隐球菌的cfdna在诊断隐球菌感染中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术和医学技术领域，特别是涉及隐球菌的cfdna在诊断隐球菌感染中的应用。
背景技术：
2.在一项我国的回顾性分析中，超过60％的病例是在免疫系统正常的成年人中检出的。另一个更不好的现象是，研究表明健康人群的下呼吸道真菌定植也达到了。其发病往往与流感，肺结核，重症肺炎相关联，由于其发病的隐匿性与进展速度往往很难使临床医生在短时间做出正确的判断，因此在icu中侵袭性真菌病已经成为误诊率最高的疾病，严重影响患者预后。单一的肺隐球菌病或许不是最大的困难，然而侵袭性的特点决定了它在体内的高播散度，接近70％肺隐球菌病患者出现隐球菌性脑膜炎的症状。重症患者和免疫正常患者中发现的真菌疾病谱正在扩张，肺隐球菌病的死亡率可以达到55％，在临床诊治的地位也越来越重要。
3.cfdna(cell free dna)是指游离于细胞外的部分降解了的机体内源性dna，主要是在血液、尿液或其他体液中。cfdna浓度的绝对定量作为一种新型的生物标志物，在分子生物检测上有极大的应用价值。在既往的研究中，已经证明cfdna在对自身免疫型疾病，肿瘤等起到早期明确诊断与病情监测的效果。但由于cfdna是在患者血液中发现的降解dna片段，一方面从全血中提取cfdna以及后期检测仍是一个巨大的挑战。另一方面，运用传统的检测方法如elisa或多孔板夹心免疫分析法检测又需要大量的样本和昂贵的试剂，而这种技术又需要在专门的实验室由专业人员操作。因此，限制了cfdna在医疗诊断领域的应用。
技术实现要素：
4.针对上述问题，本发明提供一种隐球菌的cfdna在诊断隐球菌感染中的应用，能够用于诊断隐球菌病，且对于非播散性隐球菌病具有较高的灵敏度。
5.为了达到上述目的，本发明提供了一种隐球菌的cfdna序列在开发和/或制备诊断隐球菌感染的产品中的而应用，所述cfdna序列选自以下区域：cnag_09001-09012cytochrome coxidase subunit ii。
6.采用上述区域的cfdna序列作为靶序列，具有表达稳定，重复度较好的优势效果，能够用于诊断隐球菌病。cfdna序列选自以下区域：cnag_09001-09012cytochrome c oxidase subunit ii(cryptococcus neoformans var.grubii h99)。
7.在其中一个实施例中，所述cfdna序列选自：seq id no：1-7。
8.本发明人在研究中发现，现行的检测人体中隐球菌的pcr方案中，存在的主要缺点为对检测样本的核酸序列长度有要求，一般要求在500bp以上，因此，常规检测中选择组织标本或balf(支气管肺泡灌洗液)标本，作为用于检测的生物样本，但对待测者的创伤较大，然而若想要减少检测取样的创伤，则需要以外周血为生物样本，但血液中无法存在核酸片段长度如此完整的外源性核酸序列，现行的pcr方案对于血液标本较难得出准确的隐球菌
诊断结果。因此，现行的pcr方法只能检测病情更严重的播散性隐球菌病伴有真菌血症的患者。而本发明人对cnag_09001-09012cytochrome c oxidase subunit ii(cryptococcus neoformans var.grubii h99)所示序列进行引物的捕获设计，得到如seq id no：1-7所示序列，这些序列的长度在100-130bp左右，为较短的核酸序列片段，广泛存在于人体的血液循环中，检测灵敏度较高，且取样相对无创，能够于隐球菌感染早期就反应人体中疾病的发生，作为早期诊断的靶序列具有很大价值。同时，cfdna是隐球菌感染宿主后产生的，在用于鉴别隐球菌的感染、定植/污染方面有较广阔的应用前景。
9.在其中一个实施例中，所述cfdna序列选自：seq id no：1、seq id no：7。
10.本发明还提供了一种扩增引物组，所述扩增引物组用于扩增所述隐球菌的cfdna序列。
11.在其中一个实施例中，所述扩增引物组包括正向扩增引物，反向扩增引物，和信号报告探针。
12.在其中一个实施例中，所述pcr扩增试剂中的正向扩增引物选自：seq id no：8-11；所述pcr扩增试剂中的反向扩增引物选自：seq id no：12-15。
13.在其中一个实施例中，所述pcr扩增试剂中的正向扩增引物选自：seq id no：8、seq id no：11。
14.在其中一个实施例中，所述pcr扩增试剂中的反向扩增引物选自：seq id no：12、seq id no：15。
15.在其中一个实施例中，所述信号报告探针的序列选自：seq id no：16、seq id no：17。
16.本发明还提供了一种用于诊断隐球菌感染的试剂盒，该试剂盒包括所述扩增引物组，通过检测宿主外周血中的隐球菌cfdna，获得诊断结果。
