4可知，对于k326品种而言，在移栽后84d，sjf下的土壤有机质含量显著高于其他处理，比ck处理显著提高了28％，在移栽后100d，sf下的土壤有机质含量显著高于ck和sj处理。对于红花大金元而言，移栽后84d，sf下的土壤有机质含量显著高于其他处理，比sj处理显著提高了63％，在移栽后100d，sjf下的土壤有机质含量显著高于ck、s和sf处理，在移栽后115d，sj、sf和sjf下的土壤有机质含量显著高于ck和s处理。
[0214]
2.2.3品种和肥料配施对烤烟不同时期土壤碱解氮含量的影响
[0215]
土壤碱解氮包含有无机态氮和结构简单能直接为作物吸收利用的有机态氮等，在土壤中的含量不稳定，容易受到土壤水热条件和生物活动的影响而引起含量的变化，但它能够较灵敏地反映土壤氮素动态和供氮水平，是土壤氮素肥力的重要指标。由图5可知，对于k326品种而言，移栽后84d，s处理的土壤碱解氮含量最高，显著高于ck、sf和sjf处理，在移栽后100d，sf和sjf下的土壤碱解氮含量显著高于ck和sj处理。对于红花大金元而言，在移栽后84d，sf下的土壤碱解氮含量显著高于其他处理，比ck处理显著提高了114％，在移栽后115d，sjf下的土壤碱解氮含量显著高于ck和s处理。
[0216]
2.2.4品种和肥料配施对烤烟不同时期土壤有效磷含量的影响
[0217]
磷是土壤元素的重要组成部分，也是植物生长的必需元素之一。由图6可知，对于k326品种而言，在移栽后84d，s下的土壤有效磷含量显著高于其他处理，比ck处理显著提高了27％，在移栽后100d，sjf下的土壤有效磷含量显著高于其他处理，比sj处理显著提高了61％，在移栽后115d，sf下的土壤有效磷含量显著高于其他处理，比sj处理显著提高了90％。对于红花大金元而言，在移栽后84d，sj下的土壤有效磷含量显著高于其他处理，比s处理显著提高了98％，在移栽后115d，sf和sjf下的土壤有效磷含量显著高于其他处理，sjf比s处理显著提高了176％，表明单纯的添加生物质炭对于提高土壤有效磷含量效果并不显著。
[0218]
2.2.5品种和肥料配施对烤烟不同时期土壤速效钾含量的影响
[0219]
钾是植物生长的必需元素之一，是衡量土壤肥力的重要指标，速效钾可以被植物体直接吸收利用，其含量的高低能直接地反映植物对土壤养分的吸收利用情况，同时钾是
烤烟重要的品质营养元素，适量的钾可以有效提升烤烟品质。由图7可知，对于k326品种而言，在移栽后84d，s和sj下的土壤速效钾显著高于其他处理，sj比ck处理显著提高了37％，在移栽后100d，sjf下的土壤速效钾含量显著高于其他处理，比sj处理显著提高了42％，在移栽后115d，sf下的土壤速效钾含量显著高于ck、sj和sjf处理，比sj处理显著高
[0220]
[0221]
红花大金元
×
sf下的土壤有机质和土壤有效磷含量显著高于其他处理。在移栽后100d，k326
×
sf、sjf下的土壤有机质含量显著高于其他处理。在移栽后115d，k326
×
sf下的土壤有效磷含量显著高于其他处理。表明在当地常规施肥条件下，添加适当的生物质及其复合生物肥对于改善烤烟主要生育期下植烟土壤养分及酸碱度有一定提高的作用。
[0222]
2.3品种、肥料配施对烤烟不同时期土壤酶活性的影响
[0223]
2.3.1品种和肥料配施对烤烟不同时期土壤脲酶活性的影响
[0224]
脲酶是参与土壤氮素循环的重要的水解酶，其主要功能是催化土壤中尿素的水解，可表征土壤氮素供应强度。由图8可知，对于k326品种而言，在移栽后47d，s、sj、sf和sjf下的土壤脲酶活性显著高于ck处理，但s、sj、sf和sjf处理之间无显著差异，在移栽后84d，sj、sf和sjf下的土壤脲酶活性显著高于其他处理，sj、sf和sjf处理间无显著差异，在移栽后100d，ck、sf、sjf下的土壤脲酶活性显著高于其他处理，在115d，sf下的土壤脲酶活性显著高于其他处理，比sj处理显著高了43％，sjf下的土壤脲酶活性显著高于ck、s和sj处理，比sj处理显著高了35％。对于红花大金元而言，在移栽后84d，sf下的土壤脲酶活性显著高于其他处理，sjf下的土壤脲酶活性显著高于ck、s和sj处理，在移栽后100d，sjf下的土壤脲酶活性显著高于其他处理，比ck显著高了128％，sf下的土壤脲酶活性显著高于ck、s和sj处理，比ck显著高了100％，sj处理显著高于ck和s处理，在移栽后115天，sjf下的土壤脲酶活性显著高于其他处理，比ck显著高了64％，sf下的土壤脲酶活性显著高于ck、s和sj处理，比ck显著高了30％，sj处理显著高于ck和s处理。综上所述，可以看出在当地常规施肥条件下单纯施用生物质炭对提高土壤脲酶活性作用不大。
