al,clinical lymphoma,myeloma&leukemia,2015,s167；berger c et al,cancer immunol.res.,2015,3,206)。
6.单结构域结合分子可以源自不同物种的一系列蛋白质。免疫球蛋白同位素新抗原受体(ignar)是一种同型二聚体重链复合物，最初发现于护士鲨(铰口鲨(ginglymostoma cirratum))以及其他鲨鱼和鳐鱼物种的血清中。ignar不包含轻链，与典型的免疫球蛋白结构不同。每个分子由单可变结构域(vnar)和五个恒定结构域(cnar)组成。文献中的命名法将ignar称为免疫球蛋白同位素新抗原受体或免疫球蛋白同位素新抗原受体，并且这些术语是同义的。
7.鲨鱼ignar主要有三种已定义的类型，称为i型、ii型和iii型(kovalena et al,exp opin biol ther2014 14(10)1527-1539)。这些是根据非典型半胱氨酸残基的位置进行分类的，这些残基处于强选择压力下，因此很少被替换。
8.所有三种类型均在位置35和107处具有经典的免疫球蛋白典型半胱氨酸，与位置36处的不变色氨酸一起使标准免疫球蛋白折叠稳定。没有定义的cdr2，但在框架2和框架3中分别定义了相比较为接近的序列变异区域tcr hv2和hv4。i型在框架2和框架4中具有种系编码的半胱氨酸残基，并且在cdr3中具有偶数个额外的半胱氨酸。溶菌酶分离的以及与溶菌酶复合的i型ignar的晶体结构研究使得能够确定这些半胱氨酸残基的贡献。框架2和4半胱氨酸均与cdr3中的半胱氨酸形成二硫桥，从而形成cdr3环被紧紧地压向hv2区域的紧密堆积结构，其中。迄今为止，仅在护士鲨中发现了i型ignar，而所有其他软骨鱼，包括同一目的成员，仅具有ii型或该类型的变种。
9.ii型ignar被定义为在cdr1和cdr3中具有半胱氨酸残基，该半胱氨酸残基形成分子内二硫键，使这两个区域紧密靠近，从而形成有利于结合口袋或凹槽的突出的cdr3。i型序列通常比ii型序列具有更长的cdr3，平均分别为21个和15个残基。这被认为是由于i型cdr3中两个或更多个半胱氨酸残基与它们的框架2和4对应物缔合的强选择压力。对体细胞突变积累的研究表明，ii型cdr1的突变数量比i型多，而i型hv2区域的序列变异比ii型更大。该证据与这些区域在抗原结合位点内的确定定位密切相关。第三种ignar类型(称为iii型)已在新生儿中被发现。由于d1和d2区域(形成cdr3)与v基因的种系融合，ignar家族的该成员在cdr3内缺乏多样性。几乎所有已知克隆的cdr3长度均为15个残基，几乎没有或没有序列多样性。
10.vnar的另一种结构类型，称为类型(iib或iv)，仅具有两个典型半胱氨酸残基(在框架1和框架3b区域中)。到目前为止，这种类型主要在角鲨中发现，并且还从源自须鲨的半合成v-nar文库中分离出来。
11.ror1特异性抗原结合分子，包括vnar，描述于wo2019/122447中，其全部内容通过引用并入本文。其中，wo2019/122447描述了下文鉴别的b1和p3a1 g1的序列。
12.b1
13.asvnqtprtatketgesltincvvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypwgagapwlvqwydgagtvltvn(seq id no：113)
14.p3a1 g1
15.trvdqspsslsasvgdrvtitcvltdtsyglystywyrknpgssnkeqisisgrysesvnkgtksftltisslqpedsatyycrarearhpwlrqwydgagtkveik(seq id no：114)。
16.ror1特异性抗原结合分子(包括vnar)的缀合物描述于2020年6月19日提交的pct/ep2020/067210中，其全部内容通过引用并入本文。pct/ep2020/067210描述了适用于药物缀合物的蒽环类(pnu)衍生物。具体地，提供了pnu159682的衍生物，其缺乏c14碳和连接的羟基官能团，并且其中乙二胺(eda)基团形成pnu159682的c13羰基和马来酰亚胺基团之间的接头区域的一部分。或者，相同的分子可以用eda-pnu作为“弹头(warhead)”来描述，使得eda基团不被认为是接头区域的一部分。当接头包含val-cit-pab时，马来酰亚胺基团可以被适合于缀合反应的任何反应基团取代。此类有效负载(payload)能够与另一个分子上的游离硫醇基团反应。当游离硫醇位于蛋白质上时，可以形成蛋白质-药物缀合物(pdc)。
17.蒽环类衍生物pnu-159682已被描述为奈莫柔比星的代谢物(quintieri et al.(2005)clin.cancer res.11,1608-1617)，并据报道表现出在皮摩尔至飞摩尔范围内对一种卵巢(a2780)和一种乳腺癌(mcf7)细胞系极高的体外细胞杀伤效力(wo2012/073217a1)。pnu-159682的衍生物也已描述于wo2016/102679中。
18.pnu-159682衍生物与抗体的缀合描述于wo2009/099741、wo2016/127081和wo2016/102679、yu et al,clin.cancer res 2015,21,3298和stefan et al,mol.cancer.ther.,2017,16,879。
19.本文描述了具有改善的特性的ror1特异性变体抗原结合分子及其与pnu-159682衍生物的缀合物。
技术实现要素：
20.本发明一般涉及特异性抗原结合分子。
21.根据第一方面，本发明提供了一种受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)特异性抗原结合分子，其包含式(i)所示的氨基酸序列：
22.fw1-cdr1-fw2-hv2-fw3a-hv4-fw3b-cdr3-fw4
ꢀꢀꢀꢀꢀ(i)23.其中
24.cdr3是具有选自由ypwgagapynvqwy(seq id no：23)、ypwgagapylvqwy(seq id no：20)、ypwgagapwnvqwy(seq id no：24)、ypsgagaprpvqwy(seq id no：11)、ypwgagapclvqwy(seq id no：12)、ypwgagaprlvqwy(seq id no：13)、ypwgagaprqvqwy(seq id no：14)、ypwgagaprsvqwy(seq id no：15)、ypwgagapslvqwy(seq id no：16)、ypwgagapsnvqwy(seq id no：17)、ypwgagapsqvqwy(seq id no：18)、ypwgagapssvqwy(seq id no：19)、ypwgagapwqvqwy(seq id no：21)、ypwgagapwsvqwy(seq id no：22)和ypwgagapwlvqwy(seq id no：10)组成的组中的氨基酸序列的cdr序列；
25.cdr1是具有选自由ganyglaa(seq id no：1)、danyglaa(seq id no：5)、ganydlsa(seq id no：2)、ganyglsa(seq id no：3)和ganydlaa(seq id no：4)组成的组中的氨基酸序列的cdr序列；
26.fw1是框架区；
27.fw2是框架区；
28.hv2是具有选自由ssnqerisis(seq id no：6)和ssnkerisis(seq id no：7)组成的组中的氨基酸序列的高变序列；
29.fw3a是框架区；
30.hv4是具有选自由nkrtm(seq id no：8)和nkgtm(seq id no：9)组成的组中的氨基酸序列的高变序列；
31.fw3b是框架区；
32.fw4是框架区；
33.其中如果cdr3是ypwgagapwlvqwy(seq id no：10)，则cdr1选自由danyglaa(seq id no：5)、ganyglsa(seq id no：3)和ganydlaa(seq id no：4)组成的组。
34.根据第二方面，本发明提供了一种受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)特异性抗原结合分子，其包含式(i)所示的氨基酸序列：
35.fw1-cdr1-fw2-hv2-fw3a-hv4-fw3b-cdr3-fw4
ꢀꢀꢀꢀ(i)36.其中
37.cdr1是具有选自由gtryglys(seq id no：25)、gtryglyss(seq id no：26)、dtryalys(seq id no：27)、dtryalyss(seq id no：28)、gtkyglya(seq id no：29)和gtkyglyas(seq id no：30)组成的组中的氨基酸序列的cdr序列；
38.fw1是框架区；
39.fw2是框架区；
40.hv2是具有选自由ssdeerisis(seq id no：31)、stdeerisig(seq id no：32)、spnkdrmiig(seq id no：33)和stdkeriiig(seq id no：34)组成的组中的氨基酸序列的高变序列；
41.fw3a是框架区；
42.hv4是具有选自由nkgtk(seq id no：35)、nkgsk(seq id no：36)、nngtk(seq id no：37)和nnrsk(seq id no：38)组成的组中的氨基酸序列的高变序列；
43.fw3b是框架区；
44.cdr3是具有根据rearhpwlrqwy(seq id no：39)的氨基酸序列的cdr序列；
45.fw4是框架区。
46.根据第三方面，本发明提供了一种包含根据本发明第一或第二方面的特异性抗原结合分子的重组融合蛋白。
47.根据第四方面，本发明提供了一种重组融合蛋白，包含抗原结合分子或其功能变体，所述抗原结合分子包含式(i)所示的氨基酸序列：
48.fw1-cdr1-fw2-hv2-fw3a-hv4-fw3b-cdr3-fw4
ꢀꢀꢀꢀ(i)49.其中
50.fw1是框架区；
51.cdr1是cdr序列；
52.fw2是框架区；
53.hv2是高变序列；
54.fw3a是框架区；
55.hv4是高变序列；
56.fw3b是框架区；
57.cdr3是cdr序列；
58.fw4是框架区；
59.其中所述抗原结合分子与免疫球蛋白fc区的片段融合，其中免疫球蛋白fc区的片段被工程改造以与免疫球蛋白fc区的第二片段二聚化。
60.根据第五方面，本发明提供了一种重组融合蛋白二聚体，其包含：
61.(a)第一重组融合蛋白，其中第一重组融合蛋白是根据第三或第四方面的重组融合蛋白，和
62.(b)第二重组融合蛋白，其中第二重组融合蛋白包含与免疫球蛋白fc区的第二片段融合的第二抗原结合分子，所述免疫球蛋白fc区的第二片段被工程改造以与免疫球蛋白fc区的第一片段二聚化。
63.根据第六方面，本发明提供了一种ror1特异性嵌合抗原受体(car)，其包含与至少一个跨膜区和至少一个胞内结构域融合或缀合的至少一种如本发明第一或第二方面所定义的ror1特异性抗原结合分子。
64.本发明还提供了包含根据第六方面的嵌合抗原受体的细胞，该细胞优选是工程改造的t细胞。
65.在本发明的第七方面，提供了一种核酸序列，其包含编码根据本发明的第一、第二、第三、第四、第五或第六方面的特异性抗原结合分子、重组融合蛋白、重组融合蛋白二聚体或嵌合抗原受体的多核苷酸序列。
66.还提供了包含根据第七方面的核酸序列的运载体(vector)和包含此类核酸的宿主细胞。
67.提供了用于制备第一、第二、第三、第四、第五或第六方面的特异性抗原结合分子、重组融合蛋白、重组融合蛋白二聚体或嵌合抗原受体的方法，该方法包括将包含上述多核苷酸或运载体的宿主细胞在使得所述宿主细胞产生特异性抗原结合分子、重组融合蛋白或嵌合抗原受体的条件下培养或维持，任选地，该方法还包括分离特异性抗原结合分子、重组融合蛋白、重组融合蛋白二聚体或嵌合抗原受体。
68.在本发明的第八方面，提供了包含第一、第二、第三、第四、第五或第六方面的特异性抗原结合分子、融合蛋白、重组融合蛋白二聚体或嵌合抗原受体的药物组合物。药物组合物可以含有多种药学上可接受的载体(carrier)。本发明的药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法施用，包括但不限于静脉内、肌内、口服、腹膜内或局部施用。在优选的实施方式中，药物组合物可以以液体、凝胶、粉末、片剂、胶囊或泡沫的形式制备。
69.第一、第二、第三、第四、第五或第六方面的特异性抗原结合分子、重组融合蛋白、重组融合蛋白二聚体或嵌合抗原受体可以用于治疗。更具体地，第一、第二、第三、第四、第五或第六方面的特异性抗原结合分子、重组融合蛋白、重组融合蛋白二聚体或嵌合抗原受体可以用于治疗癌症。优选地，癌症是ror1阳性癌症类型。更优选地，癌症选自包括以下的组：血癌，如淋巴瘤和白血病、慢性淋巴细胞白血病(cll)、套细胞淋巴瘤(mcl)、b细胞急性淋巴细胞白血病(b-all)、边缘区淋巴瘤(mzl)、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、急性髓性白血病(aml)；和实体瘤，包括神经母细胞瘤、肾癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、皮肤癌、子宫癌、前列腺癌、甲状腺癌、头颈癌、膀胱癌、食道癌、胃癌或肝癌。
70.本文还提供了第一、第二、第三、第四、第五或第六方面的特异性抗原结合分子、重组融合蛋白、重组融合蛋白二聚体或嵌合抗原受体在制备用于治疗有需要的患者的疾病的药物中的用途。
71.第一、第二、第三、第四、第五、第六方面的特异性抗原结合分子、重组融合蛋白、重组融合蛋白二聚体或嵌合抗原受体或第八方面的药物组合物可以以单剂量施用。如本文所用，“单剂量”是指由一剂组成的剂量方案。可选择地，可以使用多剂量方案。不受理论的束缚，当第一、第二、第三、第四、第五、第六方面的特异性结合分子、重组融合蛋白、重组融合蛋白二聚体或嵌合抗原受体或第八方面的药物组合物以单剂量施用时，其优点可以是特别明显的。
72.此外，根据本发明，提供了治疗需要治疗的患者的疾病的方法，该方法包括向所述患者施用治疗有效剂量的第一、第二、第三、第四、第五或第六方面的特异性抗原结合分子、重组融合蛋白、重组融合蛋白二聚体或嵌合抗原受体或第八方面的药物组合物。
73.优选地，癌症是ror1阳性癌症类型。更优选地，癌症选自包括以下的组：血癌，如淋巴瘤和白血病、慢性淋巴细胞白血病(cll)、套细胞淋巴瘤(mcl)、b细胞急性淋巴细胞白血病(b-all)、边缘区淋巴瘤(mzl)、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、急性髓性白血病(aml)；和实体瘤，包括神经母细胞瘤、肾癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、皮肤癌、子宫癌、前列腺癌、甲状腺癌、头颈癌、膀胱癌、食道癌、胃癌或肝癌。
74.本文还提供了一种测定样品中目标分析物的存在的方法，其包括将具有可检测标记的第一方面或第二方面的特异性抗原结合分子或第三或第四方面的重组融合蛋白或第五方面的重组融合蛋白二聚体添加到样品中并检测分子与目标分析物的结合。
75.另外，本文提供了一种对对象的疾病部位进行成像的方法，其包括将具有可检测标记的第一方面或第二方面的特异性抗原结合分子或具有可检测标记的第三方面或第四方面的重组融合蛋白或第五方面的重组融合蛋白二聚体施用至对象。
76.本文还提供了诊断对象的疾病或医学状况的方法，包括施用第一方面或第二方面的特异性抗原结合分子或第三方面或第四方面的重组融合蛋白或第五方面的重组融合蛋白二聚体。
77.本文还涵盖了一种抗体、抗体片段或抗原结合分子，其与第一或第二方面的ror1特异性抗原结合分子竞争结合ror1。当在抗原结合蛋白(例如，中和性抗原结合蛋白或中和抗体)的背景下使用时，术语“竞争”意指抗原结合蛋白之间的竞争，其通过测定所确定，该测定中被测抗原结合蛋白(例如抗体或其功能片段)阻止或抑制本文定义的抗原结合分子(例如，第一方面的特异性抗原结合分子)与共同抗原(例如，在第一或第二方面的特异性抗原结合分子的情况下是ror1)的特异性结合。
78.本文还描述了一种用于诊断患有癌症或癌症的倾向的对象、或用于提供所述对象的状况的预后的试剂盒，该试剂盒包含用于检测来自测试对象的样品中存在的抗原的浓度的检测工具，其中检测工具包含第一或第二方面的ror1特异性抗原结合分子、第三或第四方面的重组融合蛋白、或第五方面的重组融合蛋白二聚体、第六方面的嵌合抗原受体或第七方面的核酸序列，所述ror1特异性抗原结合分子、重组融合蛋白、重组融合蛋白二聚体、嵌合抗原受体或核酸序列各自任选地衍生化，其中样品中存在抗原表明该对象患有癌症。优选地，抗原包括ror1蛋白，更优选地包括其胞外结构域。更优选地，该试剂盒用于鉴定样品中是否存在ror1阳性细胞，或确定样品中其浓度。试剂盒还可以包含用来比较测定的阳性对照和/或阴性对照和/或可以检测的标记。
79.本发明还提供了一种用于诊断患有癌症或癌症的倾向的对象、或用于提供所述对
象的状况的预后的方法，该方法包括检测从对象获得的样品中存在的抗原的浓度，其中检测是使用第一或第二方面的ror1特异性抗原结合分子、第三或第四方面的重组融合蛋白、或第五方面的重组融合蛋白二聚体、第六方面的嵌合抗原受体或第七方面的核酸序列实现的，所述ror1特异性抗原结合分子、重组融合蛋白、重组融合蛋白二聚体、嵌合抗原受体或核酸序列各自任选地衍生化，并且其中样品中存在抗原表明该对象患有癌症。
80.本文还考虑了一种在体外或在患者体内杀伤表达ror1的细胞或抑制其生长的方法，该方法包括向细胞施用药学有效量或剂量的(i)第一或第二方面的ror1特异性抗原结合分子、第三或第四方面的重组融合蛋白、或第五方面的重组融合蛋白二聚体、第七方面的核酸序列，或第六方面的car或细胞，或(ii)第八方面的药物组合物。优选地，表达ror1的细胞是癌细胞。更优选地，ror1是人ror1。
81.根据第九方面，本发明提供了一种特异性抗原结合分子，其包含式(ii)所示的氨基酸序列：
82.x-fw1-cdr1-fw2-hv2-fw3a-hv4-fw3b-cdr3-fw4-y
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(ii)
83.其中
84.fw1-cdr1-fw2-hv2-fw3a-hv4-fw3b-cdr3-fw4是根据第一或第二方面的ror1特异性抗原结合分子，
85.x和y是任选的氨基酸序列，
86.其中所述特异性抗原结合分子与第二部分缀合。
87.根据第十方面，本发明提供了一种靶标结合分子-药物缀合物，其包含：
88.(a)根据第一、第二或第九方面的ror1特异性抗原结合分子，或第三或第四方面的重组融合蛋白，或第五方面的重组融合蛋白二聚体，和
89.(b)蒽环类(pnu)衍生物，
90.其中，靶标结合分子-药物缀合物具有式(iii)的结构：
[0091][0092]
其中[x]是选自包含以下的组中的任选的间隔物：取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、一个或多个杂原子、聚乙二醇或其组合；
[0093]
[l1]和[l2]是选自由以下组成的组中的任选的接头：缬氨酸(val)、瓜氨酸(cit)、丙氨酸(ala)、天冬酰胺(asn)、肽、-(ch2)
n-、-(ch2ch2o)
n-、对氨基苄氧基羰基(pab)、val-cit-pab、val-ala-pab、ala-ala-asn-pab、val-ala、asn-ala、除甘氨酸外的任何氨基酸，及
其组合；以及
[0094]
y包含根据第一、第二或第九方面的ror1特异性抗原结合分子，或第三或第四方面的重组融合蛋白，或第五方面的重组融合蛋白二聚体。
[0095]
根据第十一方面，本发明提供了一种靶标结合分子-药物缀合物，其包含：
[0096]
(a)根据第一、第二或第九方面的ror1特异性抗原结合分子，或根据第三或第四方面的重组融合蛋白，或第五方面的重组融合蛋白二聚体，和
[0097]
(b)蒽环类(pnu)衍生物，
[0098]
其中，所述靶标结合分子-药物缀合物具有式(iv)的结构：
[0099][0100]
其中[x]是选自包含以下的组的任选的间隔物：取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、一个或多个杂原子、聚乙二醇或其组合；
[0101]
[z]是衍生自反应基团的接头，所述反应基团用于缀合所述蒽环类(pnu)衍生物和所述靶标结合分子；以及
[0102]
y包含根据第一、第二或第九方面的ror1特异性抗原结合分子，或根据第三或第四方面的重组融合蛋白，或第五方面的重组融合蛋白二聚体。
附图说明
[0103]
图1：b1环文库的设计：示出了b1的序列，其中“x”表示cdr1和cdr3中随机化的氨基酸。
[0104]
图2：通过流式细胞术评估b1 vnar环变体(his6myc标签)与a549(ror1
hi
)肺癌细胞的细胞表面结合。
[0105]
图3：通过流式细胞术评估b1 vnar环变体(his6myc标签)与a427(ror1
低
)肺癌细胞的细胞表面结合。
[0106]
图4：p3a1 g1的序列和环文库设计。cdr1多样性导致448种组合，hv2多样性导致768种组合，hv4多样性导致24种组合。
[0107]
图5：通过elisa评估p3a1g1环变体与人ror1的结合。将数据绘制为固定浓度(5ug/ml)的每个环变体在450nm处获得的od信号。
[0108]
图6：通过elisa评估p3a1g1环变体和亲本p3a1g1蛋白与人ror1的结合。
[0109]
图7：vnar igg fc融合蛋白中使用的接头小鼠igg和接头人igg序列。工程改造的higg1 fc融合蛋白在higg1 fc序列中并入了工程改造的半胱氨酸取代，例如在位置s239c或s442c(eu编号)处，以实现位点特异性标记。
[0110]
图8：通过流式细胞术评估b1环变体
–
hfc融合蛋白与a549(ror1
hi
)肺癌细胞的细胞表面结合。
[0111]
图9：通过sds-page(4-12％ bis tris凝胶、mops缓冲液、
±
50mm dtt)分析ror1双互补位vnar-hfc融合体。泳道1g3cp-p3a1 hfc(s239c kih)和泳道2g3cpg4-p3a1 hfc(s239c kih)
[0112]
图10：通过流式细胞术评估ror1双互补位vnar-hfc融合体与a549(ror1
hi
)和a427(ror1
低
)肺癌细胞的细胞表面结合。
[0113]
图11：pnu-接头有效负载ma-peg-vc-pab-eda-pnu159682和ma-peg-va-eda-pnu159682的结构。
[0114]
图12：示出通过elisa评估g3cp-hfc和g3cpg4-hfc pnu缀合物以及相应的亲本蛋白与人ror1结合的剂量响应。
[0115]
图13：g3cp-hfc pnu和g3cpg4-hfc pnu缀合物杀伤ror1阳性pa-1细胞系和ror1敲除的pa-1细胞系的效力。
[0116]
图14：g3cp-hfc pnu和g3cpg4-hfc pnu缀合物在ror1 hbcx-28患者来源的tnbc异种移植模型中的体内功效。绘制数据直到溶媒组中的第一只动物达到人道肿瘤负荷为止。
[0117]
图15：b1、b1 g4、b1v15、g3cp和g3cpg4的序列比对。cdr和hv区域内的变化的点用下划线强调。注意b1v15(seq id no：115)：不是b1的环文库变体；它们具有相同的cdr1、hv2、hv4和cdr3序列。
[0118]
图16：在pbs ph 7.4缓冲液中于37℃孵育96小时后，对b1-hfc、b1g4-hfc、g3cp-hfc和g3cpg4-hfc进行uv分析。
[0119]
图17：在pbs ph 7.4缓冲液中于37℃孵育96小时后，对b1-hfc、b1g4-hfc、g3cp-hfc和g3cpg4-hfc进行尺寸排阻分析(sec)。