17.本发明人在研究过程中发现cfdna的序列片段小，难以通过常规手段确定其中的特异性片段，而pcfdna(plasma cell-free dna)作为cfdna中较晚被分类出的群体，同时具有cfdna检测的灵敏度与针对不同病原体的特异性。虽然现有的cfdna的检测手段还较为落后，标本消耗量大，有效成分纯度低，工艺流程繁琐昂贵，并不适用于临床大规模开展检测。但是前期研究中，发现pcfdna的手工单次提纯检测最高可以使31.9％的疑似真菌感染者获益。因此，本发明人选择以外周血为提取cfdna的生物样本，通过二代测序的方法确定隐球菌在人体内被免疫细胞攻击后进入外周血的核酸片段以及丰度，得到特定的cfdna序列作为靶序列，并设计与之对应的正向扩增引物、反向扩增引物和信号报告探针，组成用于诊断隐球菌感染的试剂盒，该试剂盒可用于诊断隐球菌病，灵敏度较高，且对于非播散性隐球菌病的诊断也具有较高的灵敏度。
18.在其中一个实施例中，所述隐球菌感染为非播散性隐球菌病。
19.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
20.本发明的一种隐球菌的cfdna序列在开发和/或制备诊断隐球菌感染的产品中的而应用，该cfdna序列选自cnag_09001-09012cytochrome c oxidase subunit ii。采用上述区域的cfdna序列作为靶序列，具有表达稳定，重复度较好的优势效果，能够用于诊断隐球菌病，且对于非播散性隐球菌病的诊断也具有较高的灵敏度。
附图说明
21.图1为实施例1中筛选得到cnag_09001-09012cytochrome c oxidase subunit ii(cryptococcus neoformans var.grubii h99)的流程图；
22.图2为实施例1中在体外模拟感染后对隐球菌cfdna进行测序获得的片段丰度结果图，其中系列1为3*107/ml高浓度隐球菌干预人免疫细胞，系列2为3*106/ml中等浓度隐球菌干预人免疫细胞，系列3为3*105/ml低浓度隐球菌干预人免疫细胞；
23.图3为实施例1中在体外模拟感染后对隐球菌cfdna进行测序获得的片段丰度结果图；
24.图4为实验例中对1号扩增引物组、2号扩增引物组、阳性对照组、阴性对照组的扩增效率的分析结果图；
25.图5为实验例中1号扩增引物组的扩增效率结果图；
26.图6为实验例中2号扩增引物组的扩增效率结果图。
具体实施方式
27.为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
28.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
29.试剂、材料、设备来源：
30.cell-free dna kit ii磁珠法提取cfdna试剂盒；aamp dnamicrobiome kit宿主源性核酸洗脱试剂盒；illuminanextseq 2000测序仪；ultra
tm
ii dna library prep kit for人类免疫细胞混合物、隐球菌h99菌株(atcc)；bunnytube
tm
cfdna核酸样本保存管；bunnytube
tm
cfdna保存液；takara qpcr试剂；mx3005p实时pcr系统。
31.本实施例所用试剂、材料、设备如无特殊说明，均为市售来源；实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规实验方法。
32.实施例1
33.筛选得到隐球菌线粒体基因09000-09012功能定位。
34.筛选得到隐球菌线粒体基因09000-09012的流程如图1所示，具体操作如下：
35.一、建立体外免疫细胞的隐球菌感染模型。
36.1、材料：人类免疫细胞混合物、隐球菌h99菌株(atcc)，prmi1640培养基(gibco)，特级澳洲胎牛血清(gibco)。
37.2、实验方法：从健康人的全血中提取免疫细胞，细胞总浓度达到3*106/ml，添加隐球菌h99细胞，分别以3*107/ml的高浓度隐球菌、3*106/ml的中浓度隐球菌、3*105/ml的低浓度隐球菌干预人免疫细胞，共培养2，4，6，8，10小时分别进行上清液取样。
38.二、样本收集和纯化。
39.1、材料：cfdna保存液，cell-free dnakit ii磁珠法提取cfdna试剂盒，aamp dnamicrobiome kit宿主源性核酸洗脱试剂盒。
40.2、实验方法：
41.(1)使用磁珠法提取cfdna试剂盒提取共培养产物上清液cfdna，使用cfdna纯化试剂盒纯化产物cfdna，宿主源性核酸洗脱试剂盒洗脱cfdna中宿主源性核酸片段。
42.(2)在2-8℃条件下将纯化cfdna储存在cfdna保存液中，运送至广州微远基因有限公司的标准化和认可的第二代测序平台实验室，所有样本都储存在2-8℃条件下3天内完成测序工作。
43.三、cfdna的测序。
44.1、材料：ultra
tm