[0225]
2.3.2品种和肥料配施对烤烟不同时期土壤蔗糖酶活性的影响
[0226]
蔗糖酶能促进糖类的水解，将土壤中的蔗糖水解为葡萄糖和果糖，为土壤中的生物体提供能源，加速土壤碳素循环，其活性可以反映微生物对土壤中易溶性物质的利用程度，及土壤有机质积累和转化的状况。由图9可知，对于k326品种而言，在移栽后47d，sf下的土壤蔗糖酶活性显著高于其他处理，在移栽后84d，sf下的土壤蔗糖酶活性显著高于其他处理，比ck显著提高了97％，在移栽后100d，s和sf下的土壤蔗糖酶活性显著高于其他处理，sf比ck显著提高了45％。对于红花大金元而言，在移栽后47d，ck下的土壤蔗糖酶活性显著高于其他处理，在移栽后84d，cjf下的土壤蔗糖酶活性显著高于s和sj处理，在移栽后100d，sjf下的土壤蔗糖酶活性显著高于其他处理，比s显著高了245％，ck下的土壤蔗糖酶活性显著高于s、sj和sf处理，比s显著高了169％，在移栽后115d，sjf下的土壤蔗糖酶活性显著高于其他处理，比s显著高了450％。
[0227]
2.3.3品种和肥料配施对烤烟不同时期土壤酸性磷酸酶活性的影响
[0228]
土壤磷酸酶是一类催化土壤有机磷化合物矿化成无机磷的酶，其活性高低直接影响着土壤中有机磷的分解转化及其生物有效性，磷酸酶活性是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。由图10可知，对于k326品种而言，在移栽后84d，sj下的土壤酸性磷酸酶活性显著高于其他处理，比ck显著高了37％，sf下的土壤酸性磷酸酶活性显著高于ck、s和sjf处理，比ck显著高了23％，在移栽后100d，ck下的土壤酸性磷酸酶活性显著高于其他处理，比s显著高了100％，sf下的土壤酸性磷酸酶活性显著高于s、sj和sjf处理，比s显著高了43％。对于红花大金元而言，在移栽后47d，ck和sj下的土壤酸性磷酸酶活性显著高于其他处理，在移栽后84d，sjf下的土壤酸性磷酸酶活性显著高于其他处理，比sj显著高了37％，sf下的
土壤酸性磷酸酶活性显著高于ck、s和sj处理，比sj显著高了29％，s下的土壤酸性磷酸酶活性显著高于ck和sj处理，在移栽后100d，sf下的土壤酸性磷酸酶活性显著高于其他处理，比s显著高了76％，sj和sjf下的土壤酸性磷酸酶活性显著高于ck和s处理，ck下的土壤酸性磷酸酶活性显著高于s处理，在移栽后115d，sf下的土壤酸性磷酸酶活性显著高于其他处理，比sjf显著高了40％，s和sj下的土壤酸性磷酸酶活性显著高于ck和sjf处理。
[0229]
2.3.4品种和肥料配施对烤烟不同时期土壤过氧化氢酶活性的影响
[0230]
过氧化氢酶是土壤中的一种氧化还原酶，其主要作用是分解土壤中的过氧化氢，是土壤新陈代谢水平和有机质积累程度的重要表征。由图11可知，对于k326品种而言，在移栽后47d，sjf下的土壤过氧化氢酶活性显著高于ck和s处理，在移栽后84d，ck下的土壤过氧化氢酶活性显著高于其他处理，比sf显著高了89％，在移栽后100d，s下的土壤过氧化氢酶活性显著高于ck、sj和sf处理，但与sjf处理差异不显著，在移栽后115d，sjf下的土壤过氧化氢酶显著高于其他处理，比ck显著高了22％，sf下的土壤过氧化氢酶活性显著高于ck、s和sj处理，s下的土壤过氧化氢酶活性显著高于ck和sj处理。对于红花大金元而言，在移栽后47d，sf下的土壤过氧化氢酶活性显著高于ck和s处理，与sj和sjf差异不显著，在移栽后84d，sjf下的土壤过氧化氢酶活性显著高于其他处理，比sj显著高了147％，ck和sf下的土壤过氧化氢酶活性显著高于s和sj处理，在移栽后100d和115d，sjf下的土壤过氧化氢酶活性显著高于其他处理，sj下的土壤过氧化氢酶活性显著高于ck、s和sf处理。
[0231]
表5是不同品种和肥料配施之间的交互作用对烤烟不同时期土壤酶活性的影响。从表5可以看出，除了移栽后47d下的土壤脲酶和土壤过氧化氢酶活性，品种和肥料配施之间的交互作用对烤烟不同时期土壤酶活性均有显著性影响。如在移栽后84d，k326
