一种围产期心肌病小鼠模型的构建方法与应用-j9九游会真人

1.本发明涉及动物模型构建技术领域，具体涉及一种围产期心肌病小鼠模型的构建方法与应用。


背景技术：

2.围产期心肌病(ppcm)是一种病因不明，既往没有心肌病病史，发生在生产前3个月或生产后半年内的心肌病，其特征为左心室收缩功能失常和充血性心力衰竭。ppcm的发病率因地域和人种不同，据统计，国外发病率为0.025-0.334％，我国发病率约为0.289％(1/346)。ppcm是孕产期女性死亡的重要原因，死因大多为难治性心衰、心律失常、并发肺栓塞或系统性栓塞。ppcm的主要危险因素有多胎多产、家族史、种族(非洲裔高发)、吸烟、糖尿病、高血压、子痫前期、营养不良、高龄妊娠、长时间使用β受体兴奋剂类的保胎药等。
3.由于医学伦理限制，动物模型是研究ppcm发病机制以及探索预防治疗措施的重要工具。灵长类动物在妊娠和心脏发育方面与人类有很多相似性，作为人类心脏疾病研究的模型具有无可比拟的优势，但由于价格高昂、操作复杂、实验周期久，目前小鼠和大鼠仍是常规用来构建心脏疾病模型的首选实验动物。
4.目前已有的ppcm的动物模型较少，出现在研究论文中的ppcm动物模型为基因改变ppcm动物模型，即ppcm基因缺陷模型，采用基因打靶技术敲除单个基因，检测基因缺陷动物孕期是否出现ppcm样症状。例如，在心肌细胞中特异性敲除stat3基因的小鼠模型(αmhc-cretg/ ；stat3fl/fl；cko)和全身性突变hsp20基因的小鼠模型(hsp20-s10f)，表现出了孕期心脏左室扩张，心功能损伤的ppcm特征。然而两种动物模型各自代表了不同的ppcm发病机制如心肌细胞凋亡和自噬。单个基因仅能改变其调控的下游信号通路，不能体现ppcm多病因的特点，且基因缺陷动物模型构建周期久，操作复杂，价格较高。因此，开发一种简易操作且模拟ppcm发生发展的动物模型十分必要。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种围产期心肌病小鼠模型的构建方法与应用。
6.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种围产期心肌病小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
7.(1)将雌鼠与雄鼠合笼，第二天观察到阴道栓确定该雌鼠怀孕并定为怀孕0.5天；
8.(2)于孕中期开始对步骤(1)孕鼠进行油酰乙醇胺给药至妊娠结束，得所述围产期心肌病小鼠模型。
9.油酰乙醇胺(n-oleoylethanolamine，oea)是一种由脂肪酸为底物转化而成的人体内源性大麻醇类物质。oea通过大麻醇受体cb1和cb2，抑制下游camp、p38、和erk1/2信号通路，调控配子形成、早孕期胚胎着床和胎盘发育。在不孕症病人的卵泡液和异位妊娠病人的血清中oea水平升高，参与调控输卵管上皮细胞的纤维摆动，致使孕卵异位妊娠和不孕症
的发生。本发明发明人经过大量的实验研究发现，从子痫前期伴发的围产期心肌病孕妇的代谢组中筛选到的水平异常升高的代谢物oea，发现oea可诱导孕鼠具有ppcm的表型，表明这一筛选自临床样本的代谢物oea与ppcm发生相关。因此，本技术发明人对妊娠孕中期小鼠灌胃施加oea，构建得到围产期心肌病小鼠模型。
10.作为本发明所述围产期心肌病小鼠模型的构建方法的优选实施方式，所述步骤(1)中的雌鼠与雄鼠周龄为10-12周。
11.作为本发明所述围产期心肌病小鼠模型的构建方法的优选实施方式，所述步骤(1)中的雌鼠与雄鼠的比例为雌鼠：雄鼠＝2：1。
12.作为本发明所述围产期心肌病小鼠模型的构建方法的优选实施方式，所述油酰乙醇胺的给药方式包括灌胃。
13.作为本发明所述围产期心肌病小鼠模型的构建方法的优选实施方式，所述油酰乙醇胺的给药剂量为40mg/kg/day。
14.作为本发明所述围产期心肌病小鼠模型的构建方法的优选实施方式，所述步骤(2)孕中期为怀孕第7.5天。
15.作为本发明所述围产期心肌病小鼠模型的构建方法的优选实施方式，还包括持续监测给药后的孕鼠的血压、检测孕18.5天孕鼠的心功能、心脏组织形态、胎鼠和胎盘重量。本发明的围产期心肌病小鼠模型的构建方法对给药后的孕鼠的血压、孕18.5天孕鼠的心功能、心脏组织形态、胎鼠和胎盘重量进行检测，能客观反映干预后实验孕鼠的围产期心肌病相关特征的变化，使得实验结果真实可信。
16.本发明还提供所述的构建方法构建得到的围产期心肌病小鼠模型。
17.本发明还提供所述围产期心肌病小鼠模型在筛选或制备治疗围产期心肌病的药物中的应用。
18.本发明还提供油酰乙醇胺在构建围产期心肌病小鼠模型中的应用。
19.本发明的有益效果：本发明提供一种围产期心肌病小鼠模型的构建方法，本发明通过对孕中期的小鼠施加一定剂量的oea构建围产期心肌病小鼠模型，建立得到的围产期心肌病小鼠模型呈现左心室扩张、心功能损伤、肺-心比值升高的ppcm特点，可用于ppcm病因、ppcm发生发展机制和相关治疗药物的开发研究。本发明的围产期心肌病小鼠模型的构建方法操作简单，构建成功率高，构建周期短。