ii dnalibrary prep kit for illuminanextseq 2000测序仪。
45.2、实验方法：
46.(1)构建cdna文库：使用ultra
tm
ii dnalibrary prep kit for使dna片段化、末端修复、接头连接和pcr扩增构建dna文库。质量检测，包括dna浓度检测、琼脂糖凝胶电泳和片段长度检测，完成建库。
47.(2)测序：汇集了合格的文库，并使用illumina平台制备和测序dna纳米球(dnb)进行测序。
48.四、测序数据分析。
49.1、分析方法。
50.(1)测序得到的原始测序序列(sequenced reads)或者raw reads，里面含有带接头的、低质量的reads。为了保证信息分析质量，必须对raw reads过滤，得到clean reads，后续分析都基于clean reads。数据处理的条件如下：去除带接头(adapter)的reads pair；当单端测序read中含有的n的含量超过该条read长度比例的10％时，需要去除此对paired reads；当单端测序read中含有的低质量(q≤5)碱基数超过该条read长度比例的50％时，需要去除此对paired reads。
51.(2)基因组建索引，与全物种核酸序列对比，blast得出相应cfdna片段对应隐球菌基因位置，去除重复且碎裂的核酸片段，最终筛选出表达量前500位cfdna片段与其对应基因组位置后输出结果。
52.2、分析结果。
53.(1)经过对cfdna核酸序列大小的限定(40-166bp)和对内源性片段的去宿主化以及生物信息学分析得出了top500的隐球菌cfdna序列，上述测序分2次进行，第1次分别采用高浓度隐球菌、中浓度隐球菌、低浓度隐球菌干预人免疫细胞，然后测序，结果如图2所示，其中，系列1为3*107/ml高浓度隐球菌干预人免疫细胞，系列2为3*106/ml中等浓度隐球菌干预人免疫细胞，系列3为3*105/ml低浓度隐球菌干预人免疫细胞。第2次采用中浓度隐球菌干预人免疫细胞，然后测序，对第1次测序结果进行复核，第2次测序结果如图3所示。图2、图3中显示了在两次测序中在隐球菌基因中发现的一些丰度较高，有潜力制作cfdna引物的核酸片段。
54.(2)经过对基因丰度的分析，锁定隐球菌线粒体基因09000-09012，即cnag_09001-09012cytochrome c oxidase subunit ii(cryptococcus neoformans var.grubii h99)，
该基因在图2红框处，图3红框处均出现，且在重复测序中占比呈现优势状态，在测序中表达稳定，可见，无论何种隐球菌干预的浓度，均存在上述锁定的隐球菌线粒体基因09000-09012，并且位置位于隐球菌线粒体基因保守序列。
55.五、pcr引物设计。
56.根据前期测序所获得的cnag_09001-09012中高表达的cfdna片段进行引物的捕获设计。具体设计原则如下：
57.引物长度设计在15～30碱基之间；
58.引物gc含量在40％～60％之间，tm值接近72℃；
59.引物3
′
端避开密码子的第3位，引物3
′
端首选t，碱基随机分布；
60.引物自身及引物之间不应存在互补序列；
61.不同位置的
△
g值可以用oligo6软件进行分，引物5
′
端和中间
△
g值应该高于3
′
端
△
g值；
62.扩增产物的单链不能形成二级结构；
63.对产生的引物群进行基因芯片筛选，最终获得如seq id no：1-7所示的靶序列，seq idno：8-11所示的正向扩增引物，seq id no：12-15所示的反向扩增引物，seq id no：16-17所示的探针，具体如下表所示，选择其中对上述筛选原则符合度高的引物序列，优选得到1号正向扩增引物、1号反向扩增引物、1号信号报告探针，以及2号正向扩增引物、2号反向扩增引物、2号信号报告探针。然后将在测序中筛选得到cfdna丰度高的对应引物进行下一步实际验证。
64.表1引物群的筛选结果
65.66.[0067][0068]
上表中各编号所示序列具体如下：
[0069]
cgaggacgaactattggtgttacaggagctcacatcattacaacaggatgtctaatgacatcagcagctctatctattgtagctttctatgaagttggtctatcaggatcacc(seq id no：1)cgaggacgaactattggtgttacaggagctcacatcattacaacaggatgtctaatgacatcagcagctctatctattgtagctttctatgaagttggtctatcaggatcac(seq id no：2)
[0070]
acgaggacgaactattggtgttacaggagctcacatcattacaacaggatgtctaatgacatcagcagctctatctattgtagctttctatgaagttggtctatcaggatcac(seq id no：3)