×
sf下的土壤蔗糖酶活性显著高于其他处理，k326
×
sj下的土壤酸性磷酸酶活性显著高于其他处理，在移栽后115d，k326
×
sf下的土壤脲酶活性显著高于其他处理，k326
×
sjf下的土壤过氧化氢酶活性显著高于其他处理。
[0232][0233]
下的植株全氮含量显著高于ck、sf和sjf处理，在移栽后115d，ck和sj下的植株全氮含量显著高于其他处理。在植株全磷方面，在移栽后47d和100d，s下的植株全磷含量显著
高于其他处理。在植株全钾方面，在移栽后84d和100d，s下的植株全钾含量显著高于其他处理。由图不难看出，在k326品种各项植株养分指标下，在移栽后100d，s下的养分含量显著高于其他处理，且各项指标在移栽后84d、100d和115d的变化趋势相类似。
[0234]
表6不同品种和肥料配施之间的交互作用对烤烟不同时期植株养分含量的影响
[0235][0236]
对于红花大金元而言，在植株全氮方面，在移栽后84d，sj下的植株全氮含量显著高于其他处理，比s显著提高了49％，在移栽后115d，s下的植株全氮含量显著高于其他处理。在植株全磷方面，在移栽后84d，sj和sf下的植株全磷含量显著高于其他处理，sf比s处理显著提高了131％。在植株全钾方面，在移栽后84d，sjf下的植株全钾含量显著高于其他处理，比s显著提高了49％。由图可以看出，在红花大金元各项植株养分指标下，在移栽后84d和100d，s下的养分含量显著低于其他处理。
[0237]
表6是不同品种和肥料配施之间的交互作用对烤烟不同时期植株养分含量的影响。由表可以看出，品种和肥料配施之间的交互作用对各时期的植株养分含量均具有显著影响。在移栽后47d，k326
×
sf下的植株全氮和全钾含量显著高于其他处理，在移栽后115d，红花大金元
×
s下的植株全氮显著高于其他处理，红花大金元
×
sjf下的植株全钾显著高于其他处理。
[0238]
2.5品种、肥料配施对烤烟不同时期烟叶膜脂过氧化相关保护酶的影响
[0239]
当烟株受到胁迫时，过氧离子和过氧化氢等会启动膜脂过氧化作用，从而破坏膜结构。丙二醛(mda)的含量是细胞膜脂过氧化的最终产物，其含量的高低间接的反映出了烟株受胁迫的程度和细胞膜结构的完整程度。过氧化物酶(pod)是构成抗氧化防御酶系统重要酶之一，起到保护活性氧的作用。由图13可知，对于k326品种而言，在pod活性方面，在移栽后100d，s下的pod活性显著妖股sf和sjf处理，在移栽后122d，sj和sjf下的pod活性显著高于其他处理。在mda活性方面，在移栽后84d，s下的mda活性显著低于其他处理，在移栽后122d，sjf下的mda活性显著低于其他处理。
[0240]
表7不同品种与肥料配施之间对烤烟不同时期烟叶膜脂过氧化相关保护酶的影响
[0241][0242]
对于红花大金元而言，在pod活性方面，在移栽后100d，ck和s下的pod活性显著高于其他处理，在移栽后122d，s下的pod活性显著高于其他处理。在mda活性方面，在移栽后100d，sf下的mda活性显著低于其他处理，在122d，s下的mda活性显著低于其他处理。
[0243]
表7是不同品种与肥料配施之间对烤烟不同时期烟叶膜脂过氧化相关保护酶的影响，除了在移栽后84d的pod活性以外，品种和肥料配施之间的交互作用对烤烟不同时期烟叶膜脂过氧化相关保护酶活性均有显著性影响。在移栽后100d，红花大金元
×
ck和s下的pod活性显著高于其他处理，红花大金元
×
ck、s、sj和sjf下的mda活性显著高于其他处理。
[0244]
2.6品种、肥料配施对青枯病害的影响
[0245]
2.6.1不同品种和肥料配施对青枯病害发生的影响
[0246]
表8不同品种和肥料配施对青枯病害病情指数和相对防治效果的影响
[0247][0248]
表8是不同品种和肥料配施对青枯病害病情指数和相对防治效果的影响。由表可以看出，就品种之间比较发现，烤烟k326在生长各时期下青枯病发病率及病情指数均显著低于红花大金元品种，这也证明了红花大金元品种相对于k326易感青枯病。就k326品种而
