1.本公开涉及一种热敏透明质酸珠凝胶，其中，所述热敏透明质酸珠凝胶可以通过以下来制备：将透明质酸、交联剂和碱性水溶液混合来获得球形凝胶，然后与三嵌段共聚物(a ternary copolymer)混合。
背景技术：
2.通常，众所周知的制备由交联的透明质酸组成的珠(beads)的方法涉及化学方法和物理方法的结合，用于将珠分离的已知方法包括：通过细喷嘴进行沉淀或对外部进行脂质化和封装的方法，以及在使用表面活性剂分散后，通过溶剂萃取蒸发来获得溶解的生物降解聚合物的方法。
3.为了通过物理方法增加颗粒的均匀性，其可能受到搅拌器叶片的形状和搅拌速率的影响，大多需要保持高速搅拌速率。使用细喷嘴的方法不能通过形成类似石榴果的外观来保持完美的球形形状；当通过对外部的脂质化和封装来获得球形珠时，由于受到物理外力的破坏，内部的液相流出；而当采用溶剂萃取蒸发法时，对人体有害的表面活性剂和有机溶剂的使用是必需的，从而需要对最终产品进行完全去除。
4.制备由交联的透明质酸组成的珠的其它一般方法包括如下的方法：使用过量的阳离子物质，通过与阴离子透明质酸的离子键合，以不溶性沉淀形式制备；使用过量的交联剂制备不溶性形式，用于干燥后的物理造粒；或将疏水性物质与透明质酸的羧基结合，溶解在有机溶剂中，在两种不同相分离的溶剂中使用乳化剂形成微米珠，然后通过溶剂萃取法回收微米珠。与通过bdde交联的透明质酸珠的制备相关的文献包括如下的制备方法，其中，通过将透明质酸溶解在碱性水溶液中在10℃下过夜而发生分子量降低后，添加过量的bdde(每100mg透明质酸20mg bdde，与交联反应位点相比约40mol％)，进行橄榄油搅拌反应，随后用过滤器回收，然后使用70％的丙酮水溶液、蒸馏水和磷酸盐缓冲盐水(pbs)进行纯化，由于硬度高和形状不均匀(接近20％-30％的高化学应变率以及18.99-23.02的低溶胀度)，该方法在应用领域中显示出使用局限性。
5.此外，通过如下来制备纳米/微米珠的方法由于与安全性和稳定性相关的问题，在应用领域中也显示出局限性：由阿仑膦酸盐(ald)、二磷酸腺苷(adp)和三磷酸腺苷(atp)所组成的组中的配体作为交联剂来进行交联反应以制备交联的透明质酸，将其溶解，然后滴入多价阳离子。
6.此外，在一项用于预防组织黏连的水凝胶组合物的专利中，组合物由15wt％-30wt％的聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物、2.5wt％-4.5wt％的水不溶性相透明质酸(0.02wt％-0.1wt％的交联剂)和0.1wt％-1wt％的藻酸钠组成，交联的透明质酸为无定形凝胶而非球形，并且认为聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物处于15wt％-30wt％的量，是具有热敏性质的通常范围。
7.然而，透明质酸是一种具有相当高的亲水性的材料，并且通过通常已知的方法制备透明的、可高度溶胀的和均匀的球形珠存在局限性。由于处于油相的水相中的透明质酸
具有相当高的亲水性，因此难以通过溶剂蒸发法去除水分，并且当通过溶剂萃取法添加有机溶剂时，颗粒聚集在一起，使得难以制备具有均匀尺寸的珠。此外，迄今为止已知的使用透明质酸的珠的制备方法是：使用过量的阳离子物质，通过与阴离子透明质酸的离子键合，以不溶性沉淀形式制备；或使用过量的交联剂制备不溶性形式，用于通过干燥的物理造粒；或者通过将疏水性物质与透明质酸的羧基结合，然后溶解在有机溶剂中，经由溶剂萃取法制备，但由于粒径非常小、形状不均匀、在水溶液中的溶胀度非常低以及坚硬不透明的颗粒形式，这些方法在应用领域存在局限性。