[0120]
图18：g3cp-hfc pnu和g3cpg4-hfc pnu缀合物杀伤ror1
低
hek293细胞和用人ror1稳定转染的hek293细胞的效力
[0121]
图19：g3cp-hfc pnu和g3cpg4-hfc pnu缀合物在ror1 hbcx-10患者来源的tnbc异种移植模型中的体内功效。绘制数据直到溶媒组中的第一只动物达到人道肿瘤负荷为止。
[0122]
图20：通过流式细胞术评估ror1双互补位vnar-hfc药物缀合物与a549(ror1
hi
)和a427(ror1
低
)肺癌细胞的细胞表面结合。
[0123]
图21：双互补位g3cp-p3a1-hfc pnu和g3cpg4-p3a1-hfc pnu缀合物杀伤ror1阳性pa-1细胞系和ror1敲除的pa-1细胞系的效力。
[0124]
图22：双互补位g3cp-p3a1 hfc pnu和g3cpg4-p3a1-hfc pnu缀合物在ror1 hbcx-28患者来源的tnbc异种移植模型中的体内功效。
具体实施方式
[0125]
本发明一般涉及特异性抗原结合分子。具体地，本发明提供了对受体酪氨酸激酶
样孤儿受体1(ror1)具有特异性的免疫球蛋白样鲨鱼可变新抗原受体(vnar)和相关融合蛋白、嵌合抗原受体、缀合物和核酸，以及伴随的方法。ror1特异性vnar结构域在本文中被描述为ror1特异性抗原结合分子。
[0126]
新的或新抗原受体(ignar)是在软骨鱼血清中发现的约160kda的同源二聚体蛋白(greenberg a.s.,et al.,nature,1995.374(6518):p.168-173,dooley,h.,et al,mol.immunol,2003.40(1):p.25-33；m
ü
ller,m.r.,et al.,mabs,2012.4(6):p.673-685))。每个分子由单个n末端可变结构域(vnar)和五个恒定结构域(cnar)组成。ignar结构域是免疫球蛋白超家族的成员。vnar是一种紧密折叠的结构域，其结构和某些序列与免疫球蛋白和t细胞受体可变结构域以及细胞粘附分子相似，通过与经典免疫球蛋白和t细胞受体的n可变末端结构域的类比而被称为vnar。vnar与免疫球蛋白具有有限的序列同源性，例如vnar和人轻链序列之间有25-30％的相似性。
[0127]
kovaleva m.et al expert opin.biol.ther.2014.14(10):p.1527-1539and zielonka s.et al mabs 2015.7(1):p.15-25(其通过引用并入本文)提供了vnar的结构表征和生成的总结。
[0128]
vnar似乎并不是从经典的免疫球蛋白抗体祖先进化而来。vnar的独特结构特征是与常规免疫球蛋白可变结构域中存在的cdr2环相当的序列被截短，并且缺乏疏水性vh/vl界面残基，这些疏水性vh/vl界面残基通常允许与轻链结构域缔合，而ignar结构中不存在轻链结构域。此外，与经典免疫球蛋白不同，一些vnar亚型在cdr区中包含额外的半胱氨酸残基，这些额外的半胱氨酸残基被观察到形成除了在n末端与cdr1和cdr3相邻的框架1和3区域中的半胱氨酸之间的典型免疫球蛋白超家族桥之外的二硫桥。
[0129]
迄今为止，鲨鱼ignar有三种已定义的类型，称为i型、ii型和iii型。这些是根据非典型半胱氨酸残基的位置进行分类的，这些残基处于强选择压力下，因此很少被替换。
[0130]
所有三种类型均在位置35和107处具有经典的免疫球蛋白典型半胱氨酸(如kabat,e.a.et al.sequences of proteins of immunological interest.5th ed.1991,bethesda:usdept.of health and human services,phs,nih中进行编号)，与位置36处的不变色氨酸一起使标准免疫球蛋白折叠稳定。没有定义的cdr2，但与tcr hv2和hv4相比更接近的序列变异区域分别在框架2和框架3中定义。i型在框架2和框架4中具有种系编码的半胱氨酸残基，并且在cdr3中具有偶数个额外的半胱氨酸。溶菌酶分离的以及与溶菌酶复合的i型ignar的晶体结构研究使得能够确定这些半胱氨酸残基的贡献。框架2和4半胱氨酸均与cdr3中的半胱氨酸形成二硫桥，从而形成cdr3环被紧紧地压向hv2区域的紧密堆积结构，其中。迄今为止，仅在护士鲨中发现了i型ignar，而所有其他软骨鱼，包括同一目的成员，仅具有ii型或该类型的变种。
[0131]
ii型ignar被定义为在cdr1和cdr3中具有半胱氨酸残基，该半胱氨酸残基形成分子内二硫键，使这两个区域紧密靠近，从而形成有利于结合口袋或凹槽的突出的cdr3。i型序列通常比ii型序列具有更长的cdr3，平均分别为21个和15个残基。这被认为是由于i型cdr3中两个或更多个半胱氨酸残基与它们的框架2和4对应物缔合的强选择压力。对体细胞突变积累的研究表明，ii型cdr1的突变数量比i型多，而i型hv2区域的序列变异比ii型更大。该证据与这些区域在抗原结合位点内的确定定位密切相关。
[0132]
第三种ignar类型(称为iii型)已在新生儿中被发现。由于d1和d2区域(形成cdr3)
与v基因的种系融合，ignar家族的该成员在cdr3内缺乏多样性。几乎所有已知克隆的cdr3长度均为15个残基，几乎没有或没有序列多样性。
[0133]
vnar的另一种结构类型，称为类型(iib或iv)，仅具有两个典型半胱氨酸残基(在框架1和框架3b区域中)。到目前为止，这种类型主要在角鲨中发现，并且还从源自须鲨的半合成v-nar文库中分离出来。
[0134]
与其他天然免疫球蛋白中的可变结构域不同，vnar结合表面源自四个多样性区域：cdr1、hv2、hv4和cdr3，并按以下顺序通过插入框架序列之间而连接：fw1-cdr1-fw2-hv2-fw3a-hv4-fw3b-cdr3-fw4。缺乏天然轻链伴侣与缺乏cdr2结合起来使vnar成为脊椎动物界中最小的天然存在的结合结构域。
[0135]
ignar与骆驼科动物(骆驼、单峰骆驼和美洲驼)中发现的仅重链免疫球蛋白(hcab)共有一些附带特征。与ignar不同，hcab显然源自免疫球蛋白家族，并且与标准免疫球蛋白共有显著的序列同源性。重要的是，vnar的一个关键区别是，与经典免疫球蛋白或hcab不同，该分子在其进化过程中的任何时刻都没有伴侣轻链。flajnik m.f.et al plos biol 2011.9(8):e1001120and zielonka s.et al mabs 2015.7(1):p.15-25评论了vnar和来自骆驼科的免疫球蛋白衍生的vhh单结合结构域之间的相似性和差异以及它们可能和不同的进化起源。
[0136]
尽管文献中已经报道了针对ror1的抗体，但人、小鼠和大鼠ror1的胞外结构域之间以及人ror1和ror2家族成员之间的高序列同一性意味着生成高亲和力hror1特异性结合剂并非易事。此外，大尺寸的抗体会损害其渗透实体瘤的能力，并由于空间因素而导致靶标蛋白区域难以接近，这对于观察到寡聚化或受体簇集的细胞表面蛋白来说尤其严重。
[0137]
因此，本领域需要功能或物理的特征或性质与抗体不同的改进的抗ror1结合蛋白药剂，以及对用于与ror1表达相关的恶性肿瘤的治疗剂和诊断剂进行开发。本发明提供本文所述的ror1特异性抗原结合分子形式的此类药剂。
[0138]
不受理论的束缚，当前描述的ror1特异性抗原结合分子被认为与人ror1和鼠ror1两者结合。多种变体，包括g3cp、1e5、1b11、c3cp、1g9、1h8、g11cp、d9cp、1b6、1f10、f2cp、b6cp、1e1和p3a1g1 nac6.s、p3a1g1 ae3.s、p3a1g1 nac6、p3a1g1 ae3和p3a1g1 nag8已被实验证实与hror1和mror1均结合。此外，本发明的ror1特异性抗原结合分子可以与去糖基化形式的ror1结合。此外，它们可能不与现有技术中描述的与抗ror1抗体相关的许多线性肽结合。因此，与这些现有技术的抗ror1抗体相比，当前描述的ror1特异性抗原结合分子被认为与ror1序列中的不同表位结合。
[0139]
已经证明了本发明的ror1特异性抗原结合分子与癌细胞系的结合以及内化。这证实了在治疗癌症、特别是表达ror1的癌症中使用此类分子的潜力。
[0140]
描述了各种形式的ror1特异性抗原结合分子，包括几种类型的融合蛋白。描述了包括免疫球蛋白fc区的融合蛋白，以及同源二聚体和异源二聚体。蛋白质与fc结构域的融合可以提高蛋白质的溶解度和稳定性，显著延长血浆半衰期并提高整体治疗效果。
[0141]
本发明人还创建了与多个部分和有效负载缀合的vnar分子。因此，本发明还提供化学缀合的vnar。更具体地，提供了几种缀合形式的ror1特异性抗原结合分子。
[0142]
根据第一方面，本发明提供了一种受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)特异性抗原结合分子，其包含式(i)所示的氨基酸序列：
[0143]
fw1-cdr1-fw2-hv2-fw3a-hv4-fw3b-cdr3-fw4(i)
[0144]
其中
[0145]
cdr3是具有选自由ypwgagapynvqwy(seq id no：23)、ypwgagapylvqwy(seq id no：20)、ypwgagapwnvqwy(seq id no：24)、ypsgagaprpvqwy(seq id no：11)、ypwgagapclvqwy(seq id no：12)、ypwgagaprlvqwy(seq id no：13)、ypwgagaprqvqwy(seq id no：14)、ypwgagaprsvqwy(seq id no：15)、ypwgagapslvqwy(seq id no：16)、ypwgagapsnvqwy(seq id no：17)、ypwgagapsqvqwy(seq id no：18)、ypwgagapssvqwy(seq id no：19)、ypwgagapwqvqwy(seq id no：21)、ypwgagapwsvqwy(seq id no：22)和ypwgagapwlvqwy(seq id no：10)组成的组中的氨基酸序列的cdr序列；
[0146]
cdr1是具有选自由ganyglaa(seq id no：1)、danyglaa(seq id no：5)、ganydlsa(seq id no：2)、ganyglsa(seq id no：3)和ganydlaa(seq id no：4)组成的组中的氨基酸序列的cdr序列；
[0147]
fw1是框架区；
[0148]
fw2是框架区；
[0149]
hv2是具有选自由ssnqerisis(seq id no：6)和ssnkerisis(seq id no：7)组成的组中的氨基酸序列的高变序列；
[0150]
fw3a是框架区；
[0151]
hv4是具有选自由nkrtm(seq id no：8)和nkgtm(seq id no：9)组成的组中的氨基酸序列的高变序列；
[0152]
fw3b是框架区；
[0153]
fw4是框架区；
[0154]
其中如果cdr3是ypwgagapwlvqwy(seq id no：10)，则cdr1选自由danyglaa(seq id no：5)、ganyglsa(seq id no：3)和ganydlaa(seq id no：4)组成的组。
[0155]
在ror1特异性抗原结合分子的一个实施方式中：
[0156]
cdr3是具有选自由ypwgagapynvqwy(seq id no：23)、ypwgagapylvqwy(seq id no：20)、ypwgagapwnvqwy(seq id no：24)、ypsgagaprpvqwy(seq id no：11)、ypwgagapclvqwy(seq id no：12)、ypwgagaprlvqwy(seq id no：13)、ypwgagaprqvqwy(seq id no：14)、ypwgagaprsvqwy(seq id no：15)、ypwgagapslvqwy(seq id no：16)、ypwgagapsnvqwy(seq id no：17)、ypwgagapssvqwy(seq id no：19)、ypwgagapwqvqwy(seq id no：21)、ypwgagapwsvqwy(seq id no：22)和ypwgagapwlvqwy(seq id no：10)组成的组中的氨基酸序列的cdr序列。
[0157]
如果cdr3不是ypwgagapwlvqwy(seq id no：10)，则cdr1可以是具有选自由ganyglaa(seq id no：1)、danyglaa(seq id no：5)、ganydlsa(seq id no：2)、ganyglsa(seq id no：3)和ganydlaa(seq id no：4)组成的组中的氨基酸序列的cdr序列。因此，ror1特异性抗原结合分子可以定义为包含由式(i)表示的氨基酸序列：
[0158]
fw1-cdr1-fw2-hv2-fw3a-hv4-fw3b-cdr3-fw4
ꢀꢀꢀꢀꢀ(i)[0159]
其中
[0160]
cdr3是具有选自由ypwgagapynvqwy(seq id no：23)、ypwgagapylvqwy(seq id no：20)、ypwgagapwnvqwy(seq id no：24)、ypsgagaprpvqwy(seq id no：11)、
ypwgagapclvqwy(seq id no：12)、ypwgagaprlvqwy(seq id no：13)、ypwgagaprqvqwy(seq id no：14)、ypwgagaprsvqwy(seq id no：15)、ypwgagapslvqwy(seq id no：16)、ypwgagapsnvqwy(seq id no：17)、ypwgagapsqvqwy(seq id no：18)、ypwgagapssvqwy(seq id no：19)、ypwgagapwqvqwy(seq id no：21)和ypwgagapwsvqwy(seq id no：22)组成的组中的氨基酸序列的cdr序列；
[0161]
cdr1是具有选自由ganyglaa(seq id no：1)、danyglaa(seq id no：5)、ganydlsa(seq id no：2)、ganyglsa(seq id no：3)和ganydlaa(seq id no：4)组成的组中的氨基酸序列的cdr序列；
[0162]
fw1是框架区；
[0163]
fw2是框架区；
[0164]
hv2是具有选自由ssnqerisis(seq id no：6)和ssnkerisis(seq id no：7)组成的组中的氨基酸序列的高变序列；
[0165]
fw3a是框架区；
[0166]
hv4是具有选自由nkrtm(seq id no：8)和nkgtm(seq id no：9)组成的组中的氨基酸序列的高变序列；
[0167]
fw3b是框架区；以及
[0168]
fw4是框架区。
[0169]
在ror1特异性抗原结合分子的一个实施方式中：
[0170]
cdr3是具有选自由ypwgagapynvqwy(seq id no：23)、ypwgagapylvqwy(seq id no：20)和ypwgagapwnvqwy(seq id no：24)组成的组中的氨基酸序列的cdr序列，和/或
[0171]
cdr1是具有选自由ganyglaa(seq id no：1)和danyglaa(seq id no：5)组成的组中的氨基酸序列的cdr序列。
[0172]
在ror1特异性抗原结合分子的一个实施方式中：
[0173]
cdr3是具有根据ypwgagapynvqwy(seq id no：23)的氨基酸序列的cdr序列。
[0174]
在ror1特异性抗原结合分子的一个实施方式中：
[0175]
cdr3是具有根据ypwgagapynvqwy(seq id no：23)的氨基酸序列的cdr序列；
[0176]
cdr1是具有根据ganyglaa(seq id no：1)的氨基酸序列的cdr序列；
[0177]
hv2是具有根据ssnqerisis(seq id no：6)的氨基酸序列的高变序列；和
[0178]
hv4是具有根据nkrtm(seq id no：8)的氨基酸序列的高变序列。
[0179]
在ror1特异性抗原结合分子的一个实施方式中：
[0180]
cdr3是具有根据ypwgagapynvqwy(seq id no：23)的氨基酸序列的cdr序列；
[0181]
cdr1是具有根据danyglaa(seq id no：5)的氨基酸序列的cdr序列；
[0182]
hv2是具有根据ssnkerisis(seq id no：7)的氨基酸序列的高变序列；和
[0183]
hv4是具有根据nkgtm(seq id no：9)的氨基酸序列的高变序列。
[0184]
在ror1特异性抗原结合分子的一个实施方式中：
[0185]
cdr3是具有根据ypwgagapwlvqwy(seq id no：10)的氨基酸序列的cdr序列；
[0186]
cdr1是具有根据danyglaa(seq id no：5)的氨基酸序列的cdr序列；
[0187]
hv2是具有根据ssnkerisis(seq id no：7)的氨基酸序列的高变序列；和
[0188]
hv4是具有根据nkgtm(seq id no：9)的氨基酸序列的高变序列。
[0189]
在优选的实施方式中，ror1特异性抗原结合分子包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
[0190]
asvnqtprtatketgesltincvvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypwgagapynvqwydgagtvltvn(seq id no:50)，在本文中称为g3cp；
[0191]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltdanyglaatywyrknpgssnkerisisgrysesvnkgtmsftltisslqpedsatyycraypwgagapwlvqwydgagtkveik(seq id no:51)，在本文中称为b1g4；
[0192]
asvnqtprtatketgesltincvvtganydlsatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypsgagaprpvqwydgagtvltvn(seq id no:52)，在本文中称为1e2；
[0193]
asvnqtprtatketgesltincvvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypwgagapclvqwydgagtvltvn(seq id no:53)，在本文中称为1e5；
[0194]
asvnqtprtatketgesltincvvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypwgagaprlvqwydgagtvltvn(seq id no:54)，在本文中称为1b11；
[0195]
asvnqtprtatketgesltincvvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypwgagaprqvqwydgagtvltvn(seq id no:55)，在本文中称为c3cp；
[0196]
asvnqtprtatketgesltincvvtganyglsatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypwgagaprsvqwydgagtvltvn(seq id no:56)，在本文中称为2g5；
[0197]
asvnqtprtatketgesltincvvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypwgagaprsvqwydgagtvltvn(seq id no:57)，在本文中称为1g12；
[0198]
asvnqtprtatketgesltincvvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypwgagapslvqwydgagtvltvn(seq id no:58)，在本文中称为g5cp；
[0199]
asvnqtprtatketgesltincvvtganyglsatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypwgagapsnvqwydgagtvltvn(seq id no:59)，在本文中称为2f4；
[0200]
asvnqtprtatketgesltincvvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypwgagapsqvqwydgagtvltvn(seq id no:60)，在本文中称为1g9；
[0201]
asvnqtprtatketgesltincvvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypwgagapssvqwydgagtvltvn(seq id no:61)，在本文中称为1h8；
[0202]
asvnqtprtatketgesltincvvtganyglsatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypwgagapwlvqwydgagtvltvn(seq id no:62)，在本文中称为g11cp；
[0203]
asvnqtprtatketgesltincvvtganydlaatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypwgagapwlvqwydgagtvltvn(seq id no:63)，在本文中称为d9cp；
[0204]
asvnqtprtatketgesltincvvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypwgagapwnvqwydgagtvltvn(seq id no:64)，在本文中称为1b6；
[0205]
asvnqtprtatketgesltincvvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypwgagapwqvqwydgagtvltvn(seq id no:65)，在本文中称为1f10；
[0206]
asvnqtprtatketgesltincvvtganyglsatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypwgagapwqvqwydgagtvltvn(seq id no:66)，在本文中称为e6cp；
[0207]
asvnqtprtatketgesltincvvtganydlaatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypwgagapwqvqwydgagtvltvn(seq id no:67)，在本文中称为f2cp；
[0208]
asvnqtprtatketgesltincvvtganydlaatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfsl
rikdltvadsatyyckaypwgagapwsvqwydgagtvltvn(seq id no:68)，在本文中称为b6cp；
[0209]
asvnqtprtatketgesltincvvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypwgagapwsvqwydgagtvltvn(seq id no:69)，在本文中称为1g1；和
[0210]
asvnqtprtatketgesltincvvtganyglsatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypwgagapwsvqwydgagtvltvn(seq id no:70)，在本文中称为a10cp；
[0211]
或功能变体，所述功能变体具有根据其中任何序列的cdr1、hv2、hv4和cdr2序列并且具有fw1、fw2、fw3a、fw3b和fw4序列，所述fw1、fw2、fw3a、fw3b和fw4序列与其中任何序列的组合fw1、fw2、fw3a、fw3b和fw4序列具有至少45％的组合序列同一性。
[0212]
在特别优选的实施方式中，ror1特异性抗原结合分子可以包含根据asvnqtprtatketgesltincvvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypwgagapynvqwydgagtvltvn(seq id no：50)的氨基酸序列。
[0213]
ror1特异性抗原结合分子可以包含根据asvnqtprtatketgesltincvvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypwgagapynvqwydgagtvltvn(seq id no：50)的氨基酸序列或其功能变体，所述功能变体具有根据seq id no：50的cdr1、hv2、hv4和cdr2序列并且具有fw1、fw2、fw3a、fw3b和fw4序列，所述fw1、fw2、fw3a、fw3b和fw4序列与seq id no：50的组合fw1、fw2、fw3a、fw3b和fw4序列具有至少45％的组合序列同一性。
[0214]
与seq id no：50(“g3cp”)及其功能变体相关的具体优点包括表达产量和亲水性增加以及分析纯化以及这些蛋白质在非优化水性缓冲系统中的单体性增加。不受理论的束缚，这些优点在包含g3cp序列或其功能变体的vnar-hfc融合蛋白中可能特别明显。因此，g3cp序列及其功能变体可以提供改进的制造和/或操作特性。此外，g3cp-hfc在与细胞毒性蒽环类(pnu)衍生物缀合时，在患者来源的三阴性乳腺癌(tnbc)异种移植模型中显示出优异的体内功效。g3cp-hfc的效果甚至令人惊讶地比本身就显示出优异的体内功效的b1-hfc也有所提高。
[0215]
在特别优选的实施方式中，ror1特异性抗原结合分子可以包含根据trvdqspsslsasvgdrvtitcvltdanyglaatywyrknpgssnkerisisgrysesvnkgtmsftltisslqpedsatyycraypwgagapwlvqwydgagtkveik(seq id no：51)的氨基酸序列。
[0216]
与seq id no：51(“b1g4”)及其功能变体相关的具体优点包括：表达产量包含b1g4序列或其功能变体的融合蛋白(例如vnar-hfc融合蛋白)在水性缓冲系统中的和单体性增加。因此，b1g4序列及其功能变体可以提供具有改进的制造和/或操作特性的融合蛋白。
[0217]
ror1特异性抗原结合分子可以包含根据trvdqspsslsasvgdrvtitcvltdanyglaatywyrknpgssnkerisisgrysesvnkgtmsftltisslqpedsatyycraypwgagapwlvqwydgagtkveik(seq id no：51)的氨基酸序列或其功能变体，所述功能变体具有根据seq id no：51的cdr1、hv2、hv4和cdr2序列并且具有fw1、fw2、fw3a、fw3b和fw4序列，所述fw1、fw2、fw3a、fw3b和fw4序列与seq id no：51的组合fw1、fw2、fw3a、fw3b和fw4序列具有至少45％的组合序列同一性。
[0218]
在优选的实施方式中，ror1特异性抗原结合分子包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
[0219]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltdanyglaatywyrknpgssnkerisisgrysesvnkgtmsftl
tisslqpedsatyycraypwgagapynvqwydgagtkveik(seq id no:71)，在本文中称为g3cpg4；
[0220]
asvtqsprsasketgesltitcrvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgrysesvnkrtmsfslrissltvedsatyyckaypwgagapynvqwydgqgtklevk(seq id no:72)，在本文中称为g3cpv15；
[0221]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltdanyglaatywyrknpgssnkerisisgrysesvnkgtmsftltisslqpedsatyycraypwgagapssvqwydgagtkveik(seq id no:73)，在本文中称为1h8 g4；
[0222]
asvtqsprsasketgesltitcrvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgrysesvnkrtmsfslrissltvedsatyyckaypwgagapssvqwydgqgtklevk(seq id no:74)，在本文中称为1h8 v15；
[0223]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltdanyglaatywyrknpgssnkerisisgrysesvnkgtmsftltisslqpedsatyycraypwgagaprqvqwydgagtkveik(seq id no:75)，在本文中称为c3cpg4；和
[0224]
asvtqsprsasketgesltitcrvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgrysesvnkrtmsfslrissltvedsatyyckaypwgagaprqvqwydgqgtklevk(seq id no:76)，在本文中称为c3cpv15；
[0225]
或功能变体，所述功能变体具有根据其中任何序列的cdr1、hv2、hv4和cdr2序列并且具有fw1、fw2、fw3a、fw3b和fw4序列，所述fw1、fw2、fw3a、fw3b和fw4序列与其中任何序列的组合fw1、fw2、fw3a、fw3b和fw4序列具有至少45％的组合序列同一性。
[0226]
在特别优选的实施方式中，ror1特异性抗原结合分子可以包含根据trvdqspsslsasvgdrvtitcvltdanyglaatywyrknpgssnkerisisgrysesvnkgtmsftltisslqpedsatyycraypwgagapynvqwydgagtkveik(seq id no：71)的氨基酸序列。
[0227]
ror1特异性抗原结合分子可以包含根据trvdqspsslsasvgdrvtitcvltdanyglaatywyrknpgssnkerisisgrysesvnkgtmsftltisslqpedsatyycraypwgagapynvqwydgagtkveik(seq id no：71)的氨基酸序列或其功能变体，所述功能变体具有根据seq id no：71的cdr1、hv2、hv4和cdr2序列并且具有fw1、fw2、fw3a、fw3b和fw4序列，所述fw1、fw2、fw3a、fw3b和fw4序列与seq id no：71的组合fw1、fw2、fw3a、fw3b和fw4序列具有至少45％的组合序列同一性。
[0228]
与seq id no：71(“g3cp g4”)及其功能变体相关的具体优点包括表达产量和亲水性增加以及分析纯化和这些蛋白质在非优化水性缓冲系统中的单体性增加。不受理论的束缚，这些优点在包含g3cp g4序列或其功能变体的vnar-hfc融合蛋白中可能特别明显。因此，g3cp g4序列及其功能变体可以提供改进的制造和/或操作特性。此外，g3cpg4-hfc在与细胞毒性蒽环类(pnu)衍生物缀合时，在患者来源的三阴性乳腺癌(tnbc)异种移植模型中显示出优异的体内功效。g3cpg4-hfc的效果甚至令人惊讶地比本身就显示出优异的体内功效的b1-hfc也有所提高。
[0229]
g3cp和g3cpg4的序列相对于b1的序列有两个共同的单个氨基酸变化。它们都在cdr3内，是以下取代：
[0230]
1.y残基取代w残基，和
[0231]
2.n残基取代l残基。
[0232]
与g3cp相比，g3cpg4相对于b1(也出现在b1 g4中)在cdr1、hv2和hv4中的每个中都有其他的单氨基酸变化，并且变化为使框架区人源化(其中一些也出现在b1v15，seq id no：115中，如图15所示-b1v15具有与b1相同的cdr1、hv2、hv4和cdr3序列，即它不是环文库变体；b1v15相对于b1的改变仅在框架区中)。
[0233]
不受理论的束缚，g3cp和g3cpg4两者显示的而b1 g4或b1 v15未显示的相对于b1
的任何改进被认为是由它们在cdr3中共有的两个突变之一或两者造成的。因此，g3cp和g3cpg4的优点被认为源自包含序列ypwgagapynvqwy(seq id no：23)的cdr3。
[0234]
不受理论的束缚，与ypwgagapynvqwy(seq id no：23)相关的令人惊讶的优点可以代表w至y的取代和l至n的取代的协同效应。可选择地，令人惊讶的优势可能主要源自w至y取代，因此也被ypwgagapylvqwy(seq id no：20)享有。1b6具有l至n突变，其cdr3序列为ypwgagapwnvqwy(seq id no：24)，洗脱体积比b1低，因此cdr3中的l至n突变确实导致改进的制造和/或操作特性。
[0235]
根据第二方面，本发明提供了一种受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)特异性抗原结合分子，其包含式(i)所示的氨基酸序列：
[0236]
fw1-cdr1-fw2-hv2-fw3a-hv4-fw3b-cdr3-fw4
ꢀꢀ(i)[0237]
其中
[0238]
cdr1是具有选自由gtryglys(seq id no：25)、gtryglyss(seq id no：26)、dtryalys(seq id no：27)、dtryalyss(seq id no：28)、gtkyglya(seq id no：29)和gtkyglyas(seq id no：30)组成的组中的氨基酸序列的cdr序列；
[0239]
fw1是框架区；
[0240]
fw2是框架区；
[0241]
hv2是具有选自由ssdeerisis(seq id no：31)、stdeerisig(seq id no：32)、spnkdrmiig(seq id no：33)和stdkeriiig(seq id no：34)组成的组中的氨基酸序列的高变序列；
[0242]
fw3a是框架区；
[0243]
hv4是具有选自由nkgtk(seq id no：35)、nkgsk(seq id no：36)、nngtk(seq id no：37)和nnrsk(seq id no：38)组成的组中的氨基酸序列的高变序列；
[0244]
fw3b是框架区；
[0245]
cdr3是具有根据rearhpwlrqwy(seq id no：39)的氨基酸序列的cdr序列；
[0246]
fw4是框架区。
[0247]
在优选的实施方式中，ror1特异性抗原结合分子包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
[0248]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltgtryglystywyrknpgssdeerisisgrysesvnkgtksftltisslqpedsatyycrarearhpwlrqwydgagtkveik(seq id no:77)，在本文中称为p3a1 g1 ae3；
[0249]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltgtryglysstywyrknpgssdeerisisgrysesvnkgtksftltisslqpedsatyycrarearhpwlrqwydgagtkveik(seq id no:78)，在本文中称为p3a1 g1 ae3.s；
[0250]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltdtryalystywyrknpgstdeerisiggrysesvnkgsksftltisslqpedsatyycrarearhpwlrqwydgagtkveik(seq id no:79)，在本文中称为p3a1 g1 nac6；
[0251]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltdtryalysstywyrknpgstdeerisiggrysesvnkgsksftltisslqpedsatyycrarearhpwlrqwydgagtkveik(seq id no:80)，在本文中称为p3a1 g1 nac6.s；
[0252]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltgtkyglyatywyrknpgspnkdrmiiggrysesvnngtksftltisslqpedsatyycrarearhpwlrqwydgagtkveik(seq id no:81)，在本文中称为p3a1 g1 nag8；
[0253]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltgtkyglyastywyrknpgspnkdrmiiggrysesvnngtksftltisslqpedsatyycrarearhpwlrqwydgagtkveik(seq id no:82)，在本文中称为p3a1 g1 nag8.s；
[0254]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltgtkyglyastywyrknpgstdkeriiiggrysesvnnrsksftltisslqpedsatyycrarearhpwlrqwydgagtkveik(seq id no:83)，在本文中称为p3a1 g1 af7.s；
[0255]
或功能变体，所述功能变体具有根据其中任何序列的cdr1、hv2、hv4和cdr2序列并且具有fw1、fw2、fw3a、fw3b和fw4序列，所述fw1、fw2、fw3a、fw3b和fw4序列与其中任何序列的组合fw1、fw2、fw3a、fw3b和fw4序列具有至少45％的组合序列同一性。
[0256]
与p3a1g1的亲和力成熟变体及其功能变体相关的具体优点包括与hror1-fc的结合相比于亲本p3a1g1有所改进，如实施例所示。
[0257]
[0258]
[0259]
[0260]
[0261][0262]
与本发明的分子相关的序列同一性可以在单独的cdr、hv或fw、组合的cdr、hv或fw的水平上判断，或者可以在整个分子长度上判断。所描述的cdr、hv和fw序列也可以更长或
更短，无论是通过在序列的n末端或c末端添加或缺失氨基酸，还是通过在序列中插入或缺失氨基酸。
[0263]
框架区fw1的长度优选为20至28个氨基酸，更优选为22至26个氨基酸，还更优选为23至25个氨基酸。在某些优选的实施方式中，fw1的长度是26个氨基酸。在其他优选的实施方式中，fw1的长度是25个氨基酸。在还其他优选的实施方式中，fw1的长度是24个氨基酸。
[0264]
在替代定义中，cdr区cdr1的长度优选为7至11个氨基酸，更优选长度为8至10个氨基酸。在某些优选的实施方式中，cdr1的长度是9个氨基酸。在其他优选的实施方式中，cdr1的长度为8个氨基酸。
[0265]
框架区fw2优选长度为6至14个氨基酸，更优选长度为8至12个氨基酸。在某些优选的实施方式中，fw2的长度是12个氨基酸。在其他优选的实施方式中，fw2的长度为10个氨基酸。在其他优选的实施方式中，fw2的长度为9个氨基酸。在其他优选的实施方式中，fw2的长度为8个氨基酸。
[0266]
在替代定义中，高变序列hv2的长度优选为4至11个氨基酸，更优选长度为5至10个氨基酸。在某些优选的实施方式中，hv2的长度是10个氨基酸。在某些优选的实施方式中，hv2的长度是9个氨基酸。在其他优选的实施方式中，hv2的长度为6个氨基酸。
[0267]
框架区fw3a优选长度为6至10个氨基酸，更优选长度为7至9个氨基酸。在某些优选的实施方式中，fw3a的长度是8个氨基酸。在某些优选的实施方式中，fw3a的长度是7个氨基酸。
[0268]
在替代定义中，高变序列hv4的长度优选为3至7个氨基酸，更优选长度为4至6个氨基酸。在某些优选的实施方式中，hv4的长度是5个氨基酸。在其他优选的实施方式中，hv4的长度为4个氨基酸。
[0269]
框架区fw3b的长度优选为17至24个氨基酸，更优选为18至23个氨基酸，还更优选为19至22个氨基酸。在某些优选的实施方式中，fw3b的长度是21个氨基酸。在其他优选的实施方式中，fw3b的长度为20个氨基酸。
[0270]
在替代定义中，cdr区cdr3的长度优选为8至21个氨基酸，更优选为9至20个氨基酸，还更优选为10至19个氨基酸。在某些优选的实施方式中，cdr3的长度是17个氨基酸。在其他优选的实施方式中，cdr3的长度为14个氨基酸。在还其他优选的实施方式中，cdr3的长度是12个氨基酸。在又其他优选的实施方式中，cdr3的长度是10个氨基酸。
[0271]
框架区fw4的长度优选为7至14个氨基酸，更优选为8至13个氨基酸，还更优选为9至12个氨基酸。在某些优选的实施方式中，fw4的长度是12个氨基酸。在其他优选的实施方式中，fw4的长度为11个氨基酸。在还其他优选的实施方式中，fw4的长度是10个氨基酸。在又其他优选的实施方式中，fw4的长度是9个氨基酸。
[0272]
在ror1特异性抗原结合分子的一个实施方式中：
[0273]
fw1是20至28个氨基酸的框架区；
[0274]
fw2是6至14个氨基酸的框架区；
[0275]
fw3a是6至10个氨基酸的框架区；
[0276]
fw3b是17至24个氨基酸的框架区；和/或
[0277]
fw4是7至14个氨基酸的框架区。
[0278]
在ror1特异性抗原结合分子的一个实施方式中：
[0279]
fw1.00或其中任何序列的具有至少45％序列同一性的功能变体；
[0280]
fw2具有根据tywyrknpg(seq id no：43)的氨基酸序列，或其中任何序列的具有至少45％序列同一性的功能变体；
[0281]
fw3a具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：gryvesv(seq id no：44)和grysesv(seq id no：45)，或其中任何序列的具有至少45％序列同一性的功能变体；
[0282]
fw3b具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：sfslrikdltvadsatyycka(seq id no：84)、sftltisslqpedsatyycra(seq id no：46)和sfslrissltvedsatyycka(seq id no：47)，或其中任何序列的具有至少45％序列同一性的功能变体；
[0283]
和/或
[0284]
fw4具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：dgagtvltvn(seq id no：48)、
[0285]
dgagtkveik(seq id no：49)或dgqgtklevk(seq id no：85)，或其中任何序列的具有至少45％序列同一性的功能变体。
[0286]
本发明的ror1特异性抗原结合分子可以是人源化的。本发明的ror1特异性抗原结合分子可以是去免疫的。本文所述的人源化骨架g4和v15上的b1环变体是人源化的。由于p3a1g1已经人源化，p3a1g1的所有环变体都是人源化的。本发明的人源化序列的实例包括但不限于：
[0287]
b1g4
[0288]
g3cp g4
[0289]
g3cp v15
[0290]
1h8 g4
[0291]
1h8 v15
[0292]
c3cp g4
[0293]
c3cpv15
[0294]
p3a1 g1 ae3
[0295]
p3a1 g1 ae3.s
[0296]
p3a1 g1 nac6
[0297]
p3a1 g1 nac6.s
[0298]
p3a1 g1 nag8
[0299]
p3a1 g1 nag8.s
[0300]
p3a1 g1 af7.s。
[0301]
技术人员应当理解，本文所述的人源化ror1特异性抗原结合分子可以被进一步人源化，例如通过用dpk-9的氨基酸取代另外的fw区氨基酸。
[0302]
本发明的ror1特异性抗原结合分子还可以与可检测标记、染料、毒素、药物、前药、放射性核素或生物活性分子缀合。
[0303]
优选地，ror1特异性抗原结合分子不与受体酪氨酸激酶样孤儿受体2(ror2)结合。更优选地，ror1特异性抗原结合分子与人ror1和鼠ror1(mror1)结合。还更优选地，ror1特异性抗原结合分子与去糖基化的ror1结合。
[0304]
本发明的某些ror1特异性抗原结合分子可以不与选自以下的线性肽序列结合：
[0305]
ymeslhmqgeienqi(seq id no:91)
[0306]
cqpwnsqyphthtftalrfp(seq id no:92)
[0307]
rstiygsrlrirnldttdtgyfq(seq id no:93)。
[0308]
优选地，ror1特异性抗原结合分子以约0.01nm至50nm、优选0.1nm至30nm、甚至更优选0.1nm至10nm的亲和常数选择性地与ror1蛋白相互作用。亲和常数可以通过生物层干涉测量法(bli)来测量。对于单体，相互作用为1:1。对于vnar-hfc形式，发明人使用了两种方法。其中一种是ror1被固定化，因此当亲合力效应发挥作用时，二价vnar-hfc以明显的kd结合。另一种方法是采用1:1形式，其中vnar-hfc被固定化，ror1流过表面，从而给出“真实”1:1结合的kd。通常，本文使用的亲和常数是指使用1:1结合形式通过生物层干涉测量法(bli)测量的亲和常数。通过这种方法，例如，g3cp和g3cp g4在0.1至10nm范围内。p3a1 g1环变体示例的kd值为5.0nm(ae3)、13.8nm(nac6)和12.2nm(nag8)。
[0309]
此外，ror1特异性抗原结合分子优选能够介导杀伤表达ror1的肿瘤细胞或者能够抑制癌细胞增殖。
[0310]
ror1特异性抗原结合分子还能够在与ror1结合后被内吞。在其他实施方式中，ror1特异性抗原结合分子在与ror1结合后可以不被内吞。
[0311]
在本发明的第三方面，提供了包含第一或第二方面的特异性抗原结合分子的重组融合蛋白。优选地，在第三方面的重组融合蛋白中，特异性抗原结合分子与一种或多种生物活性蛋白融合。特异性抗原结合分子可以通过一个或多个接头结构域与一种或多种生物活性蛋白质融合。优选的接头包括但不限于[g4s]
x