言，只有在移栽后74d，sjf处理下有发病情况，其他处理均无发病情况。对于红花大金元而言，在移栽后74d时，ck的病情指数显著高于添加了生物质炭(s)处理下的病情指数，但与其他三个处理差异不显著。表明在移栽后74d时添加生物质炭可降低青枯病发生的严重程度。在移栽后88d时，ck和sf处理下青枯病的病情指数显著高于其他三个处理(s、sj和sjf)，说明添加生物质炭和适宜的生物制剂可降低病害发生的严重程度。在移栽后102d下青枯病发病指数与移栽后88d时的趋势一致。综合来看，可以发现对于红花大金元来说，在移栽后74d、88d、102d下，当地常规施肥(ck)的青枯病病情指数均显著高于添加了生物质炭处理下的病情指数，说明在红花大金元移栽后适当添加生物质炭及其生物肥料能够显著降低青枯病病情指数。
[0249]
2.6.2青枯菌荧光定量qpcr标准曲线
[0250]
青枯菌荧光定量qpcr标准曲线、扩增谱图及溶解曲线如图14所示，该标准曲线r2大于0.99，为0.9989，其扩增曲线光滑平稳，溶解曲线峰值单一，说明该荧光定量pcr扩增方法稳定可靠，特异性强，符合定量检测要求。
[0251]
2.6.3不同品种和肥料配施对青枯菌在土壤中的影响
[0252]
由图15可知，对于品种k326，sjf处理下的茄科雷尔氏菌基因拷贝数显著高于其它处理，sf处理显著高于ck、s和sj处理，ck、s和sj处理间的基因拷贝数差异不显著。对于红花大金元而言，sf处理下的茄科雷尔氏菌基因拷贝数显著高于其它处理，ck处理则显著低于其它处理。
[0253]
2.7品种、肥料配施对根际土壤微生物的影响
[0254]
2.7.1根际土壤微生物alpha多样性
[0255]
本次测序所有样本共获得1252358条高质量序列，根据97％的序列相似性聚类分析，共产生5431个可操作分类单元(operational taxonomic unit，otu)。alpha多样性是指特定生境或者生态系统内的物种多样性情况。由表9可知，在细菌多样性水平上，品种k326下的s、sj和sjf处理chao指数差异不显著，表现较为稳定；红花大金元下的s、sj和sf处理chao指数差异不显著，表现较为稳定，可以说明测序结果正确可靠。coverage表示样品的otu丰度覆盖情况，10组样品中该指数均大于96％，表明测序深度足以反映真实土壤细菌群落结构，满足后续分析。chao指数能够反映样品中物种的丰富度，指数越大，说明细菌群落中含有的物种数量越多，细菌群落丰富度越大。其中对于品种k326，sf处理下的chao指数显著高于ck；对于红花大金元而言，sjf处理下的chao指数显著高于ck。shannon和simpson指数指示物种的丰富度和均匀度。shannon指数越大，说明物种丰富度越大，各物种的分配更均匀，simpson指数越小，说明物种均匀度越高。其中对于品种k326，sf处理下的shannon指数最大，simpson指数最小；对于红花大金元而言，sf处理下的shannon指数最大，simpson指数也较小，仅比sj处理大，说明sf处理物种丰富度最高，同时均匀度也最高。
[0256]
表9根际土壤细菌群落alpha多样性指数表
[0257][0258]
2.7.2根际土壤微生物细菌群落组成分析
[0259]
本次测序10组样本共产生5431个otu，由图16可知主要包括：proteobacteria(变形菌门)、actinobacteria(放线菌门)、chloroflexi(绿弯菌门)、acidobacteria(酸杆菌门)、bacteroidetes(拟杆菌门)、gemmatimonadetes(芽单胞菌门)、myxococcota(粘球菌门)、patescibacteria(髌骨细菌门)、firmicutes(厚壁菌门)、desulfobacterota(脱硫杆菌门)等。其中proteobacteria、actinobacteria的丰度在各样本中最高，分别占总序列的27.94％～37.43％和18.50％～30.14％。其中对于k326品种，sf处理下proteobacteria丰度最高，比s高了4.3％，同时sf处理下actinobacteria丰度最低，比ck低了6.05％；对于红花大金元而言，sjf处理下proteobacteria丰度最高，比sf高了9.49％，同时sjf处理下actinobacteria丰度最低，比sf低了4.27％。
[0260]
各样本细菌群落在门水平上的群落heatmap聚类分析如图17所示，其中k326品种下s和sj处理聚在一起，说明s和sj处理的细菌群落接近，之后再和ck处理聚在一起，说明ck、s和sj处理细菌群落接近，另外sf和sjf处理聚在一起，说明sf和sjf处理细菌群落类似；对于红花大金元而言，ck和s处理聚在一起，说明ck和s处理的细菌群落接近，之后再和sjf处理聚在一起，说明ck、s和sjf处理的细菌群落接近。