附图说明
20.图1为n-oleoylethanolamine定量标准曲线图。
21.图2为利用靶向质谱技术检测正常孕妇胎盘与子痫前期伴发ppcm孕妇的胎盘中oea的含量；其中a为靶向质谱检测正常孕妇与患者孕妇胎盘样品中oea的含量；b为15例正常孕妇胎盘与20例ppcm孕妇胎盘中oea浓度。
22.图3为oea诱导ppcm小鼠模型构建策略图。
23.图4为实施例2中对四组小鼠进行围产期心肌病(ppcm)相关特征检测结果；其中a为小鼠心脏b超影像测量心功能及室壁厚度；b为小鼠心脏左室后壁厚度(lvpw)、左室内径(lvid)和左室壁与内径比值；c为小鼠心功能射血分数与心脏输出量数值；d为怀孕组小鼠的肺组织代表性照片，以及各组小鼠肺重与心重比值；e为小鼠心脏组织切片h&e染色结果；
f为怀孕组小鼠心脏组织切片wga染色结果，绿色荧光为wga标识的细胞膜，蓝色荧光为dapi；g为怀孕组母鼠血压监测结果；h为孕第18.5天胎鼠与胎盘重量。
具体实施方式
24.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
25.实验材料：
26.(1)c57bl/6小鼠：购自优达(广州)生物技术有限公司。
27.(2)oea溶液配制：将oea溶于含10％ dmso的生理盐水配制成100mg/ml的储存液，可保存于-20℃。将100mg/ml的oea储存液，用含10％ dmso生理盐水稀释至5mg/ml浓度作为工作液。
28.实施例1
29.本实施例通过质谱分析子痫前期伴发的ppcm孕妇胎盘的差异代谢物，具体步骤为：称取120mg胎盘组织样本到2ml ep管中，加入1.6ml甲醇水溶液(甲醇：水＝4：1)；加入两个小钢珠，在-80℃冰箱中放置5min后，在研磨机中研磨成匀浆；超声提取10min，-20℃静置30min；低温离心10min(12000rpm，4℃)，取1.4ml上清旋干，用100ul重融后，超声离心后取50ul于lc-ms进样瓶中上机。oea标准品制备为梯度浓度溶液，取50ul于lc-ms进样瓶中上机，绘制标准品曲线。所用质谱仪器为sciex triple quad 4500lc-ms/ms系统；控制软件：analyst1.6.3；定量软件：analyst quantitate。
30.结果如图1～2所示，在ppcm孕妇胎盘中oea的含量显著升高，表明代谢物oea与ppcm的发生相关。
31.实施例2
32.本实施例提供一种围产期心肌病小鼠模型的构建方法，具体构建策略图如图3所示，包括以下步骤：选取10-12周龄、体重20-26g的c57bl/6雌鼠与雄鼠，按照2:1比例合笼，第二天早上检验阴道栓确定怀孕并记为怀孕的d0.5天；将确认怀孕的雌鼠分为怀孕对照组(pregnant-dmso组)和怀孕施药组(pregnant-oea组)，将未怀孕的雌鼠分为基础对照组(baseline-dmso组)和基础施药组(baseline-oea组)，每组6只小鼠；怀孕施药组(pregnant-oea组)和基础施药组(baseline-oea组)小鼠自孕d7.5开始接受灌胃给药40mg/kg/day oea，持续10天；怀孕对照组(pregnant-dmso组)和基础对照组(baseline-dmso组)小鼠自孕d7.5开始接受灌胃含10％ dmso的生理盐水，持续10天。
33.对上述四组小鼠进行围产期心肌病(ppcm)相关特征检测：持续监测给药后的孕鼠的血压、检测孕18.5天孕鼠的心功能、心脏组织形态、胎鼠和胎盘重量。
34.由图4a-c可知，与未孕的雌鼠相比(即baseline-dmso组与pregnant-dmso组相比)，怀孕引起心脏左室舒张期内径增大，但室壁与内径比值未变，表明孕期心脏发生正常适应性改变，心功能ef值正常，心输出量增大；施加oea的孕鼠(即pregnant-dmso组与pregnant-oea组相比)引起左室后壁厚度和内径增大，左室壁与内径比值也升高，表明oea引起孕期心脏发生病理性肥厚；pregnant-oea组孕鼠心脏射血分数降至41.47％，心输出量减小，表明oea引起孕期心功能损伤；由图4d可知，pregnant-oea组孕鼠肺重量增加，出现肺
水肿，表明其心功能受损；而oea对未孕的雌鼠(baseline-dmso组和baseline-oea组)心脏、肺重无影响，表明oea可能通过孕期生理或病理条件的改变，引起母体心脏病理性重塑。对心脏进行组织形态分析(图4e)，发现oea导致孕鼠左室壁增厚，左室腔扩大；对心脏组织切片wga染色显示心肌细胞轮廓(图4f)，发现oea导致孕鼠心脏的心肌细胞体积增大；由图4g-h可知，oea对孕鼠血压、胎鼠和胎盘重量无影响。综上，本发明构建的oea诱导的ppcm小鼠模型出现了左心室扩张、心功能损伤、肺-心比值升高的ppcm特点。由此说明，本实施例成功构建了围产期心肌病小鼠模型。
35.最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。