，其中x是1、2、3、4、5或6。特别优选的接头是[g4s]3(seq id no：86)和[g4s]5(seq id no：87)。其他优选的接头包括序列pgvqpsp(seq id no：88)、pgvqpspggggs(seq id no：89)和pgvqpapggggs(seq id no：90)。当重组融合蛋白在糖基化模式不同的不同表达系统(例如cho和昆虫)以及不糖基化所表达蛋白的表达系统(例如大肠杆菌)中表达时，这些接头可能是特别有用的。本文公开的包含[g4s]3接头的任何重组融合蛋白序列可以可选择地具有本文公开的任何其他接头序列。
[0312]
还应当理解，本发明的融合蛋白可以以任何顺序构建，即，ror1特异性抗原结合分子位于n末端、c末端或不位于任何末端(例如在更长的氨基酸序列的中间)。
[0313]
优选的生物活性蛋白质包括但不限于免疫球蛋白、免疫球蛋白fc区、免疫球蛋白fc区的片段、fc重链、ch2区、ch3区、免疫球蛋白fab区、fab'、fv、fv-fc、单链fv(scfv)、scfv-fc、(scfv)2、双抗体、三抗体、四抗体、双特异性t细胞衔接体(engager)、内含肽、vnar结构域、单域抗体(sdab)、vh结构域或支架蛋白(affibodies、centyrins、darpins等)。特别优选的生物活性蛋白是免疫球蛋白fc区。其他优选的融合蛋白包括vnar-vnar和vnar-vnar-vnar。
[0314]
在一个实施方式中，至少一种生物活性蛋白是免疫球蛋白fc区。
[0315]
因此，重组融合蛋白可以包含根据seq id no：186、seq id no：187、seq id no：183、seq id no：184或seq id no：185的序列。
[0316]
g3cp-hfc
[0317]
asvnqtprtatketgesltincvvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypwgagapynvqwydgagtvltvnggggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqp
ennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no:186)
[0318]
g3cpg4-hfc
[0319]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltdanyglaatywyrknpgssnkerisisgrysesvnkgtmsftltisslqpedsatyycraypwgagapynvqwydgagtkveikggggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no:187)
[0320]
1h8-hfc
[0321]
asvnqtprtatketgesltincvvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypwgagapssvqwydgagtvltvnggggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no:183)
[0322]
1h8 g4-hfc
[0323]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltdanyglaatywyrknpgssnkerisisgrysesvnkgtmsftltisslqpedsatyycraypwgagapssvqwydgagtkveikggggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no:184)
[0324]
1h8 v15-hfc
[0325]
asvtqsprsasketgesltitcrvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgrysesvnkrtmsfslrissltvedsatyyckaypwgagapssvqwydgqgtklevkggggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no:185)
[0326]
在进一步的实施方式中，至少一种生物活性蛋白是经进一步修饰以包含s至c突变的免疫球蛋白fc区。
[0327]
因此，重组融合蛋白可包含根据seq id no：178、seq id no：179、seq id no：180、seq id no：181或seq id no：182的序列。
[0328]
g3cp-hfc(s239c)
[0329]
asvnqtprtatketgesltincvvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypwgagapynvqwydgagtvltvnggggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapellggpcvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no:178)
[0330]
g3cpg4-hfc(s239c)
[0331]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltdanyglaatywyrknpgssnkerisisgrysesvnkgtmsftltisslqpedsatyycraypwgagapynvqwydgagtkveikggggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapellggpcvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhq
dwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no:179)
[0332]
1h8-hfc(s239c)
[0333]
asvnqtprtatketgesltincvvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypwgagapssvqwydgagtvltvnggggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapellggpcvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no:180)
[0334]
1h8 g4-hfc(s239c)
[0335]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltdanyglaatywyrknpgssnkerisisgrysesvnkgtmsftltisslqpedsatyycraypwgagapssvqwydgagtkveikggggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapellggpcvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no:181)
[0336]
1h8 v15-hfc(s239c)
[0337]
asvtqsprsasketgesltitcrvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgrysesvnkrtmsfslrissltvedsatyyckaypwgagapssvqwydgqgtklevkggggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapellggpcvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no:182)
[0338]
在一个实施方式中，至少一种生物活性蛋白是选自由fc重链、ch2区和ch3区组成的组中的免疫球蛋白fc区的片段。
[0339]
在一个实施方式中，免疫球蛋白fc区的片段是fc重链。
[0340]
在一个实施方式中，免疫球蛋白fc区的片段被工程改造以与免疫球蛋白fc区的第二片段二聚化。
[0341]
如本文所用，“工程改造以二聚化”的免疫球蛋白fc区可包含至少一个氨基酸取代。通常，至少一个氨基酸取代促进与免疫球蛋白fc区的第二片段的相互作用和/或缔合，和/或使得与免疫球蛋白fc区的第二片段的相互作用和/或缔合在能量上更有利，从而促进二聚化和/或使二聚化在能量上更有利。此类重组融合蛋白在制备双特异性和/或双互补位结合物中可能具有特殊用途。
[0342]
通过将被工程改造以二聚化的两条不同的fc重链配对来生成基于fc的双特异性和/或双互补位结合物的方法是本领域已知的。这些方法使得fc区能够由两条不同的重链组装而成，每条重链均与具有不同结合特征的靶标结合结构域或序列融合。靶标结合结构域或序列可以针对不同的靶标以生成多特异性结合物和/或针对同一靶标上的不同区域或表位以生成双互补位结合蛋白。多个结合结构域或序列可以与fc序列融合以产生多特异性或多互补位结合物或在同一蛋白质内的多特异性多互补位结合物。通过两个不同fc重链或其片段的异二聚化生成这些不对称双特异性和/或双互补位结合物的方法包括但不限于：杵-臼(knobs-into-holes)(y-t)、杵-臼(cw-csav)、ch3电荷配对、fab-arm交换、seed技术、beat技术、ha-tf、zw1方法、biclonic方法、ew-rvt和triomab。参见例如，brinkman&
kontermann,(2017)mabs,9:2,182-212；klein et al(2012)mabs 4:6,653
–
663；wang et al(2019)antibodies,8,43；和dietrich et al(2020)bba-proteins and proteomics 1868 140250；其中每一个都通过引用整体并入本文。
[0343]
在一个实施方式中，免疫球蛋白fc区的片段通过选自由以下组成的组中的方法被工程改造以与免疫球蛋白fc区的第二片段二聚化：杵-臼(y-t)、杵-臼(cw-csav)、ch3电荷配对、fab-arm交换、seed技术、beat技术、ha-tf、zw1方法、biclonic方法、ew-rvt和triomab。这些方法中的每一个的特征均结合本发明的第四方面进行详细描述，并且同样被考虑为与本发明的第三方面相关。
[0344]
在一个实施方式中，免疫球蛋白fc区的片段的一个或多个残基包含适合于与包含一个或多个相应的氨基酸突变的免疫球蛋白fc区的第二片段异二聚化的一个或多个氨基酸取代。
[0345]
在一个实施方式中，一个或多个氨基酸取代选自由t366y、y407t、s354c、t366w、y349c、t366s、l368a和y407v组成的组。
[0346]
在一个实施方式中，一个或多个氨基酸取代选自由t366y和y407t组成的组。
[0347]
本发明的融合蛋白的任何部分都可以被工程改造以能够缀合。在优选的示例中，当使用免疫球蛋白fc区时，其可以被工程改造以包括半胱氨酸残基作为缀合位点。优选引入的半胱氨酸残基包括但不限于s252c和s473c(kabat编号)，其分别对应于eu编号中的s239c和s442c。在一些实施方式中，本文公开的任何融合蛋白可包含s239c点突变。在一些实施方式中，本文公开的任何融合蛋白可包含s442c点突变。在一些实施方式中，本文公开的任何融合蛋白可包含s239c和s442c点突变。本文明确考虑了本文公开的任何融合蛋白的序列可被修饰以包括s239c和/或s442c点突变。
[0348]
根据第三方面，提供了包含多个vnar结构域的重组融合体。因此，本发明的重组融合体可以是vnar的二聚体、三聚体或更高级的多聚体。在此类重组融合体中，每个vnar的特异性可以相同或不同。本发明的重组融合体包括但不限于双特异性或三特异性分子，其中每个vnar结构域与不同的抗原或与单一抗原上的不同表位(双互补位结合物)结合。本文使用的术语“双互补位”旨在涵盖与给定抗原上的多个表位结合的分子。本文还考虑了结合给定抗原上的三个或更多个表位的分子，并且当使用术语“双互补位”时，应当理解，还涵盖三互补位或多互补位分子的可能性。
[0349]
还根据第三方面，提供了重组融合体，其包括第一方面的ror1特异性抗原结合分子和人源化vnar结构域。人源化vnar结构域可以称为solomer，并且包括但不限于vnar ba11，其是以高亲和力与人血清白蛋白结合的人源化vnar。
[0350]
双互补位和多价融合蛋白的例子包括但不限于：
[0351]
·
b1-g3cp
[0352]
·
g3cp-ba11
[0353]
·
ba11-g3cp
[0354]
·
1h8-ba11
[0355]
·
ba11-1h8
[0356]
·
g3cp v15-ba11
[0357]
·
g3cp g4-ba11
[0358]
·
b1-g3cp cys
[0359]
·
g3cp-ba11 cys
[0360]
·
ba11-g3cp cys
[0361]
·
1h8-ba11 cys
[0362]
·
ba11-1h8 cys
[0363]
·
g3cp v15-ba11 cys
[0364]
·
g3cp g4-ba11 cys
[0365]
·
p3a1g1ae3-(l2)-g3cpg4
[0366]
·
g3cpg4(l2)
‑‑
p3a1g1ae3
[0367]
·
p3a1g1ae3-(l2)-g3cpg4 cys
[0368]
·
g3cpg4-(l2)-p3a1g1ae3 cys
[0369]
·
p3a1-(l2)-ba11-(l2)-g3cp
[0370]
·
p3a1-(l2)-g3cp-(l2)-ba11
[0371]
·
ba11-(l2)-g3cp-(l2)-p3a1
[0372]
·
ba11-(l2)-p3a1-(l2)-g3cp
[0373]
·
p3a1-(l2)-ba11-(l2)-1h8
[0374]
·
ba11-(l2)-p3a1-(l2)-1h8
[0375]
·
p3a1-(l2)-ba11-(l2)-g3cp cys
[0376]
·
p3a1-(l2)-g3cp-(l2)-ba11 cys
[0377]
·
ba11-(l2)-g3cp-(l2)-p3a1 cys
[0378]
·
ba11-(l2)-p3a1-(l2)-g3cp cys
[0379]
·
p3a1-(l2)-ba11-(l2)-1h8 cys
[0380]
·
ba11-(l2)-1p3a1-(l2)-1h8 cys
[0381]
其中：
[0382]
g3cp是
[0383]
asvnqtprtatketgesltincvvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypwgagapynvqwydgagtvltvn(seq id no:50)
[0384]
1h8是
[0385]
asvnqtprtatketgesltincvvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypwgagapssvqwydgagtvltvn(seq id no:61)
[0386]
g3cp g4是
[0387]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltdanyglaatywyrknpgssnkerisisgrysesvnkgtmsftltisslqpedsatyycraypwgagapynvqwydgagtkveik(seq id no:71)
[0388]
g3cp v15是
[0389]
asvtqsprsasketgesltitcrvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgrysesvnkrtmsfslrissltvedsatyyckaypwgagapynvqwydgqgtklevk(seq id no:72)
[0390]
ba11是trvdqspsslsasvgdrvtitcvltdtsyplystywyrknpgssnkeqisisgrysesvnkgtksftltisslqpedsatyycramstniwtgdgagtkveik(seq id no:95)
[0391]
p3a1 g1 ae3是
[0392]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltgtryglystywyrknpgssdeerisisgrysesvnkgtksftltisslqpedsatyycrarearhpwlrqwydgagtkveik
[0393]
(seq id no:77)
[0394]
以及
[0395]
当没有定义接头时，(-)对应于接头wobbe-g5s，wobbe-g5s是pgvqpspgggggs(seq id no：96)，
[0396]-(l2)-对应于接头wobbe-g4s-gm，wobbe-g4s-gm为pgvqpapggggs(seq id no：90)。
[0397]
cys
–
对应于包含c末端标签的cys
–
例如qackahhhhhhgaefeqkliseedl(seq id no：97)。
[0398]
重组双互补位融合蛋白二聚体还可以通过将本文公开的任何重组融合蛋白、特别是本文公开的环文库变体融合到fc融合体的一个臂上并且通过将结合物融合到另一个臂上的不同ror1表位来制备。
[0399]
在某些实施方式中，可以表达带有n末端标签或c末端标签的本发明的特异性结合分子或重组融合体以协助纯化。示例包括但不限于his6和/或myc。此外，n末端标签或c末端标签可被进一步工程改造以包含额外的半胱氨酸残基作为缀合点。因此，应当理解，在本发明的所有方面中提及的特异性结合分子或重组融合体还旨在涵盖具有各种n末端标签或c末端标签的此类分子，所述标签还可以包括用于缀合的额外的半胱氨酸。
[0400]
下面列出了其他重组融合体。应当理解，下面没有列出接头和vnar或融合伴侣的每种组合。然而，所有此类组合均明确地涵盖在本发明内。
[0401][0402]
vnar结构域之间的接头优选但不限于：(g4s)5(seq id no：87)、(g4s)3(seq id no：86)、(g4s)7(seq id no：116)、pgvqpspggggs(seq id no：89)(wobbe-g4s)、pgvqpapggggs(seq id no：90)(wobbe-g4s gm)、pgvqpcpgggggs(seq id no：177)(wobbecys-g4s)，并且其中不同接头的不同组合可以在同一构建体内组合。wobbecys-g4s序列还包含单个半胱氨酸残基，以促进有效负载与蛋白质的位点选择性生物缀合，在该接头中，使用硫醇介导的化学偶联策略。使用该接头序列进行生物缀合是有利的，因为还原的半胱氨酸的再氧化和封端被最小化，从而导致在生物缀合反应中蛋白质高产地转化为相应的缀合物。
[0403]
由此，额外的c末端(或n末端)标签序列可以存在或可以不存在。
[0404]
c末端标签包括但不限于：含有聚组氨酸序列以促进纯化的标签(例如his6)、含有c-myc序列(例如eqkliseedl(seq id no：112))以能够检测的标签，和/或含有半胱氨酸残基以能够使用硫醇反应性有效负载和探针及其组合进行标记和生物缀合的标签。优选的c末端标签包括但不限于：
[0405]
qasgahhhhhhgaefeqkliseedl(seq id no:98)
[0406]
qacgahhhhhhgaefeqkliseedl(seq id no:99)
[0407]
qackahhhhhhgaefeqkliseedl(seq id no:97)
[0408]
aaahhhhhhgaefeqkliseedl(seq id no:100)
[0409]
acahhhhhhgaefeqkliseedl(seq id no:101)
[0410]
qasgahhhhhh(seq id no:102)
[0411]
qacgahhhhhh(seq id no:103)
[0412]
qackahhhhhh(seq id no:104)
[0413]
aaahhhhhh(seq id no:105)
[0414]
acahhhhhh(seq id no:106)
[0415]
qasga(seq id no:107)
[0416]
qacga(seq id no:108)
[0417]
qacka(seq id no:109)
[0418]
aca(seq id no:110)
[0419]
sapsa(seq id no:111)
[0420]
其中：
[0421]
g3cp是
[0422]
asvnqtprtatketgesltincvvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypwgagapynvqwydgagtvltvn(seq id no:50)
[0423]
g3cp g4是
[0424]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltdanyglaatywyrknpgssnkerisisgrysesvnkgtmsftltisslqpedsatyycraypwgagapynvqwydgagtkveik(seq id no:71)
[0425]
ba11是trvdqspsslsasvgdrvtitcvltdtsyplystywyrknpgssnkeqisisgrysesvnkgtksftltisslqpedsatyycramstniwtgdgagtkveik(seq id no:95)
[0426]
p3a1 g1 ae3是
[0427]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltgtryglystywyrknpgssdeerisisgrysesvnkgtksftltisslqpedsatyycrarearhpwlrqwydgagtkveik
[0428]
(seq id no:77)
[0429]
b1g4是
[0430]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltdanyglaatywyrknpgssnkerisisgrysesvnkgtmsftltisslqpedsatyycraypwgagapwlvqwydgagtkveik(seq id no:51)
[0431]
如上所述，vnar和接头的所有组合均明确涵盖在本文中。
[0432]
本文还涵盖vnar的人源化衍生物。
[0433]
还根据第三方面，提供了重组融合体，其包括第一方面的ror1特异性抗原结合分子和重组毒素。重组毒素的实例包括但不限于假单胞菌外毒素pe38和白喉毒素。
[0434]
还根据第三方面，提供了重组融合体，其包括第一方面的ror1特异性抗原结合分子和重组cd3结合蛋白。重组ror1和cd3结合剂的例子包括但不限于：
[0435]
b1g4
–
[wgm]
–
cd3
[0436]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltdanyglaatywyrknpgssnkerisisgrysesvnkgtmsftl
tisslqpedsatyycraypwgagapwlvqwydgagtkveikpgvqpapggggsdiklqqsgaelarpgasvkmscktsgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvssggggsggggsggggsdiqltqspaimsaspgekvtmtcrasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtskvasgvpyrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqwssnpltfgagtklelkshhhhhh(seq id no:117)