8.如上所述，由于透明质酸独特的材料性质，现有技术不能应用于制备在水溶液中具有非常高溶胀度、同时保持均匀球形形状和透明度的珠的工艺。
9.此外，为了利用聚环氧乙烷(peo)-聚环氧丙烷(ppo)-聚环氧乙烷(peo)三嵌段共聚物来确保热敏性质，存在应使用13wt％-30wt％的高含量进行制备的限制。
技术实现要素：
技术目标
10.本公开的目的在于提供一种球形热敏透明质酸珠凝胶，其是透明的和可高度溶胀的，具有均匀的球形形状，通过交联，由于球形透明质酸珠凝胶的可调节的分解期、均匀的球形形状和尺寸可调性、以及优异的物理稳定性，确保了在体内和体外各种环境下的优异的生物相容性，从而可用于医疗器械、制药、化妆品和食品行业。技术方案
11.为实现上述目的，本公开提供了一种热敏透明质酸珠凝胶，其包含透明质酸和三嵌段共聚物，其中，在1hz下，通过频率扫描，所述热敏透明质酸珠凝胶在37℃时的储能模量值(g'，pa)是在25℃时的储能模量值的两倍以上。有益效果
12.球形热敏透明质酸珠凝胶具有高纯度和透明的球形形状，具有均匀、可选的尺寸，并表现出如下性质：即使在121℃的灭菌条件下形状也不变形，并且在生物相容性、黏弹性以及耐热和抗酶稳定性方面非常优异。
附图说明
13.图1示出了使用流变仪对实施例1以及对比例1、对比例2、对比例3、对比例4和对比例5制备的球形透明质酸珠凝胶进行温度扫描的结果的图。
14.图2示出了在光学显微镜下观察到的、在pbs中溶胀的透明的球形透明质酸珠凝胶的图。
15.图3示出了使用流变仪在25℃和37℃下对实施例1制备的球形热敏透明质酸珠凝胶进行频率扫描的结果的图。
16.图4示出了对实施例1以及对比例1、对比例2、对比例3、对比例4和对比例5制备的球形透明质酸珠凝胶进行挤压力测量的结果的图。
17.图5示出了观察实施例1制备的球形热敏透明质酸珠凝胶在穿过注射针后的状态的图。
具体实施方式
18.下面对本公开进行详细描述。
19.本公开提供了一种球形透明质酸珠凝胶，该球形透明质酸珠凝胶是通过如下制备的：在制备球形热敏透明质酸珠凝胶时，通过透明质酸溶液和油的类型以及相对比例来调整珠尺寸，而不在油相中使用乳化剂，并与少量具有两个以上环氧反应性基团(多官能环氧化合物)的交联剂化学结合。
20.本公开提供了一种含有透明质酸和三嵌段共聚物的热敏透明质酸珠凝胶。
21.透明质酸是指透明质酸或其盐，其中透明质酸的盐包括：无机盐，例如透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸钙、透明质酸镁、透明质酸锌和透明质酸钴；以及有机盐，例如透明质酸四丁基铵。
22.透明质酸或其盐的分子量不受特别限制，优选为100000道尔顿-5000000道尔顿。
23.三嵌段共聚物可以是1kda-500kda范围内的聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷。
24.热敏透明质酸珠凝胶可以包含8wt％-12wt％的三嵌段共聚物。
25.在1hz和37℃下，通过频率扫描，热敏透明质酸珠凝胶的储能模量值(g'，pa)可以为500pa-3000pa或700pa-2000pa。
26.此外，在1hz和25℃下，通过频率扫描，热敏透明质酸珠凝胶的储能模量值(g'，pa)可以为50pa-500pa或100pa-400pa。
27.在1hz下，通过频率扫描，热敏透明质酸珠凝胶在37℃时的储能模量值(g'，pa)可以是在25℃时的储能模量值的至少2倍、至少3倍、至少4倍、或5倍-10倍。