[0261]
2.7.3根际土壤微生物组间差异性检验
[0262]
如图18为各样本优势门的组间差异性检验，结果表明，对于k326品种，actinobacteriota、bacteroidota、gemmatimonadota、myxococcota、firmicutes、nitrospirota、armatimonadota、methylomirabilota在各个处理之间存在显著或极显著差异，其中sf处理能够显著降低actinobacteriota和gemmatimonadota丰度，sf和sjf能够显著提高bacteroidota和firmicutes丰度。对于红花大金元而言，proteobacteria、myxococcota、patescibacteria、firmicutes、desulfobacterota、bdellovibrionota在各个处理之间存在显著或极显著差异，其中sj和sf处理能够显著降低proteobacteria丰度，sj、sf和sjf能够显著提高firmicutes丰度。
[0263]
2.7.4根际土壤微生物细菌群落beta多样性分析
[0264]
主坐标分析(pcoa)可分析样本间细菌群落的整体差异情况，其结果均呈现在二维坐标图上，能够直观表现不同施肥处理土壤细菌组成差异。由图19可知，对于k326品种，ck、s和sj处理距离接近，sf和sjf处理距离接近，ck、s、sj和sf、sjf之间距离较远，说明ck、s和sj处理间的细菌群落接近，sf和sjf处理的细菌群落接近，而ck、s、sj和sf、sjf细菌群落差
异显著。对于红花大金元而言，ck、s和sjf处理距离接近，sj和sf处理距离接近，ck、s、sjf和sj、sf之间距离较远，说明ck、s和sjf处理间细菌群落接近，sj和sf处理间细菌群落接近，ck、s、sjf和sj、sf细菌群落差异显著。
[0265]
2.7.5根际土壤微生物细菌群落与环境因子关联分析
[0266]
2.7.5.1根际土壤微生物细菌群落与土壤养分关联分析
[0267]
如图20为土壤微生物细菌群落与土壤养分关联分析结果，可知，对于k326品种，除土壤ph和速效钾无相关性外，其它土壤养分指标之间均呈正相关；其中土壤速效钾箭头长度最长，表示土壤速效钾对土壤细菌群落影响最大，而土壤有机质箭头最短，表示土壤有机质对土壤细菌群落影响最小；另外ck、s和sj处理均在箭头方向，表示土壤养分各指标对ck、s和sj处理的土壤细菌群落分布呈正相关，sjf处理在箭头反方向，表示土壤养分各指标对sjf处理的土壤细菌群落分布呈负相关，sf处理下的土壤ph和有机质对土壤细菌群落分布呈正相关，土壤碱解氮、有效磷和速效钾则呈负相关。对于红花大金元而言，土壤ph与其它土壤养分均呈负相关；土壤有机质与ph呈负相关，与土壤碱解氮、有效磷和速效钾呈正相关；土壤碱解氮和有效磷与ph和速效钾呈负相关，与土壤有机质、土壤有效磷呈正相关；其中土壤有机质箭头最长，表示土壤有机质对土壤细菌群落影响最大；另外ck和s处理下土壤有机质和速效钾对土壤细菌群落分布呈正相关，土壤ph、碱解氮和有效磷则呈负相关，sj处理下土壤ph、有机质和速效钾对土壤细菌群落分布呈正相关，土壤碱解氮和有效磷则呈负相关，sf处理下土壤ph、碱解氮和有效磷对土壤细菌群落分布呈正相关，土壤有机质和速效钾则呈负相关，sjf处理下土壤有机质、碱解氮和有效磷对土壤细菌群落分布呈正相关，土壤ph和速效钾则呈负相关。
[0268]
2.7.5.2根际土壤微生物细菌群落与土壤酶活性关联分析
[0269]