[0437]
g3cp
–
[wgm]
–
cd3
[0438]
asvnqtprtatketgesltincvvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypwgagapynvqwydgagtvltvnpgvqpapggggsdiklqqsgaelarpgasvkmscktsgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvssggggsggggsggggsdiqltqspaimsaspgekvtmtcrasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtskvasgvpyrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqwssnpltfgagtklelkshhhhhh(seq id no:118)
[0439]
g3cpg4
–
[wgm]-cd3
[0440]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltdanyglaatywyrknpgssnkerisisgrysesvnkgtmsftltisslqpedsatyycraypwgagapynvqwydgagtkveikpgvqpapggggsdiklqqsgaelarpgasvkmscktsgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvssggggsggggsggggsdiqltqspaimsaspgekvtmtcrasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtskvasgvpyrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqwssnpltfgagtklelkshhhhhh(seq id no:119)
[0441]
p3a1g1ae3
–
[wgm]
–
cd3
[0442]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltgtryglystywyrknpgssdeerisisgrysesvnkgtksftltisslqpedsatyycrarearhpwlrqwydgagtkveikpgvqpapggggsdiklqqsgaelarpgasvkmscktsgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvssggggsggggsggggsdiqltqspaimsaspgekvtmtcrasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtskvasgvpyrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqwssnpltfgagtklelkshhhhhh(seq id no:120)
[0443]
b1g4
–
[wgm]
–
ba11-[g4s]-cd3
[0444]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltdanyglaatywyrknpgssnkerisisgrysesvnkgtmsftltisslqpedsatyycraypwgagapwlvqwydgagtkveikpgvqpapggggstrvdqspsslsasvgdrvtitcvltdtsyplystywyrknpgssnkeqisisgrysesvnkgtksftltisslqpedsatyycramstniwtgdgagtkveikggggsdiklqqsgaelarpgasvkmscktsgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvssggggsggggsggggsdiqltqspaimsaspgekvtmtcrasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtskvasgvpyrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqwssnpltfgagtklelkshhhhhh(seq id no:121)
[0445]
g3cp
–
[wgm]
–
ba11-[g4s]-cd3
[0446]
asvnqtprtatketgesltincvvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypwgagapynvqwydgagtvltvnpgvqpapggggstrvdqspsslsasvgdrvtitcvltdtsyplystywyrknpgssnkeqisisgrysesvnkgtksftltisslqpedsatyycramstniwtgdgagtkveikggggsdiklqqsgaelarpgasvkmscktsgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdk
atlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvssggggsggggsggggsdiqltqspaimsaspgekvtmtcrasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtskvasgvpyrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqwssnpltfgagtklelkshhhhhh(seq id no:122)
[0447]
g3cpg4
–
[wgm]
–
ba11-[g4s]-cd3
[0448]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltdanyglaatywyrknpgssnkerisisgrysesvnkgtmsftltisslqpedsatyycraypwgagapynvqwydgagtkveikpgvqpapggggstrvdqspsslsasvgdrvtitcvltdtsyplystywyrknpgssnkeqisisgrysesvnkgtksftltisslqpedsatyycramstniwtgdgagtkveikggggsdiklqqsgaelarpgasvkmscktsgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvssggggsggggsggggsdiqltqspaimsaspgekvtmtcrasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtskvasgvpyrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqwssnpltfgagtklelkshhhhhh(seq id no:123)
[0449]
p3a1g1ae3
–
[wgm]
–
ba11-[g4s]-cd3
[0450]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltgtryglystywyrknpgssdeerisisgrysesvnkgtksftltisslqpedsatyycrarearhpwlrqwydgagtkveikpgvqpapggggstrvdqspsslsasvgdrvtitcvltdtsyplystywyrknpgssnkeqisisgrysesvnkgtksftltisslqpedsatyycramstniwtgdgagtkveikggggsdiklqqsgaelarpgasvkmscktsgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvssggggsggggsggggsdiqltqspaimsaspgekvtmtcrasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtskvasgvpyrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqwssnpltfgagtklelkshhhhhh(seq id no:124)
[0451]
p3a1
–
[wgm]
–
g3cp-[g4s]-cd3
[0452]
trvdqtprtatketgesltincvltdtsyglystswfrknpgttdwermsiggryvesvnkgaksfslrikdltvadsatyyckarearhpwlrqwydgagtvltvnpgvqpapggggsasvnqtprtatketgesltincvvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypwgagapynvqwydgagtvltvnggggsdiklqqsgaelarpgasvkmscktsgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvssggggsggggsggggsdiqltqspaimsaspgekvtmtcrasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtskvasgvpyrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqwssnpltfgagtklelkshhhhhh(seq id no:125)
[0453]
p3a1
–
[wgm]
–
g3cpg4-[g4s]-cd3
[0454]
trvdqtprtatketgesltincvltdtsyglystswfrknpgttdwermsiggryvesvnkgaksfslrikdltvadsatyyckarearhpwlrqwydgagtvltvnpgvqpapggggstrvdqspsslsasvgdrvtitcvltdanyglaatywyrknpgssnkerisisgrysesvnkgtmsftltisslqpedsatyycraypwgagapynvqwydgagtkveikggggsdiklqqsgaelarpgasvkmscktsgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvssggggsggggsggggsdiqltqspaimsaspgekvtmtcrasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtskvasgvpyrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqwssnpltfgagtklelkshhhhhh(seq id no:126)
[0455]
p3a1g1ae3
–
[wgm]
–
g3cp-[g4s]-cd3
[0456]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltgtryglystywyrknpgssdeerisisgrysesvnkgtksftltisslqpedsatyycrarearhpwlrqwydgagtkveikpgvqpapggggsasvnqtprtatketgesltincvvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypwgagapynvqwydg
agtvltvnggggsdiklqqsgaelarpgasvkmscktsgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvssggggsggggsggggsdiqltqspaimsaspgekvtmtcrasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtskvasgvpyrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqwssnpltfgagtklelkshhhhhh(seq id no:127)
[0457]
p3a1g1ae3
–
[wgm]
–
g3cpg4-[g4s]-cd3
[0458]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltgtryglystywyrknpgssdeerisisgrysesvnkgtksftltisslqpedsatyycrarearhpwlrqwydgagtkveikpgvqpapggggstrvdqspsslsasvgdrvtitcvltdanyglaatywyrknpgssnkerisisgrysesvnkgtmsftltisslqpedsatyycraypwgagapynvqwydgagtkveikggggsdiklqqsgaelarpgasvkmscktsgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvssggggsggggsggggsdiqltqspaimsaspgekvtmtcrasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtskvasgvpyrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqwssnpltfgagtklelkshhhhhh(seq id no:128)
[0459]
p3a1g1ae3
–
[wgm]
–
d3-[g4s]-cd3
[0460]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltgtryglystywyrknpgssdeerisisgrysesvnkgtksftltisslqpedsatyycrarearhpwlrqwydgagtkveikpgvqpapggggsasvnqtprtatketgesltincvltdtsyglystswfrknpgttdwermsiggryvesvnkraksfslrikdltvadsatyyckaqsgmaistgsghgynwydgagtvltvnggggsdiklqqsgaelarpgasvkmscktsgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvssggggsggggsggggsdiqltqspaimsaspgekvtmtcrasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtskvasgvpyrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqwssnpltfgagtklelkshhhhhh(seq id no:129)
[0461]
本领域已知的任何cd3结合序列及其变体可以代入到上文序列中。例如：
[0462]
ucl okt3序列(wo2019008379)
[0463]
qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgytftrytmhwvrqapgqglewmgyinpsrgytnynqkfkdrvtitadkststaymelsslrsedtavyycaryyddhycldywgqgtmvtvssveggsggsggsggsggvddiqmtqspsslsasvgdrvtitcsasssvsymnwyqqkpgkapkrliydtsklasgvpsrfsgsgsgteftltisslqpedfatyycqqwssnpftfgqgtkveik(seq id no:130)
[0464]
harpoon id20(wo2016187594)
[0465]
diklqqsgaelarpgasvkmscktsgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvssveggsggsggsggsggvddiqltqspaimsaspgekvtmtcrasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtskvasgvpyrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqwssnpltfgagtklelk(seq id no:131)
[0466]
根据第四方面，本发明提供了一种重组融合蛋白，包含抗原结合分子或其功能变体，所述抗原结合分子包含式(i)所示的氨基酸序列：
[0467]
fw1-cdr1-fw2-hv2-fw3a-hv4-fw3b-cdr3-fw4
ꢀꢀꢀꢀ(i)[0468]
其中
[0469]
fw1是框架区；
[0470]
cdr1是cdr序列；
[0471]
fw2是框架区；
[0472]
hv2是高变序列；
[0473]
fw3a是框架区；
[0474]
hv4是高变序列；
[0475]
fw3b是框架区；
[0476]
cdr3是cdr序列；
[0477]
fw4是框架区；
[0478]
其中所述抗原结合分子与免疫球蛋白fc区的片段融合，其中免疫球蛋白fc区的片段被工程改造以与免疫球蛋白fc区的第二片段二聚化。
[0479]
在一个实施方式中，免疫球蛋白fc区的片段选自由fc重链、ch2区和ch3区组成的组。
[0480]
在一个实施方式中，免疫球蛋白fc区的片段是fc重链。
[0481]
fc区可被工程改造以减少fcγr结合。因此，本文公开的fc区可被工程改造以减少fcγr结合。
[0482]
如本文所用，“工程改造以二聚化”的免疫球蛋白fc区可包含至少一个氨基酸取代。通常，至少一个氨基酸取代促进与免疫球蛋白fc区的第二片段的相互作用和/或缔合，和/或使得与免疫球蛋白fc区的第二片段的相互作用和/或缔合在能量上更有利，从而促进二聚化和/或使二聚化在能量上更有利。此类重组融合蛋白在制备双特异性和/或双互补位结合物中可能具有特殊用途。
[0483]
通过将被工程改造以二聚化的两条不同的fc重链配对来生成基于fc的双特异性和/或双互补位结合物的方法是本领域已知的。这些方法使得fc区能够由两条不同的重链组装而成，每条重链均与具有不同结合特征的靶标结合结构域或序列融合。靶标结合结构域或序列可以针对不同的靶标以生成多特异性结合物和/或针对同一靶标上的不同区域或表位以生成双互补位结合蛋白。多个结合结构域或序列可以与fc序列融合以产生多特异性或多互补位结合物或在同一蛋白质内的多特异性多互补位结合物。通过两个不同fc重链或其片段的异二聚化生成这些不对称双特异性和/或双互补位结合物的方法包括但不限于：杵-臼(y-t)、杵-臼(cw-csav)、ch3电荷配对、fab-arm交换、seed技术、beat技术、ha-tf、zw1方法、biclonic方法、ew-rvt和triomab。参见例如，brinkman&kontermann,(2017)mabs,9:2,182-212；klein et al(2012)mabs 4:6,653
–
663；wang et al(2019)antibodies,8,43；和dietrich et al(2020)bba-proteins and proteomics 1868 140250；其中每一个都通过引用整体并入本文。
[0484]
在一个实施方式中，免疫球蛋白fc区的片段通过选自由以下组成的组中的方法被工程改造以与免疫球蛋白fc区的第二片段二聚化：杵-臼(y-t)、杵-臼(cw-csav)、ch3电荷配对、fab-arm交换、seed技术、beat技术、ha-tf、zw1方法、biclonic方法、ew-rvt和triomab。
[0485]
杵-臼(y-t)可以在第一ch3结构域中包含t366y取代和在第二ch3结构域中包含y407t取代。
[0486]
杵-臼(cw-csav)可以在第一ch3结构域中包含一个或多个(优选全部)以下取代：s354c、t366w。杵-臼(cw-csav)可以在第二ch3结构域中包含一个或多个(优选全部)以下取代：y349c、t366s、l368a、y407v。杵-臼(cw-csav)可以在ch3中包含二硫键。
[0487]
ch3电荷配对可以在第一ch3结构域中包含一个或多个(优选全部)以下取代：
k392d、k409d。ch3电荷配对可以在第二ch3结构域中包含一个或多个(优选全部)以下取代：e356k、d399k。
[0488]
fab-arm交换可以在第一ch3结构域中包含k409r取代和在第二ch3结构域中包含f405l取代。fab-arm交换和duobody捕获相同的fc变化。因此，duobody技术可以在第一ch3结构域中包含k409r取代和在第二ch3结构域中包含f405l取代。
[0489]
seed技术可以合并已知的取代，和/或产生igg/a嵌合体。通过设计链交换工程改造结构域(seed)异二聚体，开发了允许fc链异二聚体组装的ch3界面的互补性。这些seed ch3结构域由源自人iga和igg ch3序列(ag seed ch3和ga seed ch3)的交替片段组成，并用于生成所谓的seedbodies(davis et al(2010)peds23,4,195-202，通过引用将其全部内容并入)。由于分子模型表明ag seed ch3中与fcrn的相互作用受到损害，因此ch2-ch3连接处的残基恢复为igg序列。药代动力学研究证实seedbodies的半衰期与其他fc融合蛋白和igg1相当。
[0490]
beat技术将人t细胞受体的恒定α和β结构域设计到igg1 ch3二聚体界面中，以驱动异二聚化(skegro et al(2017)jbc 292(23)9745-9759)。额外的d410q突变可以进一步增加该系统中异二聚体的形成(stutz&blein 2020jbc 295(28)9392-9408)。
[0491]
ha-tf可以在第一ch3结构域中包含一个或多个(优选全部)以下取代：s364h、f405a。ha-tf可以在第二ch3结构域中包含一个或多个(优选全部)以下取代：y349t、t394f。
[0492]
zw1方法可以在第一ch3结构域中包含一个或多个(优选全部)以下取代：t350v、l351y、f405a、y407v。zw1方法可以在第二ch3结构域中包含一个或多个(优选全部)以下取代：t350v、t366l、k392l、t394w。
[0493]
biclonic方法可以在第一ch3结构域中包含一个或多个(优选全部)以下取代：366k( 351k)。biclonic方法可以在第二ch3结构域中包含一个或多个(优选全部)以下取代：351d，或在349、368、349、或349 355位的e或d。
[0494]
ew-rvt可以在第一ch3结构域中包含一个或多个(优选全部)以下取代：k360e、k409w。ew-rvt可以在第二ch3结构域中包含一个或多个(优选全部)以下取代：q347r、d399v、f405t。ew-rvt可以在ch3中包含二硫键。可以通过将y349c进一步并入第一ch3结构域和将s354c进一步并入第二ch3结构域来支持二硫桥。
[0495]
triomab可通过将小鼠杂交瘤与大鼠杂交瘤融合来形成，从而产生双特异性、不对称的杂合igg分子。然后可以发生轻链与其相应重链的优先配对。
[0496]