28.热敏透明质酸珠凝胶的平均直径优选为50μm-2000μm。根据球形透明质酸珠凝胶的尺寸，可以使医疗应用的范围多样化。
29.即使当施加10n-25n的压力时，热敏透明质酸珠凝胶可以保持其形状。
30.本公开的球形热敏透明质酸珠凝胶呈透明的球形形状，具有选定的尺寸和降解期，表现出优异的黏弹性和优异的生物相容性，并且对热和酶非常稳定。
31.具体而言，热敏透明质酸珠凝胶可以在120℃-125℃的温度下进行灭菌，在引入体内时没有副作用，提供用作皱纹改善填充剂、整形外科补充剂、关节注射剂和抗黏连剂的物理性质，用作将特定药物或细胞作为药物递送物或细胞递送物递送至特定生物位点的载体，也用作组织工程中的细胞支持物。
32.本公开的球形热敏透明质酸珠凝胶不采用以下的常规制备方法进行制备：即对球形珠的外部进行脂质化和包封的方法，使用乳化剂和表面活性剂的方法，使用过量的交联剂形成不溶性形式后通过干燥进行物理造粒的方法，以及将疏水性材料结合、溶解在有机溶剂中然后对相进行分离的制备方法。
33.此外，本公开的热敏透明质酸珠凝胶可通过进行以下步骤制备：第一步，通过将透明质酸、交联剂和碱性水溶液混合来进行反应；第二步，将反应混合物分散在油中，然后使混合物进行交联，以制备球形凝胶；第三步，回收所制备的球形凝胶，通过去除未反应物和杂质对其进行纯化；第四步，将纯化的球形凝胶与三嵌段共聚物混合。
34.第一步是通过将透明质酸、交联剂和碱性水溶液混合来进行反应，其中将透明质酸加入到碱性水溶液中，添加交联剂，然后将混合物均匀混合以进行反应物的反应。
35.由于透明质酸是同时包括酸形式和其盐的概念，在本公开的制备方法中，术语“透明质酸”包括所有透明质酸、透明质酸盐和透明质酸与透明质酸盐的混合物。
36.碱性水溶液不受特别限制，但具体使用诸如氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化铵的试剂。碱性水溶液的浓度不受特别限制，为了透明质酸的溶解和交联反应，优选为0.1n-10n。
37.交联剂可以为选自于由1,4-丁二醇二缩水甘油醚(bdde)、乙二醇二缩水甘油醚(egdge)、1,6-己二醇二缩水甘油醚、丙二醇二缩水甘油醚、聚丙二醇二缩水甘油醚、聚丁二醇二缩水甘油醚、新戊二醇二缩水甘油醚、聚甘油多缩水甘油醚、二甘油多缩水甘油醚、甘油多缩水甘油醚、三甲基丙烷多缩水甘油醚、1,2-(双(2,3-环氧丙氧基))乙烯、季戊四醇多缩水甘油醚和山梨糖醇多缩水甘油醚所组成的组中的一种或多种。
38.交联剂与透明质酸或其盐中的羟基反应形成醚键，在透明质酸或其盐之间形成交联。已知环氧官能团与醇之间的反应在高温碱性条件下进行，随着反应的进行，与透明质酸或其盐结合，没有副产物产生。然而，当反应效率低时，与透明质酸或其盐键合的交联剂的各种环氧官能团中的未反应的环氧官能团残留在透明质酸或其盐中，这种残留量的未反应的环氧官能团可能会在以后引起与体内物质的反应，从而需要使这些反应或额外的反应和工艺最少化，以将环氧官能团水解而转化为非活性官能团。此外，当添加过量的交联剂时，未反应的交联剂残留在透明质酸或其盐的交联材料中的风险非常高。因此，为了使这种风险最小化，不仅是从球形透明质酸珠凝胶的生物相容性的角度，还是从制造工艺效率的角度来看，都非常期望使用本文所述的适量的交联剂来诱导高效率的反应。