如图21为土壤微生物细菌群落与土壤酶活性关联分析结果，可知，对于k326品种，土壤脲酶和土壤过氧化氢酶呈正相关，土壤蔗糖酶和土壤酸性磷酸酶呈正相关，土壤脲酶和土壤酸性磷酸酶无相关性；其中土壤过氧化氢酶箭头最长，表示表示土壤过氧化氢酶对土壤细菌群落影响最大，土壤蔗糖酶箭头最短，表示土壤蔗糖酶对土壤细菌群落影响最小；另外s和sj处理均在箭头方向，表示四种土壤酶活性对s和sj处理的土壤细菌群落分布呈正相关，sjf处理均在箭头反方向，表示四种土壤酶活性对sjf处理的土壤细菌群落分布呈负相关，ck处理下土壤脲酶和土壤过氧化氢酶对土壤细菌群落分布呈正相关，而土壤蔗糖酶和土壤酸性磷酸酶则呈负相关，sf处理下的土壤蔗糖酶和土壤酸性磷酸酶对土壤细菌群落分布呈正相关，而土壤脲酶和土壤过氧化氢酶则呈负相关。对于红花大金元而言，土壤脲酶和土壤蔗糖酶呈正相关，土壤酸性磷酸酶和土壤过氧化氢酶呈正相关；其中土壤蔗糖酶箭头最长，表示土壤蔗糖酶对土壤细菌群落影响最大，土壤酸性磷酸酶箭头最短，表示土壤酸性磷酸酶对土壤细菌群落影响最小；另外，ck处理下的土壤酸性磷酸酶和土壤过氧化氢酶对土壤细菌群落分布呈正相关，土壤脲酶和土壤蔗糖酶则呈负相关，s和sjf处理下的土壤脲酶、蔗糖酶和过氧化氢酶对土壤细菌群落分布呈正相关，土壤酸性磷酸酶则呈负相关，sf处理下土壤酸性磷酸酶和过氧化氢酶对土壤细菌群落分布呈正相关，土壤脲酶和蔗糖酶则呈负相关，sf处理下土壤脲酶和蔗糖酶对土壤细菌群落分布呈正相关，土壤酸性磷酸酶和过氧化氢酶则呈负相关。
[0270]
2.7烤烟不同时期各个指标的相关性分析
[0271]
2.7.1烤烟不同时期农艺性状与土壤养分的相关性分析
[0272]
表10是烤烟不同时期农艺性状与土壤养分的相关性分析结果。由表可知，在移栽后74d，土壤ph和株高、茎围、节距之间呈极显著正相关，而土壤有机质、土壤有效磷、土壤速效钾和株高、茎围、节距、最大叶面积之间呈显著或极显著负相关，说明在这个时期土壤ph的增加有利于烟株的生长发育，而土壤有机质、土壤有效磷、土壤速效钾的增加则不利于烟株的生长发育。在移栽后99d，土壤有机质和株高之间呈显著正相关，和茎围之间呈显著负相关，土壤有效磷和节距之间呈显著负相关，土壤速效钾和节距呈显著负相关，和最大叶面积之间呈显著正相关，其它指标之间无显著相关性，说明这个时期烟株生长情况受土壤有机质、土壤有效磷、土壤速效钾的影响。在移栽后115d，土壤有机质和茎围呈显著负相关，土壤碱解氮和株高呈显著正相关，和茎围呈显著负相关，土壤有效磷和株高呈显著负相关，说明这个时期株高受土壤碱解氮和土壤有效磷的影响，茎围受土壤有机质和土壤碱解氮的影响。
[0273]
表10烤烟不同时期农艺性状与土壤养分的相关性分析
[0274][0275]
2.7.2烤烟不同时期土壤养分与土壤酶活性的相关性分析
[0276]
表11是烤烟不同时期土壤养分与土壤酶活性的相关性分析。由表可知，在移栽后84d，土壤ph和土壤脲酶活性之间呈显著负相关，土壤有机质、土壤碱解氮、土壤有效磷、土壤速效钾和土壤脲酶活性、土壤酸性磷酸酶活性之间呈显著或极显著正相关，说明这个时期土壤有机质、土壤碱解氮、土壤有效磷、土壤速效钾含量的增加有利于提高土壤脲酶活性和土壤酸性磷酸酶活性。
[0277]
表11烤烟不同时期土壤养分与土壤酶活性的相关性分析
[0278][0279]
在移栽后100d，土壤ph和土壤蔗糖酶活性之间呈显著负相关，土壤有机质和土壤脲酶活性、土壤蔗糖酶活性、土壤过氧化氢酶活性之间呈极显著正相关，说明这个时期土壤有机质含量的增加有利于提高土壤脲酶活性、土壤蔗糖酶活性和土壤过氧化氢酶活性。在移栽后115d，土壤ph和土壤脲酶活性、土壤蔗糖酶活性之间呈显著或极显著负相关，土壤有机质、土壤碱解氮、土壤有效磷、土壤速效钾和土壤脲酶活性、土壤蔗糖酶活性、土壤过氧化氢酶活性之际呈显著或极显著正相关，说明这个时期土壤有机质、土壤碱解氮、土壤有效磷、土壤速效钾含量的提高有利于土壤脲酶活性、土壤蔗糖酶活性、土壤过氧化氢酶活性的提高。
[0280]
3、讨论
[0281]
3.1品种、肥料配施对烤烟不同时期农艺性状的影响
[0282]
本试验结果表明，在移栽后47d和74d，k326品种ck下的株高和节距显著高于其他处理，在移栽后99d和115d，sf处理能够显著提高植株的节距和最大叶面积。对于红花大金元而言，在移栽后47d和74d，s和sj处理的最大叶面积显著高于其他处理与阎海涛等人研究结果一致。
[0283]
3.2品种、肥料配施对烤烟不同时期土壤理化性质的影响
[0284]
本试验结果表明，在移栽后84d，不同肥料配施对k326品种的土壤有机质含量具有促进作用，其中sjf处理土壤有机质含量显著高于其他处理；对于红花大金元品种而言，sf处理土壤有机质含量显著高于其他处理。在移栽后100d和115d，k326品种sf处理土壤有机质含量最高；对于红花大金元品种而言，sjf处理土壤有机质含量最高。邓子恒等人研究表
明添加生物质炭、生物肥料可以提高土壤有机质含量，与本试验结果相符。
[0285]
