假单胞菌在制备防治西瓜枯萎病的生物制剂中的应用-j9九游会真人

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及假单胞菌在制备防治西瓜枯萎病的生物制剂中的应用。


背景技术：

2.植物病害是限制世界粮食产量的主要因素之一，每年由于植物病害所造成的粮食损失可达世界粮食产量的25％。其中，70％～80％的植物病害是由植物病原真菌引起的。目前，施用化学农药是防治植物真菌病害最主要的方式。但是长期不合理地使用化学农药，造成了农药残留、病原菌产生抗药性、生态平衡破坏等一系列问题，对食品安全和生态环境造成很大影响，也严重制约农业产业发展。
3.植物病害的生物防治主要是利用微生物活体或其代谢产物来抑制病原菌的生长。生物防治对人畜安全，不污染环境，对植物及其他天敌无不良影响，不干扰其他防治措施，是今后病虫害综合防治的重要组成部分。
4.植物病害生物防治主要是指利用有益微生物活体或其代谢产物抑制病原菌从而对病害进行预防和治理的技术。其实质是利用微生物直接或间接的竞争、抗生以及溶菌的作用，又或者通过微生物产生的代谢物等拮抗病原菌，从而达到抑制病原体的效果。生物防治技术具有不易产生抗性、不污染环境、对人和其他生物安全且生防材料容易获取等优点，在有害生物综合防治中发挥着重要的作用。随着化学农药的减施，生物防治将逐步取代传统的化学防治手段，具有较为广阔的应用前景。
5.植物病害中的西瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌西瓜专化型(fusarium oxysporum f.sp.niveum)引起造成西瓜连作障碍的重要病害，在西瓜设施栽培生产中危害尤为严重。长期以来，西瓜枯萎病防治主要依赖于轮作和化学药剂。但由于西瓜栽培面积逐渐扩大，能够用于轮作的空间越来越少，并且化学药剂的过量使用严重污染农产品和生态环境，危及人畜健康。因此，近年来生物防治正日益成为西瓜枯萎病防控中的一条重要的途径。
6.比如公开号为cn1 10938551a的专利申请公开了一株拟康宁木霉(trichoderma koningiopsis)t-51菌株在西瓜枯萎病生物防治中的应用。该发明的拟康宁木霉t-51菌株分生孢子悬浮液能够显著抑制苗期西瓜枯萎病，拟康宁木霉t-51菌株的液体培养物滤液能够抑制西瓜枯萎病菌的菌丝生长。拟康宁木霉t-51菌株在pda上生长产生的挥发性物质能够抑制西瓜枯萎病菌的菌丝生长和分生孢子萌发。
7.假单胞菌(pseudomonas sp.)a7，该菌株对于灭草灵、联苯醇、苯、甲苯、二甲苯残留都可以进行有效地降解，然而对于西瓜枯萎病菌的抑制能力还未见报道。