39.将均匀混合有交联剂的透明质酸或其盐的碱性水溶液与各种类型的油混合，适当搅拌，然后在一定温度下进行交联反应。随着溶剂逐渐蒸发，分散在油相中的透明质酸或其盐的碱性水溶液的浓度变高，并且随着实际反应浓度的提高，反应效率可以最大化，从而能够使用少量交联剂制备具有优异物理性质的球形透明质酸珠凝胶。因此，在上述透明质酸交联反应过程中，由于交联反应在相对高的浓度下进行(因为交联剂以低浓度混合并且溶剂蒸发)，因此能够利用使用低浓度交联剂时的优点和使用高浓度交联剂时的优点。这种球形透明质酸珠凝胶制备方法能够在保证交联反应效率的同时，制备具有坚固和特殊物理性质的球形透明质酸珠凝胶。
40.在第一步中，基于透明质酸的重复单元，交联剂可以以1eq％-30eq％的比例混合。如果交联剂的浓度在该范围内，则是期望的，因为它是具有高溶胀度且形状保持良好的安全的珠凝胶。另一方面，当其低于1eq％时，由于形状难以保持和容易分解的缺点，因此是不期望的，当其高于30eq％时，由于交联剂的大量使用而导致的副作用频率增加，同时由于硬度和低溶胀度，使用者便利性降低，因此是不期望的。
41.此外，在第一步中，对于透明质酸的浓度，可以相对于0.1n-10n的碱性水溶液以1wt％-30wt％的比例进行混合。如果透明质酸或其盐的浓度在上述范围内，使得能够进行均匀混合和反应，并且由于可以形成能够保持形状且同时具有高溶胀度的珠凝胶，因此是期望的。另一方面，如果其低于1wt％，由于交联较差而难以保持形状，因此是不期望的；如果其高于30wt％，除了交联过度导致的硬度之外，由于浓度过高导致难以均匀混合，因此发生不均匀反应。
42.反应混合物的交联反应期间的温度不受特别限制，但优选为5℃-50℃，更优选为15℃-40℃。此外，反应溶液中生成交联的持续时间也不受特别限制，但是反应时间越长，通
过碱性条件水解透明质酸所制备的球形透明质酸珠凝胶的物理黏弹性越低，因此第一步的反应时间可以为30分钟至24小时。
43.第二步是将反应物分散在油中，然后进行交联以制备球形凝胶。具体地，第二步的反应时间可以为1小时至96小时。
44.在第一步的交联反应之后，通过以分散在油中的状态再次进行交联反应，形成透明且具有非常高溶胀度的、处于均匀球形形状的球形热敏透明质酸珠凝胶，并且可以通过调节油和透明质酸溶液的比例来进行制备，而无需使用单独的乳化剂、表面活性剂和增溶剂。
45.油为选自于由矿物油、中链甘油三酯、鲱鱼油、亚麻籽油、椰子油、鳕鱼油(鱼油)、豆油、鲸油、棉籽油、芝麻油、花生油、橄榄油、猪油、棕榈油、玉米油、菜籽油、骨油、桐油和蓖麻油所组成的组中的一种或多种。
46.在第二步中，反应混合物与油可以以1:1-1:9的重量比混合。如果透明质酸或其盐的碱性水溶液与油的混合重量比在上述范围内，由于可以形成具有优异生产性的均匀的珠凝胶，因此是期望的。另一方面，如果透明质酸或其盐的碱性水溶液与油的混合重量比小于1:1，由于透明质酸或其盐的碱性水溶液的量超过油的量而导致聚集，难以在油相中均匀分散，因此是不期望的；如果其大于1:9，虽然透明质酸或其盐的碱性水溶液在油相中均匀分散，但由于相对体积而言生产率较低，因此是不期望的。
47.如上所述，当将反应混合物与各种类型的油混合时，可以调节混合时间和油与水溶液的比例，来控制球形透明质酸珠凝胶的物理性质。
48.而未添加乳化剂的球形透明质酸珠凝胶的尺寸通过搅拌速率、油的类型和油与水溶液的比例来调节，油的黏度越高，球形透明质酸珠凝胶的尺寸越小。这是因为随着两相之间的黏度差减小，具有比油相相对更高黏度的透明质酸及其盐的碱性水溶液分散得更顺畅。
49.此外，随着搅拌速率的增加，珠的尺寸减小，透明质酸及其盐的碱性水溶液的黏度低。