在一个实施方式中，免疫球蛋白fc区的片段的一个或多个残基包含适合于与包含一个或多个相应的氨基酸突变的免疫球蛋白fc区的第二片段进行杵-臼(kih)二聚化的一个或多个氨基酸取代。
[0497]
在一个实施方式中，一个或多个氨基酸取代选自由t366y、y407t、s354c、t366w、y349c、t366s、l368a和y407v组成的组。
[0498]
在一个实施方式中，一个或多个氨基酸取代选自由t366y和y407t组成的组。
[0499]
在一个实施方式中，抗原结合分子是ror1特异性抗原结合分子。
[0500]
重组融合蛋白可包含根据seq id no：146或seq id no：147的序列。
[0501]
g3cp hfc(s239c y407t)seq id no:146
[0502]
asvnqtprtatketgesltincvvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslr
ikdltvadsatyyckaypwgagapynvqwydgagtvltvnggggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapellggpcvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsffltskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0503]
g3cpg4 hfc(s239c y407t)seq id no:147
[0504]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltdanyglaatywyrknpgssnkerisisgrysesvnkgtmsftltisslqpedsatyycraypwgagapynvqwydgagtkveikggggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapellggpcvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsffltskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0505]
重组融合蛋白可包含根据seq id no：194、seq id no：195或seq id no：196的序列。
[0506]
1h8 hfc(s239c y407t)seq id no:194
[0507]
asvnqtprtatketgesltincvvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypwgagapssvqwydgagtvltvnggggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapellggpcvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsffltskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0508]
1h8 g4 hfc(s239c y407t)seq id no:195
[0509]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltdanyglaatywyrknpgssnkerisisgrysesvnkgtmsftltisslqpedsatyycraypwgagapssvqwydgagtkveikggggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapellggpcvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsffltskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0510]
1h8 v15 hfc(s239c y407t)seq id no:196
[0511]
asvtqsprsasketgesltitcrvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgrysesvnkrtmsfslrissltvedsatyyckaypwgagapssvqwydgqgtklevkggggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapellggpcvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsffltskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0512]
重组融合蛋白可包含根据seq id no：148的序列。
[0513]
p3a1 hfc(s239c t366y)seq id no:148
[0514]
trvdqtprtatketgesltincvltdtsyglystswfrknpgttdwermsiggryvesvnkgaksfslrikdltvadsatyyckarearhpwlrqwydgagtvltvnggggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapellggpcvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvslyclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0515]
重组融合蛋白可以包含根据seq id no：191或seq id no：192的序列。
[0516]
g3cp hfc(s239c t366y)seq id no:191
[0517]
asvnqtprtatketgesltincvvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypwgagapynvqwydgagtvltvnggggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapellggpcvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvslyclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0518]
g3cpg4 hfc(s239c t366y)seq id no:192
[0519]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltdanyglaatywyrknpgssnkerisisgrysesvnkgtmsftltisslqpedsatyycraypwgagapynvqwydgagtkveikggggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapellggpcvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvslyclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0520]
重组融合蛋白可包含根据seq id no：197、seq id no：198或seq id no：199的序列。
[0521]
1h8 hfc(s239c t366y)seq id no:197
[0522]
asvnqtprtatketgesltincvvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypwgagapssvqwydgagtvltvnggggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapellggpcvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvslyclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0523]
1h8 g4 hfc(s239c t366y)seq id no:198
[0524]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltdanyglaatywyrknpgssnkerisisgrysesvnkgtmsftltisslqpedsatyycraypwgagapssvqwydgagtkveikggggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapellggpcvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvslyclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0525]
1h8 v15 hfc(s239c t366y)seq id no:199
[0526]
asvtqsprsasketgesltitcrvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgrysesvnkrtmsfslrissltvedsatyyckaypwgagapssvqwydgqgtklevkggggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapellggpcvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvslyclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0527]
重组融合蛋白可以包含根据seq id no：193的序列。
[0528]
p3a1 hfc(s239c y407t)seq id no:193:
[0529]
trvdqtprtatketgesltincvltdtsyglystswfrknpgttdwermsiggryvesvnkgaksfslrikdltvadsatyyckarearhpwlrqwydgagtvltvnggggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapellggpcvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsffltskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0530]
重组融合蛋白可以是包含seq id no：146、147、194、195、196、148、191、191、192、
193、197、198和199中的任意一个或任意两个的双互补位二聚体。双互补位二聚体可以包含包含y407t点突变的seq id no：146、147、194、195、196和193中的任一个。双互补位二聚体可包含包含t366y点突变的seq id no：148、191、192、197、198和199中的任一个。双互补位二聚体可包含seq id no：146和seq id no：148或seq id no：147和seq id no：148。本文公开的任何重组融合蛋白可以与本文公开的任何接头和有效负载相关联。本文公开的任何双互补位二聚体可以与本文公开的任何接头和有效负载相关联。缀合可以通过双互补位二聚体中的任意一个或多个s239c残基。优选地，双互补位二聚体可以与接头和有效负载vc-pab-eda-pnu相关联。优选地，双互补位二聚体包含与vc-pab-eda-pnu缀合的g3cp hfc(s239c y407t)(seq id no：146)和p3a1 hfc(s239c t366y)(seq id no：148)，或与vc-pab-eda-pnu缀合的g3cpg4 hfc(s239c y407t)(seq id no：147)和p3a1 hfc(s239c t366y)(seq id no：148)，这些已显示出在体内非常有效。
[0531]
seq id no：146、147、194、195、196、148、191、191、192、193、197、198和199包括s239c突变，用于缀合反应。当重组融合蛋白未缀合(例如未与蒽环类(pnu)衍生物缀合)时，不需要s239c突变，并且位置239可以是s而不是c。因此，在替代实施方式中，重组融合蛋白或双互补位二聚体可包含根据seq id no：146、147、194、195、196、148、191、191、192、193、197、198和199中任一个的序列，但每个序列不包括s239c突变。
[0532]
因此，重组融合蛋白可包含根据seq id no：165或seq id no：166的序列。
[0533]
g3cp-hfc(y407t)seq id no:165:
[0534]
asvnqtprtatketgesltincvvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypwgagapynvqwydgagtvltvnggggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsffltskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0535]
g3cp g4-hfc(y407t)seq id no:166:
[0536]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltdanyglaatywyrknpgssnkerisisgrysesvnkgtmsftltisslqpedsatyycraypwgagapynvqwydgagtkveikggggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsffltskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0537]
重组融合蛋白可包含根据seq id no：200、seq id no：201或seq id no：202的序列。
[0538]
1h8 hfc(y407t)seq id no:200
[0539]
asvnqtprtatketgesltincvvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypwgagapssvqwydgagtvltvnggggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsffltskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0540]
1h8 g4 hfc(y407t)seq id no:201
[0541]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltdanyglaatywyrknpgssnkerisisgrysesvnkgtmsftlt
isslqpedsatyycraypwgagapssvqwydgagtkveikggggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsffltskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0542]
1h8 v15 hfc(y407t)seq id no:202
[0543]
asvtqsprsasketgesltitcrvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgrysesvnkrtmsfslrissltvedsatyyckaypwgagapssvqwydgqgtklevkggggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsffltskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0544]
重组融合蛋白可以包含根据seq id no：167的序列。
[0545]
p3a1 hfc(t366y)seq id no:167:
[0546]
trvdqtprtatketgesltincvltdtsyglystswfrknpgttdwermsiggryvesvnkgaksfslrikdltvadsatyyckarearhpwlrqwydgagtvltvnggggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvslyclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0547]
重组融合蛋白可以包含根据seq id no：188或seq id no：189的序列。
[0548]
g3cp hfc(t366y)seq id no:188
[0549]
asvnqtprtatketgesltincvvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypwgagapynvqwydgagtvltvnggggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvslyclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0550]
g3cpg4 hfc(t366y)seq id no:189
[0551]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltdanyglaatywyrknpgssnkerisisgrysesvnkgtmsftltisslqpedsatyycraypwgagapynvqwydgagtkveikggggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvslyclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0552]
重组融合蛋白可包含根据seq id no：203、seq id no：204或seq id no：205的序列。
[0553]
1h8 hfc(t366y)seq id no:203
[0554]
asvnqtprtatketgesltincvvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypwgagapssvqwydgagtvltvnggggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvslyclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0555]
1h8 g4 hfc(t366y)seq id no:204
[0556]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltdanyglaatywyrknpgssnkerisisgrysesvnkgtmsftltisslqpedsatyycraypwgagapssvqwydgagtkveikggggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvslyclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0557]
1h8 v15 hfc(t366y)seq id no:205
[0558]
asvtqsprsasketgesltitcrvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgrysesvnkrtmsfslrissltvedsatyyckaypwgagapssvqwydgqgtklevkggggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvslyclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0559]
重组融合蛋白可以包含根据seq id no：190的序列：
[0560]
p3a1 hfc(y407t)seq id no:190
[0561]
trvdqtprtatketgesltincvltdtsyglystswfrknpgttdwermsiggryvesvnkgaksfslrikdltvadsatyyckarearhpwlrqwydgagtvltvnggggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsffltskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0562]
根据第五方面，本发明提供了一种重组融合蛋白二聚体，其包含：
[0563]
(a)第一重组融合蛋白，其中第一重组融合蛋白是根据第三或第四方面的重组融合蛋白，和
[0564]
(b)第二重组融合蛋白，其中第二重组融合蛋白包含与免疫球蛋白fc区的第二片段融合的第二抗原结合分子，所述免疫球蛋白fc区的第二片段被工程改造以与免疫球蛋白fc区的第一片段二聚化。
[0565]
在一个实施方式中，免疫球蛋白fc区的第二片段选自由fc重链、ch2区和ch3区组成的组。
[0566]
在一个实施方式中，免疫球蛋白fc区的第二片段是fc重链。
[0567]
在一个实施方式中，免疫球蛋白fc区的第二片段通过选自由以下组成的组中的方法被工程改造以与免疫球蛋白fc区的第二片段二聚化：杵-臼(y-t)、杵-臼(cw-csav)、ch3电荷配对、fab-arm交换、seed技术、beat技术、ha-tf、zw1方法、biclonic方法、ew-rvt和triomab。
[0568]
在一个实施方式中，免疫球蛋白fc区的片段的一个或多个残基包含适合于与包含一个或多个相应的氨基酸突变的免疫球蛋白fc区的第二片段进行杵-臼(kih)二聚化的一个或多个氨基酸取代。
[0569]
在一个实施方式中，一个或多个氨基酸取代选自由t366y、y407t、s354c、t366w、y349c、t366s、l368a和y407v组成的组。
[0570]
在一个实施方式中，一个或多个氨基酸取代选自由t366y和y407t组成的组。
[0571]
本文公开的重组融合蛋白的任何序列可包含选自由t366y、y407t、s354c、t366w、y349c、t366s、l368a和y407v组成的组的任意一个或多个氨基酸取代。因此，seq id no：145
(人fc区)可通过合并选自由t366y、y407t、s354c、t366w、y349c、t366s、l368a和y407v组成的组中的任意一个或多个氨基酸取代来修饰，并且如本文描述并入重组融合蛋白中以替代人fc区序列。
[0572]
在一个实施方式中，第二抗原结合分子是ror1特异性抗原结合分子。
[0573]
在一个实施方式中，第二抗原结合分子是免疫球蛋白、免疫球蛋白fab区、fab'、fv、fv-fc、单链fv(scfv)、scfv-fc、(scfv)2、双抗体、三抗体、四抗体、双特异性t细胞衔接体(bite)、内含肽、vnar结构域、单域抗体(sdab)或vh结构域。
[0574]
在一个实施方式中：
[0575]