在移栽后84d，k326品种s处理土壤碱解氮含量显著高于其他处理；对于红花大金元品种，s、sj、sf、sjf处理对土壤碱解氮含量的增加均由促进作用，其中sf处理的土壤碱解氮含量显著高于其他处理。说明添加生物质炭能够促进k326品种土壤碱解氮的积累；不同肥料配施都能够促进红花大金元土壤碱解氮的积累，但添加生物质炭和复合微生物肥促进作用最显著。
[0286]
在移栽后84d，k326品种s处理土壤有效磷含量显著高于其他处理，sj处理显著高于ck和sf处理；对于红花大金元品种来说，sf处理显著高于其他处理，sjf处理显著高于ck、s和sj处理。说明添加生物质炭以及添加生物质炭和解淀粉芽孢杆菌能够促进k326品种土壤有效磷的积累；添加生物质炭和复合微生物肥以及添加生物质炭、解淀粉芽孢杆菌和复合微生物肥能够促进红花大金元土壤有效磷的积累。
[0287]
在移栽后84d，k326品种s和sj处理土壤速效钾含量显著高于其他处理；对于红花大金元而言，sf处理显著高于其他处理，sjf处理显著高于ck、s和sj处理。说明添加生物质炭以及添加生物质炭和解淀粉芽孢杆菌能够促进k326品种土壤速效钾的积累；添加生物质炭和复合微生物肥以及添加生物质炭、解淀粉芽孢杆菌和复合微生物肥能够促进红花大金元土壤速效钾的积累，与前人研究结果相符。
[0288]
3.3品种、肥料配施对烤烟不同时期土壤酶活性的影响
[0289]
本试验结果表明，不同肥料配施下土壤脲酶在烟株生长期都呈逐步升高趋势。在移栽后100d和115d，k326品种s和sj处理土壤脲酶活性显著低于其他处理，sf处理在移栽后115d土壤脲酶活性显著高于其他处理，sjf处理显著高于ck、s和sj处理。对于红花大金元品种，sjf处理土壤脲酶活性显著高于其他处理，sf处理显著高于ck、s和sj处理，sj处理显著高于ck和s处理。说明添加生物质炭和复合微生物肥以及添加生物质炭、解淀粉芽孢杆菌和复合微生物肥能够提高k326和红花大金元土壤脲酶活性，添加生物质炭和解淀粉芽孢杆菌能提高红花大金元土壤脲酶活性，与前人研究结果一致。
[0290]
在移栽后47d和84d，k326品种sf下的土壤蔗糖酶显著高于其他处理，在移栽后100d，s和sf下的土壤蔗糖酶显著高于其他处理。对于红花大金元而言，在移栽后100d和115d，sjf下的土壤蔗糖酶显著高于其他处理，与前人研究结果一致。
[0291]
在移栽后84d，k326品种sj和sf处理能够显著提高土壤酸性磷酸酶活性。对于红花大金元而言，在移栽后84d、100d和115d，sf处理均能显著提高土壤酸性磷酸酶活性且酶活性显著高于其他处理，与前人研究结果一致。
[0292]
在移栽后100d和115d，k326品种s、sf和sjf处理能够显著提高土壤过氧化氢酶活性。对于红花大金元而言，在移栽后84d、100d和115d，sjf处理均能显著提高土壤过氧化氢酶活性且显著高于其他处理与前人研究结果一致。
[0293]
3.4品种、肥料配施对烤烟不同时期植株养分含量的影响
[0294]
本试验结果表明，对于k326品种而言，s、sj和sf处理能够显著提高植株养分含量，说明添加生物质炭、添加生物质炭和解淀粉芽孢杆菌、添加生物质炭和复合微生物肥能够提高植株养分含量。对于红花大金元而言，sj和sf处理能够显著提高植株养分含量，说明添加生物质炭和解淀粉芽孢杆菌、添加生物质炭和复合微生物肥能够提高植株养分含量，与董艳等人研究结果一致。
[0295]
3.5品种、肥料配施对烤烟不同时期烟叶膜脂过氧化相关保护酶的影响
[0296]
本试验结果表明，对k326品种而言，sj和sjf处理能够显著提高pod活性，sjf处理能够显著降低mda含量，说明添加生物质炭、解淀粉芽孢杆菌和复合微生物发能够在提高pod活性的同时降低mda含量。对于红花大金元而言，s处理能够显著提高pod活性并且能够显著降低mda含量，说明添加生物质炭能够在提高pod活性的同时降低mda含量与韩毅等人研究结果一致。
[0297]
3.6品种、肥料配施对青枯病害的影响
[0298]
本试验结果表明，对k326品种而言，肥料配施对青枯病害影响不显著，可能由于k326品种对青枯病抗病性较好以及供试土壤偏碱性综合作用有关。对于红花大金元而言，sj处理的发病率和病情指数最低，防治效果最高为66％，其次s和sjf处理也有良好的防治效果，与张广雨等人研究结果一致。
[0299]
3.7品种、肥料配施对根际土壤微生物的影响