50.第三步是纯化操作，其中将第二步制备的球形凝胶回收，去除未反应物和杂质。
51.第三步通过以下操作来纯化球形凝胶：(a)使用选自于由蒸馏水、酸性溶液、添加有酸性盐的水溶液和磷酸盐缓冲盐水所组成的组中的一种或多种，对第二步中制备的球形凝胶进行初步洗涤；(b)用有机溶剂水溶液，对经初步洗涤的球形凝胶进行二次洗涤；以及(c)使用选自蒸馏水、酸性溶液、添加有酸性盐的水溶液和磷酸盐缓冲盐水中的一种或多种，对经二次洗涤的球形凝胶进行三次洗涤。
52.在操作(a)和(c)中，使用蒸馏水、酸性溶液或添加有酸性盐的水溶液以及磷酸盐缓冲盐水独立地进行多次洗涤，以去除未反应的交联剂和氢氧根离子。
53.通过使用添加有盐的水溶液，可以提高未反应物的清洗效率，其中含有磷酸盐的氯化钠水溶液、磷酸水溶液以及氯化钠水溶液最适合。
54.有机溶剂可以包括选自二甲基亚砜(dmso)、二甲基甲酰胺(dmf)、乙腈、甲醇、四氢呋喃(thf)、丙酮、丙酮水溶液和2-6个碳原子的醇中的一种或多种。在操作(b)中，有机溶剂水溶液用于去除油。
55.在有机溶剂水溶液中，有机溶剂与蒸馏水的重量比可以为9:1-1:9。如果蒸馏水与
有机溶剂的重量比在上述范围内，由于珠凝胶适当溶胀，使其易于去除油和杂质，因此是期望的。另一方面，如果有机溶剂与蒸馏水的重量比大于9:1，由于有机溶剂的重量比高，珠凝胶不能充分溶胀，并且由于油和杂质不容易去除，因此是不期望的；如果其小于1:9，由于有机溶剂的重量比低，油和杂质不容易去除，因此是不期望的。
56.如上所述，根据反应物在有机溶剂和油中混合的特点，制备的球形透明质酸珠凝胶的物理性质可以变化，有机溶剂的极性指数越接近蒸馏水，制备的球形透明质酸珠凝胶的透明度越高，复合黏度越低，从而能够制备具有各种物理性质的球形透明质酸珠凝胶。
57.第四步是通过将纯化的球形凝胶与三嵌段共聚物混合，来制备热敏透明质酸珠凝胶。
58.具体而言，球形热敏透明质酸珠凝胶可以通过如下来制备：将纯化的球形凝胶在缓冲溶液中溶胀，与三嵌段共聚物混合，使三嵌段共聚物渗入溶胀的透明质酸珠凝胶中，然后在120℃-125℃的温度下灭菌。
59.可替代地，球形热敏透明质酸珠凝胶可以通过如下来制备：使用有机溶剂或有机溶剂水溶液，回收处于沉淀状态的纯化的球形透明质酸珠凝胶，通过氮气、空气、热和减压进行干燥，根据医疗应用目的按尺寸和形状对球形热敏透明质酸珠凝胶进行分选，用缓冲溶液溶胀，与用于制备的热敏合成聚合物混合，然后在120℃-125℃的温度下灭菌。
60.作为用于使球形透明质酸珠凝胶沉淀的有机溶剂，可以使用二甲基亚砜(dmso)、二甲基甲酰胺(dmf)、乙腈、甲醇、四氢呋喃(thf)、丙酮、丙酮水溶液、2-6个碳原子的醇(例如乙醇)、或醇水溶液。此外，缓冲溶液可以是磷酸盐缓冲盐水(pbs)。
61.在第四步中，三嵌段共聚物可以以80mg/ml-120mg/ml或90mg/ml-110mg/ml的浓度混合。
62.三嵌段共聚物可以是1kda-500kda范围内的聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷。实施方式
63.以下，将通过示例实施例对本公开进行更详细地描述。这些示例实施例仅旨在对本公开进行更详细地描述，并且对于本领域技术人员来说显而易见的是，根据本公开的主旨，本公开的范围不受这些示例实施例的限制。
[0064][0065]
实施例
[0066]
[实施例1]球形热敏透明质酸珠凝胶的制备
[0067]