技术实现要素：

8.鉴于此，本发明提供了假单胞菌在制备防治西瓜枯萎病的生物制剂中的应用，所述假单胞菌为假单胞菌(pseudomonas sp.)a7，能够有效防治西瓜枯萎病菌的生长。
9.本发明的技术方案如下：
10.一方面，本发明提供了假单胞菌(pseudomonas sp.)在制备防治西瓜枯萎病的生物制剂中的应用。
11.另一方面，本发明还提供了假单胞菌(pseudomonas sp.)在促进西瓜种子萌发中的应用。
12.在一方面的实施例中，所述假单胞菌(pseudomonas sp.)为假单胞菌(pseudomonas sp.)a7，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 2020914。
13.在一方面的实施例中，所述西瓜枯萎病的病原菌为西瓜枯萎病菌(fusarium oxysporum f.sp.niveum)。
14.在一方面的实施例中，所述防治西瓜枯萎病的生物制剂的制备方法包括以下步骤：
15.将假单胞菌(pseudomonas sp.)接种到发酵培养基中进行培养后，得到的发酵液即为防治西瓜枯萎病的生物制剂。
16.优选的，培养温度为30℃，培养时间为72-96h。所述生物制剂为液剂。
17.在一方面的实施例中，所述生物制剂的使用方法为：使用所述生物制剂对植株进行灌根。
18.本发明的有益效果：
19.本发明通过将假单胞菌及其发酵产物在西瓜种植中进行施用，可有效抑制镰刀菌侵染西瓜的病症发展，且能达到较理想的防治效果。同时，假单胞菌及其发酵产物还能对西瓜种子发芽起到促进作用。
附图说明
20.图1为假单胞菌a7对西瓜枯萎病菌的离体抑菌效果，a为对照，b为生防菌处理；
21.图2为假单胞菌a7菌液对西瓜枯萎病菌的离体抑菌效果；
22.图3为假单胞菌a7发酵液对西瓜枯萎病的盆栽防治效果，a为生防菌处理，b为对照处理；
23.图4为假单胞菌a7菌液对种子萌发效果评估。
具体实施方式
24.本发明使用的假单胞菌a7，于2020年12月18日已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 2020914，分类命名为假单胞菌(pseudomonas sp.)。
25.病原菌为西瓜枯萎病菌fusarium oxysporum f.sp.niveum，分离自田间西瓜枯萎病病株根部，并经过了病原学鉴定和致病力检测。
26.实施例1生防菌株的筛选
27.将假单胞菌a7菌株在lb培养基(酵母膏1.0wt％、蛋白胨0.5wt％、氯化钠1.0wt％、琼脂粉2.0wt％，溶剂为蒸馏水，ph 7.2-7.5)中进行平板对峙试验。
28.采用平板对峙法初筛，将西瓜枯萎病菌在pda固体培养基(马铃薯粉20.0wt％、葡萄糖2.0wt％，溶剂为蒸馏水)中活化后，用5mm打孔器沿着菌丝边缘打菌饼备用。取其中一个菌饼，菌丝面朝下，接种到新的pda固体培养基中央，在离指示菌等距离(2cm)处划线接入
假单胞菌a7，接三个平板作为重复，同时以不接假单胞菌a7而只接西瓜枯萎病菌的平板为对照。25℃进行对峙培养，于7天后观察并测量记录西瓜枯萎病菌的菌丝生长直径，抑菌情况见图1。
29.从图1可以看出，假单胞菌a7与西瓜枯萎病菌在平板上对峙培养7天后，西瓜枯萎病菌菌丝靠近假单胞菌a7方向的生长受到抑制，菌丝呈明显抑制状态。
30.实施例2
31.1、制备发酵液
32.将假单胞菌a7单菌落在lb培养基中预培养12h，制成种子液。将种子液以1％的接种量接种于lb液体培养基中，在30℃、180rpm振荡培养72-96h，得到发酵液。
33.2、抑菌实验
34.假单胞菌a7发酵液按不同体积百分比例(0.5％、1％、5％、10％)添加至pda培养基，制作抑菌平板。按照实施例1中平板初筛的方法打取西瓜枯萎病菌5mm的新鲜菌饼，接种到冷却凝固的抑菌平板中央，接三个平板作为重复，同时以不接假单胞菌a7发酵液而只接西瓜枯萎病菌的平板为对照。25℃进行对峙培养，在第7天时测量受假单胞菌a7拮抗的西瓜枯萎病菌生长直径和对照组西瓜枯萎病菌的生长直径，三次重复取平均值后根据公式：相对抑菌率(％)＝(对照直径-拮抗直径)/对照直径
×
100％，计算得到假单胞菌a7发酵液对西瓜枯萎病菌的相对抑菌率，抑菌情况见图2。
35.从图2可以看出，含有发酵液浓度越高，对西瓜枯萎病菌的抑制效果越明显，而对照组对西瓜枯萎病菌的没有抑制效果，在添加0.5％发酵液时，抑制效果达64.1％。当添加10％发酵液时，抑制效果基本可达82.9％。
36.实施例3
37.假单胞菌a7在盆栽西瓜的枯萎病防治作用，具体步骤包括：
38.步骤1)将实施例2步骤1制备的发酵液在7000rpm离心10min，取上清，以得到发酵滤液，作为生防菌液；
39.步骤2)用真菌培养箱中26℃生长7天的西瓜枯萎病菌，制备孢子悬浮液；具体地，培养5-7天的西瓜枯萎病菌打取5mm的新鲜菌饼，接种于pdb培养基(马铃薯粉20.0wt％、葡萄糖2.0wt％、溶剂为蒸馏水)，26℃，150rpm培养10d，调整孢子浓度为106个/ml；
40.步骤3)取市售健康的沙海明珠西瓜种子催芽播种的西瓜幼苗(两叶一心期)移栽时接种西瓜枯萎病菌，使用步骤2)中制备的孢子悬浮液浸根接种，浸泡10-15min；移栽第二天用20ml生防菌液灌根，置于光照培养箱(28℃/13h光照，18℃/11h黑暗，50％～70％湿度)，每组处理3个重复；培养5天、10天后分别用20ml生防菌液灌根，灌根处理后每2-3天观察发病情况，以无菌水为对照，具体见图3(30天左右生长效果)。
41.从图3可知，无菌水对照组的瓜苗逐渐出现叶片枯萎症状，生防菌处理组生长状况显著优于无菌水对照组，说明假单胞菌a7的生防菌液可以较好的抑制西瓜枯萎的发展。
42.实施例4
43.假单胞菌a7在西瓜种子发芽中的作用试验。
44.取市售健康的沙海明珠西瓜种子，用30℃温水浸种4h，接着用实施例3步骤1)中制备的发酵滤液即假单胞菌a7生防菌液浸种30min，以蒸馏水为对照；每个处理3组生物学重复，每个重复10粒种子。之后，西瓜种子于28℃恒温培养箱催芽，每隔24h观察测量记录发芽
情况。
45.试验结果如图4可知，24h后，蒸馏水对照组的出芽率为33.3％，生防菌液浸种组的出芽率为56.7％；48h后，蒸馏水对照组的出芽率为56.7％，生防菌液浸种组的出芽率为83.3％。假单胞菌a7生防菌液处理组的出芽率显著高于蒸馏水处理组(p＜0.01)，说明生防菌液a7具有显著的促种子萌发效果。