(a)第一重组融合蛋白包含根据seq id no：146或seq id no：147的序列，以及
[0576]
(b)第二重组融合蛋白包含根据seq id no：148的序列。
[0577]
根据第六方面，本发明提供了一种ror1特异性嵌合抗原受体(car)，其包含与至少一个跨膜区和至少一个胞内结构域融合或缀合的至少一种如本发明第一或第二方面所定义的ror1特异性抗原结合分子。
[0578]
本发明还提供了包含根据第六方面的嵌合抗原受体的细胞，该细胞优选是工程改造的t细胞。
[0579]
在本发明的第七方面，提供了一种核酸序列，其包含编码根据本发明的第一、第二、第三、第四、第五或第六方面的特异性抗原结合分子、重组融合蛋白、重组融合蛋白二聚体或嵌合抗原受体的多核苷酸序列。
[0580]
还提供了包含根据第七方面的核酸序列的运载体和包含此类核酸的宿主细胞。
[0581]
提供了用于制备第一、第二、第三、第四、第五或第六方面的特异性抗原结合分子、重组融合蛋白、重组融合蛋白二聚体或嵌合抗原受体的方法，该方法包括将包含上述多核苷酸或运载体的宿主细胞在使得所述宿主细胞产生特异性抗原结合分子、重组融合蛋白或嵌合抗原受体的条件下培养或维持，任选地，该方法还包括分离特异性抗原结合分子、重组融合蛋白或嵌合抗原受体。
[0582]
在本发明的第八方面，提供了包含第一、第二、第三、第四、第五或第六方面的特异性抗原结合分子、重组融合蛋白、重组融合蛋白二聚体或嵌合抗原受体的药物组合物。药物组合物可以含有多种药学上可接受的载体。本发明的药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法施用，包括但不限于静脉内、肌内、口服、腹膜内或局部施用。在优选的实施方式中，药物组合物可以以液体、凝胶、粉末、片剂、胶囊或泡沫的形式制备。
[0583]
第一、第二、第三、第四、第五或第六方面的特异性抗原结合分子、重组融合蛋白或嵌合抗原受体可以用于治疗。更具体地，第一、第二、第三、第四、第五或第六方面的特异性抗原结合分子、重组融合蛋白、重组融合蛋白二聚体或嵌合抗原受体可以用于治疗癌症。优选地，癌症是ror1阳性癌症类型。更优选地，癌症选自包括以下的组：血癌，如淋巴瘤和白血病、慢性淋巴细胞白血病(cll)、套细胞淋巴瘤(mcl)、b细胞急性淋巴细胞白血病(b-all)、边缘区淋巴瘤(mzl)、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、急性髓性白血病(aml)；和实体瘤，包括神经母细胞瘤、肾癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、皮肤癌、子宫癌、前列腺癌、甲状腺癌、头颈癌、膀胱癌、食道癌、胃癌或肝癌。
[0584]
本文还提供了第一、第二、第三、第四、第五或第六方面的特异性抗原结合分子、重组融合蛋白、重组融合蛋白二聚体或嵌合抗原受体在制备用于治疗有需要的患者的疾病的
药物中的用途。
[0585]
此外，根据本发明，提供了治疗需要治疗的患者的疾病的方法，该方法包括向所述患者施用治疗有效剂量的第一、第二、第三、第四、第五或第六方面的特异性抗原结合分子、重组融合蛋白、重组融合蛋白二聚体或嵌合抗原受体或第六方面的药物组合物。
[0586]
优选地，癌症是ror1阳性癌症类型。更优选地，癌症选自包括以下的组：血癌，如淋巴瘤和白血病、慢性淋巴细胞白血病(cll)、套细胞淋巴瘤(mcl)、b细胞急性淋巴细胞白血病(b-all)、边缘区淋巴瘤(mzl)、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、急性髓性白血病(aml)；和实体瘤，包括神经母细胞瘤、肾癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、皮肤癌、子宫癌、前列腺癌、甲状腺癌、头颈癌、膀胱癌、食道癌、胃癌或肝癌。
[0587]
本文还提供了一种测定样品中目标分析物的存在的方法，其包括将具有可检测标记的第一或第二方面的特异性抗原结合分子、或第三或第四方面的重组融合蛋白或重组融合蛋白、或第五方面的重组融合蛋白二聚体添加到样品中，和检测分子与目标分析物的结合。
[0588]
另外，本文提供了一种对对象的疾病部位进行成像的方法，其包括将具有可检测标记的第一或第二方面的特异性抗原结合分子、或具有可检测标记的第三方面或第四方面的重组融合蛋白或重组融合蛋白、或第五方面的重组融合蛋白二聚体施用至对象。
[0589]
本文还提供了诊断对象的疾病或医学状况的方法，包括施用第一方面或第二方面的特异性抗原结合分子、或第三方面或第四方面的重组融合蛋白或重组融合蛋白、或第五方面的重组融合蛋白二聚体。
[0590]
本文还涵盖了一种抗体、抗体片段或抗原结合分子，其与第一或第二方面的ror1特异性抗原结合分子竞争结合ror1。当在抗原结合蛋白(例如，中和性抗原结合蛋白或中和抗体)的背景下使用时，术语“竞争”意指抗原结合蛋白之间的竞争，其通过测定所确定，该测定中被测抗原结合蛋白(例如抗体或其功能片段)阻止或抑制本文定义的抗原结合分子(例如，第一方面的特异性抗原结合分子)与共同抗原(例如，在第一或第二方面的特异性抗原结合分子的情况下是ror1)的特异性结合。
[0591]
本文还描述了一种用于诊断患有癌症或癌症的倾向的对象、或用于提供所述对象的状况的预后的试剂盒，该试剂盒包含用于检测来自测试对象的样品中存在的抗原的浓度的检测工具，其中检测工具包含第一或第二方面的ror1特异性抗原结合分子、第三或第四或第五方面的重组融合蛋白或重组融合蛋白二聚体、第六方面的嵌合抗原受体或第七方面的核酸序列，所述ror1特异性抗原结合分子、重组融合蛋白、重组融合蛋白二聚体、嵌合抗原受体或核酸序列各自任选地衍生化，其中样品中存在抗原表明该对象患有癌症。优选地，抗原包括ror1蛋白，更优选地包括其胞外结构域。更优选地，该试剂盒用于鉴定样品中是否存在ror1阳性细胞，或确定其在样品中的浓度。试剂盒还可以包含用来比较测定的阳性对照和/或阴性对照和/或能被检测的标记。
[0592]
本发明还提供了一种用于诊断患有癌症或癌症的倾向的对象、或用于提供所述对象的状况的预后的方法，该方法包括检测从对象获得的样品中存在的抗原的浓度，其中检测是使用第一或第二方面的ror1特异性抗原结合分子、第三或第四或第五方面的重组融合蛋白或重组融合蛋白二聚体、第六方面的嵌合抗原受体或第七方面的核酸序列实现的，所述ror1特异性抗原结合分子、重组融合蛋白、重组融合蛋白二聚体、嵌合抗原受体或核酸序
列各自任选地衍生化，并且其中样品中存在抗原表明该对象患有癌症。
[0593]
本文还考虑了一种在体外或在患者体内杀伤表达ror1的细胞或抑制其生长的方法，该方法包括向细胞施用药学有效量或剂量的(i)第一或第二方面的ror1特异性抗原结合分子、第三或第四或第五方面的重组融合蛋白或重组融合蛋白二聚体、第六方面的核酸序列，或第七方面的car或细胞，或(ii)第八方面的药物组合物。优选地，表达ror1的细胞是癌细胞。更优选地，ror1是人ror1。
[0594]
根据第九方面，本发明提供了一种特异性抗原结合分子，其包含式(ii)所示的氨基酸序列：
[0595]
x-fw1-cdr1-fw2-hv2-fw3a-hv4-fw3b-cdr3-fw4-y
ꢀꢀꢀꢀ
(ii)
[0596]
其中
[0597]
fw1-cdr1-fw2-hv2-fw3a-hv4-fw3b-cdr3-fw4是根据第一或第二方面的ror1特异性抗原结合分子，
[0598]
x和y是任选的氨基酸序列，
[0599]
其中特异性抗原结合分子与第二部分缀合。
[0600]
在某些优选的实施方式中，根据本发明这个方面的特异性抗原结合分子可以另外与第三、第四或第五部分缀合。还考虑了其他部分的缀合。在一些情况下，第三、第四或第五部分可以与第二部分缀合。因此，应当理解，根据本发明该方面的任何部分可以具有与其缀合的另外的部分。如下所述的第二部分的优选特征的描述经必要修改后适用于第三、第四、第五或更高阶部分。
[0601]
优选地，x或y各自不存在或选自包含以下的组：免疫球蛋白、免疫球蛋白fc区、免疫球蛋白fc区的片段、fc重链、ch2区、ch3区、免疫球蛋白fab区、fab'、fv、fv-fc、单链fv(scfv)、scfv-fc、(scfv)2、双抗体、三抗体、四抗体、双特异性t细胞衔接体、内含肽、vnar结构域、单域抗体(sdab)、vh结构域或支架蛋白(affibodies、centyrins、darpins等)，或毒素(包括但不限于假单胞菌外毒素pe38、白喉毒素)。
[0602]
优选地，缀合是通过特异性抗原结合分子的氨基酸序列中的半胱氨酸残基进行的。半胱氨酸残基可以位于序列中的任何位置，包括任选的序列x或y(如果存在)中的任何位置。
[0603]
缀合可以通过在特异性抗原结合分子的氨基酸序列的n末端或c末端并入的硫醇、氨氧基或肼基部分进行。
[0604]
优选地，第二部分选自包含以下的组：可检测标记、染料、毒素、药物、前药、放射性核素或生物活性分子。
[0605]
更优选地，第二部分是至少一种选自包含以下的组中的毒素：
[0606]
·
美登木素生物碱
[0607]
·
奥利他汀
[0608]
·
蒽环类，优选pnu衍生的蒽环类
[0609]
·
卡利奇霉素
[0610]
·
鹅膏蕈碱衍生物，优选α-鹅膏蕈碱衍生物
[0611]
·
微管蛋白抑制剂
[0612]
·
倍癌霉素
[0613]
·
放射性同位素，例如发射α的放射性核素，例如227th或225ac
[0614]
·
包含有毒有效负载的脂质体
[0615]
·
蛋白质毒素
[0616]
·
紫杉烷类
[0617]
·
吡咯苯二氮类
[0618]
·
吲哚并苯二氮假二聚体和/或
[0619]
·
剪接体抑制剂
[0620]
·
cdk11抑制剂
[0621]
·
吡啶并苯二氮类
[0622]
·
伊立替康及其衍生物。
[0623]
在根据该方面的其他优选实施方式中，第二部分可以来自包含以下的组：免疫球蛋白、免疫球蛋白fc区、免疫球蛋白fc区的片段、fc重链、ch2区、ch3区、免疫球蛋白fab区、fab'、fv、fv-fc、单链fv(scfv)、scfv-fc、(scfv)2、双抗体、三抗体、四抗体、双特异性t细胞衔接体、内含肽、vnar结构域、单域抗体(sdab)、vh结构域或支架蛋白(affibodies、centyrins、darpins等)，或毒素(包括但不限于假单胞菌外毒素pe38、白喉毒素)。
[0624]
在特别优选的实施方式中，第二部分是vnar结构域，其可以与根据该方面的特异性抗原结合分子相同或不同。因此，本文明确考虑了通过化学缀合连接的vnar结构域的二聚体、三聚体或更高级的多聚体。在此类实施方式中，每个单独的vnar结构域可以具有与其他vnar结构域相同的抗原特异性，或者它们可以不同。
[0625]
根据这个方面，特异性抗原结合分子可以包含例如描述为与第一至第五方面相关的双互补位特异性抗原结合分子，该双互补位特异性抗原结合分子与另外的生物活性分子(包括但不限于用于延长半衰期的分子，例如ba11)融合，然后进一步与第二部分(包括但不限于细胞毒性有效负载)缀合。
[0626]
根据这个方面，特异性抗原结合分子可以是受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)特异性抗原结合分子。这可以是本发明第一或第二方面的ror1特异性抗原结合分子。因此，关于第一、第二和第三方面描述的任何优选特征经必要修改后适用于第六方面。
[0627]
第九方面的特异性抗原结合分子可以用于治疗。更具体地，第九方面的特异性抗原结合分子可以用于治疗癌症。优选地，癌症是ror1阳性癌症类型。更优选地，癌症选自包括以下的组：血癌，如淋巴瘤和白血病、慢性淋巴细胞白血病(cll)、套细胞淋巴瘤(mcl)、b细胞急性淋巴细胞白血病(b-all)、边缘区淋巴瘤(mzl)、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、急性髓性白血病(aml)；和实体瘤，包括神经母细胞瘤、肾癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、皮肤癌、子宫癌、前列腺癌、甲状腺癌、头颈癌、膀胱癌、食道癌、胃癌或肝癌。
[0628]
本文还提供了第九方面的特异性抗原结合分子在制备用于治疗有需要的患者的疾病的药物中的用途。
[0629]
还提供了包含第九方面的特异性抗原结合分子的药物组合物。药物组合物可以含有多种药学上可接受的载体。
[0630]
此外，根据本发明，提供了治疗需要治疗的患者的疾病的方法，该方法包括向所述患者施用治疗有效剂量的第九方面的特异性抗原结合分子或包含第九方面的特异性抗原结合分子的药物组合物。
[0631]
优选地，癌症是ror1阳性癌症类型。更优选地，癌症选自包括以下的组：血癌，如淋巴瘤和白血病、慢性淋巴细胞白血病(cll)、套细胞淋巴瘤(mcl)、b细胞急性淋巴细胞白血病(b-all)、边缘区淋巴瘤(mzl)、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、急性髓性白血病(aml)；和实体瘤，包括神经母细胞瘤、肾癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、皮肤癌、子宫癌、前列腺癌、甲状腺癌、头颈癌、膀胱癌、食道癌、胃癌或肝癌。
[0632]
本文还提供了一种测定样品中目标分析物的存在的方法，该方法包括将具有可检测标记的第九方面的特异性抗原结合分子添加到样品中并检测分子与目标分析物的结合。
[0633]
另外，本文提供了一种对对象的疾病部位进行成像的方法，包括将具有可检测标记的第九方面的特异性抗原结合分子施用至对象。
[0634]
本文还提供了一种诊断对象的疾病或医学状况的方法，包括施用第九方面的特异性抗原结合分子。
[0635]
此外，关于本发明的任何上述方面所描述的任何特征可以经必要修改后与本发明的其他方面组合。
[0636]
除了提到的序列之外，还明确公开了以下序列。这些序列中的某些涉及本文所述的本发明的分子的实例：
[0637]
[0638]
[0639][0640]
一类非常有吸引力的用作药物缀合物有效负载的dna嵌入毒素是蒽环类，因为它们作为癌症治疗中的化疗药物已得到临床验证。
[0641]
化学缀合的蛋白质药物缀合物的稳定性是一个重要的考虑因素，因为在靶向肿瘤细胞之前，强效蒽环类毒素(如pnu-159682)在患者循环中的意外释放会导致脱靶效应和不良副作用影响。从pnu缀合物释放的一些示例性分子包括从含有药物接头的不同val-cit-pab释放pnu159682衍生物。
[0642]
因此，需要能够与具有高稳定性的靶向蛋白连接的有效毒素，以避免或至少减少不期望的副作用。可选择地，设计接头有效负载，使得细胞外裂解释放效力减弱的有效负载衍生物。然而，需要保留足够的效力，以避免由于需要施用更高剂量来实现功效而导致副作用的任何减少被抵消。
[0643]
易于缀合是生产易于制造的产品的一个重要因素。本公开的有效负载可以使用马来酰亚胺基团，其可以使用简单且标准的条件与缀合伴侣上的任何可用的硫醇基团反应。此外，使用马来酰亚胺/硫醇化学进行缀合允许与引入的硫醇基团进行位点特异性缀合，例如在蛋白质序列中在工程改造的半胱氨酸残基的侧链上。在本文所述的一些情况下，可以通过在蛋白质的c或n末端处引入含有工程改造的半胱氨酸的his-myc标签(示例序列包括但不限于qackahhhhhhgaefeqkliseedl(seq id no：97)或qacgahhhhhhgaefeqkliseedl(seq id no：99))来引入半胱氨酸。
[0644]
使用非选择性标记方法(例如通过与蛋白质内的氨基官能团反应)生成的抗体/蛋白质药物缀合物，可递送含有多种不同种类且具有不同药物与抗体比例的产品。这会影响缀合物的特性，包括影响体内功效和毒性的效力和pk特性。因此，硫醇反应性有效负载非常重要，因为它们可以在简单的过程中以高产率与蛋白质中天然存在的半胱氨酸残基反应，或者与使用分子生物学/重组蛋白质表达或化学合成或通过对表达的、合成的或天然的蛋白质进行化学修饰而被工程改造到蛋白质序列中的任何点位处的特定位点的半胱氨酸残基反应。在本文描述的一些情况下，半胱氨酸被工程改造到fc融合蛋白的fc区中。
[0645]
本公开提供了适用于药物缀合物的蒽环类(pnu)衍生物。具体地，提供了pnu159682的衍生物，其缺乏c14碳和连接的羟基官能团，并且在pnu159682的c13羰基处用乙二胺(eda)基团官能化。该eda-pnu159682又可以通过eda部分的氨基，用含有马来酰亚胺的接头进行官能化。马来酰亚胺基团存在于式(v)的蒽环类(pnu)衍生物中并且也可以存在于式(vi)的蒽环类(pnu)衍生物中。此类有效负载能够与另一个分子上的游离硫醇基团反应。当游离硫醇位于蛋白质上时，可以形成蛋白质-药物缀合物(pdc)。
[0646]
令人惊讶的是，与非eda有效负载或效力稍差的释放的有效负载衍生物相比，用乙二胺(eda)基团功能化并通过马来酰亚胺基团连接到硫醇基团的pnu159682衍生物显示出更高的稳定性。更稳定的有效负载可能是有利的，因为减少了脱靶效应，进而可以减少副作用并提高患者依从性。
[0647]
pct/ep2020/067210描述了式(v)的蒽环类(pnu)衍生物：
[0648][0649]
其中[x]是选自包含以下的组的任选的间隔物：取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、一个或多个杂原子、聚乙二醇或其组合；
[0650]
[l1]和[l2]是选自由以下组成的组的任选的接头：缬氨酸(val)、瓜氨酸(cit)、丙氨酸(ala)、天冬酰胺(asn)、肽、-(ch2)
n-、-(ch2ch2o)
n-、对氨基苄氧基羰基(pab)、val-cit-pab、val-ala-pab、ala-ala-asn-pab、val-ala、asn-ala、除甘氨酸外的任何氨基酸，及其组合。
[0651]
式(v)的蒽环类(pnu)衍生物可包含[l1]、[l2]、或[l1]和[l2]。
[0652]
优选地，当[l1]和/或[l2]是肽时，所述肽不含有甘氨酸。
[0653]
本领域技术人员将清楚，当任选的间隔物和/或任选的接头不存在时，键保留在其位置上。
[0654]
优选地，[x]选自包含以下的组：聚乙二醇、优选地，[x]选自包含以下的组：聚乙二醇、其中代表与所述分子的其余部分连接的点，并且其中[r]是选自包含以下的组中的任选的间隔物：取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、一个或多个杂原子、聚乙二醇或其组合。
[0655]
最优选地，[x]是聚乙二醇。聚乙二醇可以是peg4。
[0656]
优选地，[l2]是对氨基苄氧基羰基(pab)或丙氨酸。
[0657]
优选地，蒽环类(pnu)衍生物包含[l1]和/或[l2]并且[x]是任选的。因此，[l1]和/或[l2]可以是选自由以下组成的组中的接头：缬氨酸(val)、瓜氨酸(cit)、丙氨酸(ala)、天冬酰胺(asn)、肽、-(ch2)
n-、-(ch2ch2o)
n-、对氨基苄氧基羰基(pab)、val-cit-pab、val-ala-pab、ala-ala-asn-pab、val-ala、asn-ala、除甘氨酸外的任何氨基酸，及其组合。式(v)的蒽环类(pnu)衍生物可包含[l1]、[l2]、或[l1]和[l2]。式(v)的蒽环类(pnu)衍生物可包含[l1]和/或[l2]。
[0658]
pct/ep2020/067210描述了式(v)的蒽环类(pnu)衍生物：
[0659][0660]
其中[x]是选自包含以下的组中的任选的间隔物：取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、一个或多个杂原子、聚乙二醇或其组合；
[0661]
[l1]和/或[l2]是选自由以下组成的组中的接头：缬氨酸(val)、瓜氨酸(cit)、丙氨酸(ala)、天冬酰胺(asn)、肽、-(ch2)
n-、-(ch2ch2o)
n-、对氨基苄氧基羰基(pab)、val-cit-pab、val-ala-pab、ala-ala-asn-pab、val-ala、asn-ala、除甘氨酸外的任何氨基酸，及其组合。
[0662]
其中式(v)的蒽环类(pnu)衍生物包含[l1]、[l2]、或[l1]和[l2]。
[0663]
优选地，[x]选自包含以下的组：聚乙二醇、优选地，[x]选自包含以下的组：聚乙二醇、其中代表与所述分子的其余部分连接的点，并且其中[r]是选自包含以下的组中的任选的间隔物：取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、一个或多个杂原子、聚乙二醇或其组合。
[0664]
最优选地，[x]是聚乙二醇。聚乙二醇可以是peg4。
[0665]
优选地，[l2]是对氨基苄氧基羰基(pab)或丙氨酸。
[0666]
优选地，pnu衍生物具有选自以下的结构：
[0667][0668][0669]
pct/ep2020/067210还描述了式(vi)的蒽环类(pnu)衍生物：
[0670][0671]
其中[x]是选自包含以下的组中的任选的间隔物：取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、一个或多个杂原子、聚乙二醇或其组合；
[0672]
其中[z]是反应基团。反应基团可以是适合用于缀合反应、特别是与靶标结合分子的缀合反应的任何反应基团。
[0673]
[z]因此可以是包含用于生物缀合反应的官能团的部分。用于生物缀合反应的官能团包括但不限于：
[0674]
·
马来酰亚胺或卤代烷，其用于通过硫醚和硒醚反应与蛋白质上的硫醇基或硒醇基反应；
[0675]
·
巯基，其用于与马来酰亚胺、卤代烷或硫醇官能化分子(包括蛋白质半胱氨酸残基的硫醇基团)反应；
[0676]
·
活化的二硫化物，例如吡啶基二硫醇(npys硫醇)或tnb硫醇(5-硫醇-2-硝基苯甲酸)，其与硫醇基团反应，通过硫醇二硫化物交换形成二硫键；
[0677]
·
氨基，其用于通过酰胺键形成反应与蛋白质和生物分子上的羧基连接；
[0678]
·
炔基，特别是环约束炔(ring constrained alkynes)，例如二苯并环辛炔(dbco)或双环
[0679]
[6.1.0]壬炔(bcn)，其用于通过应变促进的炔-叠氮化物环加成无铜化学与叠氮基官能化生物分子反应。可以通过例如合并非天然氨基酸对叠氮甲基-l-苯丙氨酸而将叠氮基官能团引入蛋白质中，或者使用酶介导的糖工程以连接含叠氮基的糖类似物而将叠氮基官能团引入蛋白质聚糖中；
[0680]
·
叠氮基团，其用于通过应变促进的炔-叠氮化物环加成无铜化学与炔官能化的靶标结合分子反应；
[0681]
·
氨氧基，其用于通过肟形成连接而与生物分子上的醛基和酮基反应。可以通过使用琥珀终止密码子技术将酮引入蛋白质中，例如合并非天然氨基酸对乙酰基苯丙氨酸。通过还原糖的存在，可以在生物分子上发现醛，并且可以通过n末端丝氨酸残基的高碘酸盐氧化或糖类的顺式二醇基团的高碘酸盐氧化将醛引入蛋白质中。醛基也可以通过甲酰甘氨
酸生成酶将特定序列内的蛋白质半胱氨酸转化为甲酰甘氨酸而并入蛋白质中。此外，含有甲酰甘氨酸的蛋白质已通过肼基-皮克泰-斯宾格勒(hips)连接与有效负载缀合；
[0682]
·
醛基或酮基，其用于通过肟或肼键形成连接反应而与氨氧基或酰肼或肼基官能化生物分子反应。蛋白质氨氧基和酰肼官能化蛋白质可以通过内含肽融合蛋白的切割产生。
[0683]
因此，[z]可以选自由以下组成的组：马来酰亚胺、卤代烷、巯基、活化的二硫化物(例如吡啶基二硫醇(npys硫醇)或tnb硫醇(5-硫醇-2-硝基苯甲酸))、氨基、炔基(例如环约束炔，例如二苯并环辛炔(dbco)或双环[6.1.0]壬炔(bcn))、叠氮基、氨氧基、醛基和酮基。
[0684]
[z]也可以是用于酶介导的生物缀合反应的部分。用于酶介导的缀合反应的部分包括但不限于用于分选酶(sortase)-酶介导的抗体缀合的聚gly[(gly)n]或适当的伯胺，该适当的伯胺用于细菌转谷氨酰胺酶介导的通过序列如lys-lys-gln-gly和lys-pro-glu-thr-gly而与所含的谷氨酰胺γ-羧酰胺基团的缀合。