将透明质酸钠(分子量：1000000)以50mg/ml的浓度加入到166ml的0.25n naoh溶液中，同时加入0.4183g丁二醇二缩水甘油醚(bdde)(bdde与透明质酸重复单元的当量比：10mol％)。通过行星式离心混合器混合30分钟后，在40℃下进行第一步反应1小时。将反应物滴加到332g mct油上。在700rpm下搅拌的同时，在40℃进行第二步反应24小时。
[0068]
24小时后，缓慢加入500ml异丙醇，以将分散在混合溶液中的透明质酸珠回收。使用异丙醇进行三次洗涤。将回收的透明质酸珠每次用5l的pbs洗涤五次。通过向洗涤后的透明质酸珠中加入1l异丙醇进行沉淀。进行异丙醇置换，重复三次。向沉淀物中加入1.5l的30％异丙醇，溶胀1小时。溶胀后，进行异丙醇置换，重复三次。再将沉淀物每次用5l的pbs洗涤五次。
[0069]
将部分洗涤后的球形透明质酸珠凝胶在pbs中溶胀，然后向珠凝胶中加入pluronic f127，使其成为100mg/ml，然后在121℃下进行灭菌，以制备球形热敏透明质酸珠凝胶，其中，使其它球形透明质酸珠凝胶中的一些进行有机溶剂沉淀过程、氮气干燥过程、分选过程、pbs再溶胀过程和121℃灭菌过程，以制备尺寸和形状适合各应用的球形透明质酸珠凝胶。
[0070]
[对比例1]球形透明质酸珠凝胶的制备
[0071]
将透明质酸钠(分子量：1000000)以50mg/ml的浓度加入到166ml的0.25n naoh溶液中，同时加入0.4183g丁二醇二缩水甘油醚(bdde)(bdde与透明质酸重复单元的当量比：10mol％)。通过行星式离心混合器混合30分钟后，在40℃下进行第一步反应1小时。将反应物滴加到332g mct油上。在700rpm下搅拌的同时，在40℃进行第二步反应24小时。
[0072]
24小时后，缓慢加入500ml异丙醇，以将分散在混合溶液中的透明质酸珠回收。使用异丙醇进行三次洗涤。将回收的透明质酸珠每次用5l pbs洗涤五次。通过向洗涤后的透明质酸珠中加入1l异丙醇进行沉淀。进行异丙醇置换，重复三次。向沉淀物中加入1.5l的30％异丙醇，溶胀1小时。溶胀后，进行异丙醇置换，重复三次。再将沉淀物每次用5l的pbs洗涤五次。
[0073]
将部分洗涤后的球形透明质酸珠凝胶在pbs中溶胀，然后向珠凝胶中加入pluronic f127，使其成为25mg/ml，然后在121℃下进行灭菌，以制备球形热敏透明质酸珠凝胶，其中，使其它球形透明质酸珠凝胶中的一些进行有机溶剂沉淀过程、氮气干燥过程、分选过程、pbs再溶胀过程和121℃灭菌过程，以制备尺寸和形状适合各应用的球形透明质酸珠凝胶。
[0074]
[对比例2]球形透明质酸珠凝胶的制备
[0075]
将透明质酸钠(分子量：1000000)以50mg/ml的浓度加入到166ml的0.25n naoh溶液中，同时加入0.4183g丁二醇二缩水甘油醚(bdde)(bdde与透明质酸重复单元的当量比：10mol％)。通过行星式离心混合器混合30分钟后，在40℃下进行第一步反应1小时。将反应物滴加到332g mct油上。在700rpm下搅拌的同时，在40℃进行第二步反应24小时。
[0076]
24小时后，缓慢加入500ml异丙醇，以将分散在混合溶液中的透明质酸珠回收。使用异丙醇进行三次洗涤。将回收的透明质酸珠每次用5l的pbs洗涤五次。通过向洗涤后的透明质酸珠中加入1l异丙醇进行沉淀。进行异丙醇置换，重复三次。向沉淀物中加入1.5l的30％异丙醇，溶胀1小时。溶胀后，进行异丙醇置换，重复三次。再将沉淀物每次用5l的pbs洗涤五次。
[0077]