[0071]
acgaggacgaactattggtgttacaggagctcacatcattacaacaggatgtctaatgacatcagcagctctatctattgtagctttctatgaagttggtctatcaggatcacc(seq id no：4)
[0072]
tacgaggacgaactattggtgttacaggagctcacatcattacaacaggatgtctaatgacatcagcagctctatctattgtagctttctatgaagttggtctatcaggatcac(seq id no：5)
[0073]
tacgaggacgaactattggtgttacaggagctcacatcattacaacaggatgtctaatgacatcagcagctctatctattgtagctttctatgaagttggtctatcaggatcacc(seq id no：6)
[0074]
caacacgctgaagaaccatttgtaacagttggggctattgcaactgctgtatactttggttggtttgtagtcctactaccaattattggaatgctagaaaacacatcacttgacggttcatca(seq id no：7)
[0075]
cgaggacgaactattggtgttac(seq id no：8)
[0076]
acgaggacgaactattggtgttac(seq id no：9)
[0077]
tacgaggacgaactattggtgttac(seq id no：10)
[0078]
caacacgctgaagaaccatttg(seq id no：11)
[0079]
ggtgatcctgatagaccaacttc(seq id no：12)gtgatcctgatagaccaacttcatag(seq id no：13)
[0080]
ggtgatcctgatagaccaacttcatag(seq id no：14)
[0081]
tgatgaaccgtcaagtgatgtg(seq id no：15)
[0082]
acaggatgtctaatgacatcagcagc(seq id no：16)
[0083]
agttggggctattgcaactgctgt(seq id no：17)
[0084]
实验例
[0085]
通过qpcr验证实施例1得到的隐球菌cfdna引物序列的可靠性。
[0086]
一、材料：qpcr试剂、对比引物与探针、磁珠法cfdna提取与纯化试剂盒、8名非播散性隐球菌病患者血浆。该血浆的获得方法：从8名非播散性隐球菌病患者外肘静脉采血，使用edta抗凝管采集，然后在24小时内进行离心，获得患者血浆。
[0087]
二、实验方法。
[0088]
1、cfdna提取：提取生物样本中的cfdna，具体方法根据磁珠法cfdna提取与纯化试剂盒操作说明书进行操作。
[0089]
2、pcr扩增。
[0090]
将与实施例1筛选得到的靶序列(seq id no：1、seq id no：7)对应的qpcr扩增引物序列对和信号报告探针，与现有技术中同样用于非播散性隐球菌病诊断性的对比例qpcr引物进行对比。
[0091]
对比例的靶序列如seq id no：21所示。
[0092]
表1引物相关信息
[0093][0094]
对比例的靶序列具体如下所示：
[0095]
agaaccattgtgtgatacctctttcttgtactttgcctttgctctccaaaaccagtcgcgccaaactccgataaacaccagaggtttgtggc(seq id no：21)
[0096]
扩增体系和条件如下表所示。
[0097]
表2 pcr扩增反应体系和条件
[0098]
反应体系μlpcrmix10primerf(5/10p)0.2primerr(5/10p)0.2探针taq0.2roxⅱ0.2depc水7.2模板(ng/μl)2合计20
[0099]
3、数据分析。
[0100]
数据下机后根据数据曲线进行分析，对比各组扩增结果发现实施例1得到的2组扩增引物组的扩增效率均高于对比例的扩增引物组。
[0101]
分析结果如图4、5、6所示，图4中的阳性对照组即指表1中的对比例，阴性对照组为
以和实验例步骤一中同样方法获得的健康人的静脉血血浆。
[0102]
四、实验结果。
[0103]
在参与实验的8名非播散性隐球菌病患者提取的cfdna中发现1号扩增引物组的扩增效率强，ct值为29(如图5所示)；2号扩增引物组的扩增效率中等，ct值为35(如图6所示)，均优于现行非播散性隐球菌检测方案结果。
[0104]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0105]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。