[0300]
3.7.1根际土壤微生物alpha多样性
[0301]
本试验结果表明，k326品种sf处理下的shannon指数最大，simpson指数最小；红花大金元sf处理下的shannon指数最大，simpson指数也较小，两个品种表现出一致性，说明添加生物质炭和复合微生物肥可以提高土壤细菌物种丰富度和均匀度。
[0302]
3.7.2根际土壤微生物细菌群落组成分析
[0303]
本试验结果表明，对于k326品种，添加生物质炭和复合微生物肥能够提高土壤中proteobacteria丰度，降低土壤中actinobacteria丰度；对于红花大金元而言，添加生物质炭、解淀粉芽孢杆菌和复合微生物肥能够提高土壤中proteobacteria丰度，降低土壤中actinobacteria丰度，但添加生物质炭和复合微生物肥却降低了土壤中proteobacteria丰度。
[0304]
3.7.3根际土壤微生物组间差异性检验
[0305]
本试验结果表明，对于k326品种，添加生物质炭和复合微生物肥能够显著降低actinobacteriota和gemmatimonadota丰度，增加bacteroidota和firmicutes丰度；对于红花大金元而言，添加生物质炭和复合微生物肥能够显著降低proteobacteria丰度，增加myxococcota和firmicutes丰度。其中都能够增加firmicutes丰度，两个品种表现出一致性。
[0306]
3.7.4根际土壤微生物细菌群落beta多样性分析
[0307]
本试验结果表明，对于k326品种，添加生物质炭、添加生物质炭和解淀粉芽孢杆菌对土壤细菌群落组成影响不大，添加生物质炭和复合微生物肥对土壤细菌群落有着显著影响，对于红花大金元而言，添加生物质炭对土壤细菌群落组成影响不大，添加生物质炭和复合微生物肥对土壤细菌群落有着显著影响。其中添加生物质炭和复合微生物肥对土壤细菌群落有着显著影响两个品种表现出一致性。
[0308]
4、结论
[0309]
1.在整个烟株生长过程中，对于k326品种而言，sf对k326主要生育期下各项农艺性状的指标均优于其他处理。对于红花大金元而言，不同肥料配施对红花大金元的株高、茎围、节距和最大叶面积有着不同程度的促进作用，sj可以显著提高节距，sf则可以显著提高最大叶面积。
[0310]
2.在整个烟株生长过程中，对于k326品种而言，sf下的土壤有机质、土壤碱解氮、土壤速效钾和土壤有效磷含量均优于其他处理。对于红花大金元而言，sf和sjf下的土壤有机质、土壤碱解氮、土壤速效钾和土壤有效磷含量均优于其他处理。
[0311]
3.在整个烟株生长过程中，对于k326品种而言，sf处理能够显著提高土壤酶活性。对于红花大金元而言，sf和sjf处理能够显著提高土壤酶活性。
[0312]
4.在整个烟株生长过程中，对于k326品种而言，s和sf处理能够显著提高植株养分含量。对于红花大金元而言，sj、sf处理能够显著提高植株养分含量，sjf处理能够显著提高植株全氮和全钾含量。
[0313]
5.在整个烟株生长过程中，对于k326品种而言，sjf处理能够在显著提高pod活性的同时显著降低mda含量。对于红花大金元而言，s处理能够在显著提高pod活性的同时显著降低mda含量。
[0314]
6.在整个烟株生长过程中，对于k326品种而言，肥料配施对其青枯病害影响不显著。对于红花大金元而言，sj处理的病情指数最低，防治效果最好，同时s、sf和sjf也有较好的防治效果。
[0315]
7.通过对烤烟不同时期各个指标的相关性分析发现，农艺性状与土壤养分之间，土壤养分各指标和农艺性状各指标主要呈显著负相关，土壤养分与土壤酶活性之间，土壤有机质、土壤碱解氮、土壤有效磷、土壤速效钾和土壤脲酶活性、土壤蔗糖酶活性、土壤过氧化氢酶活性之际呈显著或极显著正相关。
[0316]
8.通过对根际土壤微生物的分析，添加生物质炭和复合微生物肥均能提高k326和红花大金元的土壤细菌物种丰富度和均匀度，同时能够显著增加firmicutes丰度。
[0317]
综上所述，对于k326和红花大金元两个品种而言，sf处理下，有利于提升烟株农艺性状、土壤理化性质、植株养分含量、土壤酶活性以及植株酶活性，改善土壤微生物环境，适宜烟株整体生长。
[0318]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。