将部分洗涤后的球形透明质酸珠凝胶在pbs中溶胀，然后向珠凝胶中加入pluronic f127，使其成为50mg/ml，然后在121℃下进行灭菌，以制备球形热敏透明质酸珠凝胶，其中，使其它球形透明质酸珠凝胶中的一些进行有机溶剂沉淀过程、氮气干燥过程、分选过程、pbs再溶胀过程和121℃灭菌过程，以制备尺寸和形状适合各应用的球形透明质酸珠凝胶。
[0078]
[对比例3]球形透明质酸珠凝胶的制备
[0079]
将透明质酸钠(分子量：1000000)以50mg/ml的浓度加入到166ml的0.25n naoh溶液中，同时加入0.4183g丁二醇二缩水甘油醚(bdde)(bdde与透明质酸重复单元的当量比：10mol％)。通过行星式离心混合器混合30分钟后，在40℃下进行第一步反应1小时。将反应
物滴加到332g mct油上。在700rpm下搅拌的同时，在40℃进行第二步反应24小时。
[0080]
24小时后，缓慢加入500ml异丙醇，以将分散在混合溶液中的透明质酸珠回收。使用异丙醇进行三次洗涤。将回收的透明质酸珠每次用5l pbs洗涤五次。通过向洗涤后的透明质酸珠中加入1l异丙醇进行沉淀。进行异丙醇置换，重复三次。向沉淀物中加入1.5l的30％异丙醇，溶胀1小时。溶胀后，进行异丙醇置换，重复三次。再将沉淀物每次用5l的pbs洗涤五次。
[0081]
将部分洗涤后的球形透明质酸珠凝胶在pbs中溶胀，然后向珠凝胶中加入pluronic f127，使其成为75mg/ml，然后在121℃下进行灭菌，以制备球形热敏透明质酸珠凝胶，其中，使其它球形透明质酸珠凝胶中的一些进行有机溶剂沉淀过程、氮气干燥过程、分选过程、pbs再溶胀过程和121℃灭菌过程，以制备尺寸和形状适合各应用的球形透明质酸珠凝胶。
[0082]
[对比例4]球形透明质酸珠凝胶的制备
[0083]
将透明质酸钠(分子量：1000000)以50mg/ml的浓度加入到166ml的0.25n naoh溶液中，同时加入0.4183g丁二醇二缩水甘油醚(bdde)(bdde与透明质酸重复单元的当量比：10mol％)。通过行星式离心混合器混合30分钟后，在40℃下进行第一步反应1小时。将反应物滴加到332g mct油上。在700rpm下搅拌的同时，在40℃进行第二步反应24小时。
[0084]
24小时后，缓慢加入500ml异丙醇，以将分散在混合溶液中的透明质酸珠回收。使用异丙醇进行三次洗涤。将回收的透明质酸珠每次用5l pbs洗涤五次。通过向洗涤后的透明质酸珠中加入1l异丙醇进行沉淀。进行异丙醇置换，重复三次。向沉淀物中加入1.5l的30％异丙醇，溶胀1小时。溶胀后，进行异丙醇置换，重复三次。再将沉淀物每次用5l的pbs洗涤五次。
[0085]
将部分洗涤后的球形透明质酸珠凝胶在pbs中溶胀，然后向珠凝胶中加入pluronic f127，使其成为125mg/ml，然后在121℃下进行灭菌，以制备球形热敏透明质酸珠凝胶，其中，使其它球形透明质酸珠凝胶中的一些进行有机溶剂沉淀过程、氮气干燥过程、分选过程、pbs再溶胀过程和121℃灭菌过程，以制备尺寸和形状适合各应用的球形透明质酸珠凝胶。
[0086]
[对比例5]球形透明质酸珠凝胶的制备
[0087]
将透明质酸钠(分子量：1000000)以50mg/ml的浓度加入到166ml的0.25n naoh溶液中，同时加入0.4183g丁二醇二缩水甘油醚(bdde)(bdde与透明质酸重复单元的当量比：10mol％)。通过行星式离心混合器混合30分钟后，在40℃下进行第一步反应1小时。将反应物滴加到332g mct油上。在700rpm下搅拌的同时，在40℃进行第二步反应24小时。
[0088]
24小时后，缓慢加入500ml异丙醇，以将分散在混合溶液中的透明质酸珠回收。使用异丙醇进行三次洗涤。将回收的透明质酸珠每次用5l pbs洗涤五次。通过向洗涤后的透明质酸珠中加入1l异丙醇进行沉淀。进行异丙醇置换，重复三次。向沉淀物中加入1.5l的30％异丙醇，溶胀1小时。溶胀后，进行异丙醇置换，重复三次。再将沉淀物每次用5l的pbs洗涤五次。
[0089]
将部分洗涤后的球形透明质酸珠凝胶在pbs中溶胀，然后向珠凝胶中加入pluronic f127，使其成为150mg/ml，然后在121℃下进行灭菌，以制备球形热敏透明质酸珠凝胶，其中，使其它球形透明质酸珠凝胶中的一些进行有机溶剂沉淀过程、氮气干燥过程、
分选过程、pbs再溶胀过程和121℃灭菌过程，以制备尺寸和形状适合各应用的球形透明质酸珠凝胶。
[0090][0091]
[实验例]实施例1中制备的球形热敏透明质酸珠凝胶与对比例1、对比例2、对比例3、对比例4和对比例5中制备的球形透明质酸珠凝胶的物理性质的比较
[0092]
经确定，实施例1以及对比例1、对比例2、对比例3、对比例4和对比例5中制备的热敏透明质酸珠凝胶呈球形(图2)。
[0093]
为了鉴定实施例1以及对比例1、对比例2、对比例3、对比例4和对比例5中制备的球形热敏透明质酸珠凝胶的流变学性质，使用流变仪通过温度扫描(1hz，频率)来鉴定从25℃到40℃时储能模量值(g'，pa)随温度的变化(图1，表1)。观察到实施例1中的物理性质随温度发生了显著变化，并通过在25℃和37℃下以0.02hz-1hz的频率进行频率扫描来进行测量(复数模量、储能模量和损耗模量)(图3)，发现在37℃下表现出高物理性质。
[0094]
参考图3，在1hz-0.02hz的整个区域内，储能模量的值均保持高于损耗模量的值，因此由于高弹性模量而显示出优异的黏弹性和良好的形状保持能力，同时储能模量(pa)随着温度的升高从105.4增加到1023，从而显示出作为凝胶型组织修复材料的优异性能。
[0095]
表1
[0096]
作为对实施例1以及对比例1、对比例2、对比例3、对比例4和对比例5中制备的球形热敏透明质酸珠凝胶的挤压力进行测量的结果(图5)，实施例1中配置27g针时为7.14n
±
2.39n，对比例1中配置27g针时为10.31n
±
2.55n，对比例2中配置27g针时为8.79n
±
2.55n，对比例3中配置27g针时为10.09n
±
2.49n，对比例4中配置27g针时为12.91n
±
1.09n，对比例5中配置27g针时为12.79n
±
2.15n，与目前市场上销售的主要产品的挤压力10n-20n的值相比，以更低的结果显示出优异的可用性。经确定，实施例1中制备的球形热敏透明质酸珠凝胶即使在穿过27g针之后也很好地保持球形形状，不发生形变(图5)。
[0097]
这表明，即便是在配置针的程序之后，即使在图5中的25n的最大挤压力下，球形珠的形状也不会改变；并且珠凝胶的弹性是优异的，足以维持球形形状，使得即使在处理部位施加外部冲击时也能够保持球形形状。
[0098]
如上所述，已经对本公开的具体部分进行了详细描述，对于本领域技术人员来说显而易见的是，这样的具体描述仅仅是优选的示例实施例，并且本公开的范围不受此限制。因此，本公开的实质范围将由所附权利要求及其等同物来定义。
[0099]
本公开的范围由以下描述的权利要求来表明，并且权利要求的含义和范围以及源自其等效概念的所有改变或修改形式应当被解释为包括在本公开的范围内。