[0685]
[z]因此可以选自由聚gly和伯胺组成的组。
[0686]
因此，根据式(vi)的pnu衍生物可以对应于式(v)的pnu衍生物，其中l1是val-cit-pab，l2不存在并且其中马来酰亚胺基团可以被如上定义的另一个反应基团替代。
[0687]
优选地，[x]选自包含以下的组：聚乙二醇、优选地，[x]选自包含以下的组：聚乙二醇、其中代表与所述分子的其余部分连接的点，并且其中[r]是选自包含以下的组中的任选的间隔物：取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、一个或多个杂原子、聚乙二醇或其组合。
[0688]
最优选地，[x]是聚乙二醇。聚乙二醇可以是peg4。
[0689]
根据式(v)或式(vi)的pnu衍生物可以与根据本发明的ror1特异性抗原结合分子或与本发明的重组融合蛋白或重组融合蛋白二聚体缀合。
[0690]
根据第十方面，本发明提供了一种靶标结合分子-药物缀合物，其包含：
[0691]
(a)根据第一、第二或第九方面的ror1特异性抗原结合分子，或第三或第四方面的重组融合蛋白或重组融合蛋白，或第五方面的重组融合蛋白二聚体，和
[0692]
(b)蒽环类(pnu)衍生物，
[0693]
其中，靶标结合分子-药物缀合物具有式(iii)的结构：
[0694][0695]
其中[x]是选自包含以下的组中的任选的间隔物：取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、一个或多个杂原子、聚乙二醇或其组合；
[0696]
[l1]和[l2]是选自由以下组成的组中的任选的接头：缬氨酸(val)、瓜氨酸(cit)、丙氨酸(ala)、天冬酰胺(asn)、肽、-(ch2)
n-、-(ch2ch2o)
n-、对氨基苄氧基羰基(pab)、val-cit-pab、val-ala-pab、ala-ala-asn-pab、val-ala、asn-ala、除甘氨酸外的任何氨基酸，及其组合；以及
[0697]
y包含根据第一、第二或第九方面的ror1特异性抗原结合分子，或第三或第四方面的重组融合蛋白或重组融合蛋白，或第五方面的重组融合蛋白二聚体。
[0698]
式(iii)的靶标结合分子-药物缀合物可以包含[l1]、[l2]、或[l1]和[l2]。
[0699]
优选地，靶标结合分子-药物缀合物当[l1]和/或[l2]是肽时，所述肽不包含甘氨酸。
[0700]
本领域技术人员将清楚，当任选的间隔物和/或任选的接头不存在时，键保留在其位置上。
[0701]
优选地，靶标结合分子-药物缀合物具有选自以下的结构：
[0702][0703][0704]
根据第十一方面，本发明提供了一种靶标结合分子-药物缀合物，其包含：
[0705]
(a)根据第一、第二或第九方面的ror1特异性抗原结合分子，或根据第三、第四或第五方面的重组融合蛋白或重组融合蛋白二聚体，和
[0706]
(b)蒽环类(pnu)衍生物，
[0707]
其中，所述靶标结合分子-药物缀合物具有式(iv)的结构：
[0708][0709]
其中[x]是选自包含以下的组中的任选的间隔物：取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、一个或多个杂原子、聚乙二醇或其组合；
[0710]
[z]是衍生自反应基团的接头，所述反应基团用于缀合所述蒽环类(pnu)衍生物和所述靶标结合分子；以及
[0711]
y包含根据第一、第二或第九方面的ror1特异性抗原结合分子，或根据第三、第四或第五方面的重组融合蛋白或重组融合蛋白二聚体。
[0712]
[z]通常是衍生自反应基团的部分，所述反应基团用于缀合所述蒽环类(pnu)衍生物和所述靶标结合分子。[z]可以是衍生自反应基团的部分，所述反应基团选自由马来酰亚胺、卤代烷、巯基、活化的二硫化物、氨基、炔基、叠氮基、氨氧基、醛基和酮基组成的组。
[0713]
因此，[z]可以选自由二硫键、酰胺键、肟键、腙键、硫醚键、1,2,3-三唑和聚gly组成的组。
[0714]
优选地，[x]选自包含以下的组：聚乙二醇、优选地，[x]选自包含以下的组：聚乙二醇、其中代表与所述分子的其余部分连接的点，并且其中[r]是选自包含以下的组中的任选的间隔物：取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、一个或多个杂原子、聚乙二醇或其组合。
[0715]
最优选地，[x]是聚乙二醇。聚乙二醇可以是peg4。
[0716]
优选地，靶标结合分子是蛋白质或核酸。靶标结合蛋白(其也可称为特异性抗原结合蛋白)的实例包括但不限于免疫球蛋白或抗体、免疫球蛋白fc区、免疫球蛋白fc区的片段、fc重链、ch2区、ch3区、免疫球蛋白fab区、fab'、fv、fv-fc、单链fv(scfv)、scfv-fc、(scfv)2、双抗体、三抗体、四抗体、双特异性t细胞衔接体、内含肽、vnar结构域、单域抗体(sdab)、vh结构域、支架蛋白(affibodies、centyrins、darpins等)。靶标结合核酸的实例包括但不限于适体。
[0717]
优选地，靶标结合分子-药物缀合物是蛋白质，并且蒽环类(pnu)衍生物与蛋白质的氨基酸序列中的含硫醇的氨基酸残基缀合或与通过蛋白质的化学修饰引入的硫醇基团缀合，例如，在特异性抗原结合蛋白的氨基酸序列的n末端或c末端并入。硫醇基团也可以被引入到其他靶标结合分子，例如核酸中。
[0718]
在第十或第十一方面的一个实施方式中，靶标结合分子-药物缀合物，y包含通过人免疫球蛋白fc区或其片段而与pnu衍生物缀合的根据本发明第一或第二方面的ror1特异性抗原结合分子，其。
[0719]
在一个实施方式中，人免疫球蛋白fc区的片段可以选自由fc重链、ch2区和ch3区组成的组。
[0720]
本文还提供了用于治疗的根据上述方面的靶标结合分子-药物缀合物。
[0721]
本文还提供了用于治疗癌症的根据以上方面的靶标结合分子-药物缀合物。
[0722]
本文还提供了根据上述方面的靶标结合分子-药物缀合物在制备用于治疗有需要的患者的疾病的药物中的用途。
[0723]
本文还提供了治疗需要治疗的患者的疾病的方法，包括向所述患者施用治疗有效剂量的根据上述方面的靶标结合分子-药物缀合物。该疾病可能是癌症。
[0724]
优选地，癌症是ror1阳性癌症类型。更优选地，癌症选自包括以下的组：血癌，如淋巴瘤和白血病、慢性淋巴细胞白血病(cll)、套细胞淋巴瘤(mcl)、b细胞急性淋巴细胞白血病(b-all)、边缘区淋巴瘤(mzl)、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、急性髓性白血病(aml)；和实体瘤，包括神经母细胞瘤、肾癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、皮肤癌、子宫癌、前列腺癌、甲状腺癌、头颈癌、膀胱癌、食道癌、胃癌或肝癌。癌症可以是间皮瘤或三阴性乳腺癌(tnbc)。间皮瘤可以是胸膜间皮瘤。
[0725]
本文还提供了药物组合物，其包含根据上述任一方面的靶标结合分子-药物缀合物和至少一种其他药学上可接受的成分。
[0726]
定义
[0727]
本发明的抗原特异性结合分子包含源自vnar分子合成文库的氨基酸序列或来自源自软骨鱼免疫的文库的氨基酸序列。术语vnar、ignar和nar也可以互换使用。
[0728]
氨基酸在本文中表示为单字母代码或三字母代码或两者。
[0729]
术语“亲和纯化”是指基于分子与化学物质或结合伴侣的特异性吸引或结合以形成组合或复合物，使得分子与杂质分离，同时保持与伴侣部分的结合或吸引，从而纯化分子。
[0730]
术语“互补决定区”或cdr(即cdr1和cdr3)是指vnar结构域的一些氨基酸残基，这些氨基酸残基的存在通常涉及抗原结合。每个vnar通常具有两个被标识为cdr1和cdr3的cdr区域。此外，每个vnar结构域包含来自“高变环”(hv)的也可参与抗原结合的氨基酸。在一些情况下，互补性决定区可包括来自cdr区和高变环的氨基酸。在其他情况下，抗原结合可能仅涉及来自单个cdr或hv的残基。根据普遍接受的vnar分子命名法，不存在cdr2区域。
[0731]“框架区”(fw)是除cdr残基之外的那些vnar残基。每个vnar通常具有五个框架区，分别标识为fw1、fw2、fw3a、fw3b和fw4。
[0732]
vnar中的fw、cdr和hv区域之间的边界并不意图是固定的，因此预计这些区域的长度和组成会有一些变化。本领域技术人员将理解这一点，特别是参考在分析这些区域中已
经进行的工作(anderson et al.,plos one(2016)11(8)；lui et al.,mol immun(2014)59,194-199；zielonka et al.,mar biotechnol(2015).17,(4)386
–
392；fennell et al.,j mol biol(2010)400.155-170；kovalenko et al.,j biol chem(2013)288.17408-17419；dooley et al.,(2006)pnas103(6).1846-1851)。尽管本文参考fw、cdr和hv区来定义本发明的分子，但不限于这些严格的定义。因此，本文明确考虑了与本领域对vnar结构域的理解一致的变化。
[0733]“密码子集合”是指用于编码所需变体氨基酸的一组不同的核苷酸三联体序列。可以例如通过固相合成来合成一组寡核苷酸，包括代表由密码子集合提供的核苷酸三联体的所有可能组合并且将编码所需氨基酸组的序列。密码子命名的标准形式是iub代码，其在本领域中是已知的并且在本文中进行了描述。
[0734]
密码子集合通常由3个斜体大写字母表示，例如nnk、nns、xyz、dvk等。因此，“非随机密码子集合”是指编码部分地、优选完全地满足如本文所述的氨基酸选择准则的选择氨基酸的密码子集合。在某些位置具有选定的核苷酸“简并性”的寡核苷酸的合成是本领域众所周知的，例如trim方法(knappek et al.；j.mol.biol.(1999),296,57-86)；garrard&henner,gene(1993),128,103)。此类具有某些密码子集合的寡核苷酸集合可以使用商业核酸合成仪(可从例如applied biosystems，foster city，ca获得)来合成，或者可以从商业上获得(例如，来自life technologies，rockville，md)。合成的具有特定密码子集合的寡核苷酸集合通常将包括具有不同序列的多个寡核苷酸，差异由密码子集合在整个序列内建立。根据本发明使用的寡核苷酸具有允许与vnar核酸模板杂交的序列，并且在适宜时还可以包括限制酶位点。
[0735]“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用(除非上下文另有说明)，并且此类名称包括细胞或细胞系的所有后代。因此，例如，诸如“转化体”和“转化的细胞”之类的术语包括原代受试细胞和源自其的培养物，而不考虑转化次数。还了解的是，由于有意或无意的突变，所有后代的dna含量可能并不完全相同。包括了具有与在最初转化的细胞中筛选出的相同功能或生物活性的突变体后代。
[0736]“控制序列”在涉及表达时是指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的dna序列。适合于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选的操纵子序列、核糖体结合位点等。真核细胞使用控制序列例如启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
[0737]
术语“外壳蛋白”是指至少一部分存在于病毒颗粒表面上的蛋白质。从功能角度来看，外壳蛋白是在宿主细胞中的病毒组装过程中与病毒颗粒相关联、并且与所组装的病毒保持关联直到病毒感染另一个宿主细胞的任何蛋白质。
[0738]
特定测定中化学实体的“检测限”是可在该测定的背景水平之上检测到的该实体的最小浓度。例如，在噬菌体elisa中，展示特定抗原结合片段的特定噬菌体的“检测限”是特定噬菌体产生的elisa信号高于不展示抗原结合片段的对照噬菌体产生的elisa信号处的噬菌体浓度。
[0739]“融合蛋白”和“融合多肽”是指具有共价连接在一起的两个部分的多肽，其中每个部分是具有不同性质的多肽。该性质可以是生物性质，例如体外或体内活性。该性质也可以是简单的化学或物理性质，例如与靶标抗原的结合、对反应的催化等。这两个部分可以通过单个肽键直接连接或通过含有一个或多个氨基酸的肽接头连接。通常，这两个部分和接头
将彼此处于阅读框内。优选地，多肽的两个部分获得自异源或不同的多肽。
[0740]
本文中的术语“融合蛋白”一般是指通过化学手段(包括氢键或盐桥)、或通过蛋白质合成经由肽键、或通过这两种方式而连接在一起的一种或多种蛋白质。通常，融合蛋白将通过dna重组技术来制备并且在本文中可以称为重组融合蛋白。
[0741]“异源dna”是引入宿主细胞中的任何dna。dna可以源自多种来源，包括基因组dna、cdna、合成dna以及这些的融合体或组合。dna可包括来自与宿主或受体细胞相同的细胞或细胞类型的dna或来自不同细胞类型的dna，例如来自同种异体或异种来源的dna。dna可以任选地包括标记基因或选择基因，例如抗生素抗性基因、温度抗性基因等。
[0742]“高度多样性位置”是指位于轻链和重链的可变区中的氨基酸的位置，当比较已知和/或天然存在的抗体或抗原结合片段的氨基酸序列时，在该位置处表现有许多不同氨基酸。高度多样性位置通常位于cdr或hv区域。
[0743]“同一性”描述两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列之间的关系，这种关系如通过比较序列所确定。同一性也意指多肽之间或多核苷酸序列之间(视情况而定)的序列相关性(同源性)程度，这种程度如通过这种序列的串段之间的匹配所确定。虽然存在许多测量两个多肽序列或两个多核苷酸序列之间的同一性的方法，但通常用于确定同一性的方法被编码在计算机程序中。用于确定两个序列之间的同一性的优选计算机程序包括但不限于gcg程序包(devereux,et al.,nucleic acids research,12,387(1984),blastp,blastn,and fasta(atschul et al.,j.molec.biol.(1990)215,403)。
[0744]
优选地，使用hgmp(人类基因组图谱计划)提供的blast计算机程序(atschul et al.,j.mol.biol.(1990)215,403-410)的默认参数，蛋白质的氨基酸序列在氨基酸水平上与本文公开的氨基酸序列具有至少45％的同源性。
[0745]
更优选地，蛋白质序列在核酸或氨基酸水平上可与如本文所示的氨基酸序列具有至少45％、46％、47％、48％、49％、50％、55％、60％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、75％、80％、85％、90％并且还更优选95％(仍更优选至少96％、97％、98％或99％)同一性。
[0746]
使用通过hgmp提供的blast计算机程序的默认参数，蛋白质还可以包含与本文公开的序列具有至少45％、46％、47％、48％、49％、50％、50％、55％、60％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
[0747]“文库”指多个vnar或vnar片段序列(例如，本发明的多肽)，或编码这些序列的核酸，这些序列在根据本发明的方法引入到这些序列中的变体氨基酸的组合方面不同。
[0748]“连接(ligation)”是在两个核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程。为了连接两个片段，片段的末端必须可彼此相容。在某些情况下，核酸内切酶消化后末端将直接可相容。然而，可能需要首先将核酸内切酶消化后通常产生的交错末端转化为平末端，以使它们适合连接。为了平化末端，在存在四种脱氧核糖核苷酸三磷酸的情况下，用约10单位的dna聚合酶i的klenow片段或t4 dna聚合酶在15℃下将dna在合适的缓冲液中处理至少15分钟。然后通过苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀或通过二氧化硅纯化来纯化dna。将要连接在一起的dna片段以大约等摩尔的量放入溶液中。该溶液还含有atp、连接酶缓冲液和连接酶，例如每0.5μgdna约10个单位的t4 dna连接酶。如果要将dna连接到运载体中，则首先通过用适当的限制性内切核酸酶消化使运载体线性化。然后用细菌碱性磷酸酶或小牛肠磷酸酶处理线性化片段，以防止在连接步骤中发生自连接。
[0749]“突变”是相对于参考核苷酸序列例如野生型序列的核苷酸的缺失、插入或取代。
[0750]“天然的”或“天然存在的”vnar是指从非合成来源鉴定的vnar，例如从离体获得的组织来源或从板鳃亚纲(elasmobranchii)动物的血清中鉴定的vnar。这些vnar可以包括在任何类型的免疫反应中产生的vnar，无论其是天然的还是以其他方式诱导的。天然vnar包括构成或编码这些抗体的氨基酸序列和核苷酸序列。如本文所用，天然vnar不同于“合成vnar”，合成vnar是指已从源序列或模板序列改变的vnar序列，例如通过在某一位置用不同的氨基酸进行氨基酸或不止一个氨基酸的替换、缺失或添加而改变的vnar序列，该不同的氨基酸提供与源抗体序列不同的抗体序列。
[0751]
术语“核酸构建体”通常指通过克隆获得的或通过化学合成产生的任何长度的核酸，其可以是dna、cdna或rna，例如mrna。dna可以是单链或双链的。单链dna可以是编码有义链，也可以是非编码链或反义链。对于治疗用途，核酸构建体优选为能够在要治疗的对象中表达的形式。
[0752]“可操作地连接(operably linked)”在涉及核酸时是指核酸与另一核酸序列处于功能关系中。例如，如果前序列或分泌前导序列的dna表达为参与多肽分泌的前蛋白，则前序列或分泌前导序列的dna与多肽的dna可操作地连接；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则其与该编码序列可操作地连接；或者，如果核糖体结合位点的位置便于翻译，则该位点与编码序列可操作地连接。一般而言，“可操作地连接”是指所连接的dna序列是邻接的，并且在分泌前导序列的情况下，是连带的并且在阅读框内。然而，增强子不必是邻接的。连接是通过在适宜的限制性位点处连接来完成的。如果这样的位点不存在，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸适配子或接头。
[0753]
术语“蛋白质”一般是指通过肽键连接在一起的多个氨基酸残基。蛋白质可以与肽、寡肽、寡聚物或多肽互换使用，并且与肽、寡肽、寡聚物或多肽含义相同，并且包括糖蛋白及其衍生物。术语“蛋白质”还旨在包括蛋白质的片段、类似物、变体和衍生物，其中所述片段、类似物、变体或衍生物保留与参考蛋白质基本上相同的生物活性或功能。蛋白质类似物和衍生物的例子包括肽核酸和darpins(设计的锚蛋白重复蛋白)。
[0754]
蛋白质的片段、类似物、变体或衍生物的长度可以是至少25个、优选30或40个、或最多50或100个、或60至120个氨基酸，这取决于其所源自的原始蛋白质序列的长度。在一些情况下，90至120、100至110个氨基酸的长度可能是适宜的。
[0755]
蛋白质的片段、衍生物、变体或类似物可以是：(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选保守氨基酸残基)取代的片段、衍生物、变体或类似物，并且这种取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的氨基酸残基；或(ii)其中一个或多个氨基酸残基包括取代基的片段、衍生物、变体或类似物；或(iii)其中另外的氨基酸与成熟多肽(例如用于纯化多肽的前导序列或辅助序列)融合的片段、衍生物、变体或类似物。根据本文的教导，此类片段、衍生物、变体和类似物被认为在本领域技术人员的范围内。
[0756]“寡核苷酸”是通过已知方法(例如使用固相技术的磷酸三酯、亚磷酸酯或亚磷酰胺化学)化学合成的长度短的单链或双链多脱氧核苷酸。其他方法包括在已知基因的完整核酸序列或者可获得与编码链互补的核酸序列的情况下，使用聚合酶链式反应(pcr)。可选择地，如果已知靶氨基酸序列，则可以使用每个氨基酸残基的已知和优选的编码残基来推断潜在的核酸序列。寡核苷酸可以在聚丙烯酰胺凝胶或分子分级柱上或通过沉淀来纯化。
当dna与非核酸杂质(可以是极性、非极性、离子等)分离时，dna则是“纯化”的。
[0757]
如本文所用，“源”或“模板”vnar是指一种vnar或vnar抗原结合片段，该vnar或vnar抗原结合片段的抗原结合序列充当进行根据本文所述的准则的多样化所基于的模板序列。抗原结合序列通常在vnar内优选地包括至少一个cdr，优选地包括框架区。
[0758]“转录调控元件”将包含以下组件中的一种或多种：增强子元件、启动子、操纵子序列、阻遏基因和转录终止序列。
[0759]“转化”是指细胞摄取dna并成为“转化体”的过程。dna摄取可以是永久的或瞬时的。“转化体”是已吸收并维持dna的细胞，如通过与dna相关的表型(例如，由dna编码的蛋白质赋予的抗生素抗性)的表达所证明的。
[0760]
起始或参考多肽(例如，源vnar或其cdr)的“变体”或“突变体”，例如融合蛋白(多肽)或异源多肽(与噬菌体异源)，是这样的多肽，该多肽：(1)具有与起始或参考多肽不同的氨基酸序列，并且(2)通过天然或人工诱变由起始或参考多肽衍生。此类变体包括例如目标多肽的氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或取代。例如，使用包含编码具有变体氨基酸(相对于源vnar或抗原结合片段中的相应位置处发现的氨基酸)的序列的非随机密码子集合的寡核苷酸产生的本发明的融合多肽将是相对于源vnar或抗原结合片段的变体多肽。因此，变体cdr是指包含相对于起始或参考多肽序列(例如源vnar或抗原结合片段的序列)的变体序列的cdr。在本文中，变体氨基酸是指与起始或参考多肽序列(例如源vnar或抗原结合片段的序列)中相应位置处的氨基酸不同的氨基酸。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以获得最终变体或突变体构建体，只要最终构建体具有所需的功能特征。氨基酸变化还可以改变多肽的翻译后过程，例如改变糖基化位点的数量或位置。
[0761]“野生型”或“参考”序列或“野生型”或“参考”蛋白质/多肽(例如外壳蛋白，或源vnar的cdr)的序列可以是通过引入突变而获得的变体多肽所衍生自的参考序列。一般来说，给定蛋白质的“野生型”序列是自然界中最常见的序列。类似地，“野生型”基因序列是该基因的自然界中最常见的序列。突变可以通过自然过程或通过人为诱导的方式引入“野生型”基因(及其编码的蛋白质)。这些过程的产物是原始“野生型”蛋白或基因的“变体”或“突变”形式。
[0762]“人源化”抗原特异性抗原结合分子可以在一个或多个氨基酸序列位置被修饰，以降低体内免疫原性的可能性，同时保留对特定抗原上的特定表位的功能性结合活性。
[0763]
抗体可变结构域的人源化是本领域公知的技术，该技术用于修饰在人以外的物种中已产生的针对治疗上有用的靶标的抗体，从而人源化形式可以避免当施用于人对象时不需要的免疫反应。almagro j.c and william strohl w.antibody engineering:humanization,affinity maturation,and selection techniques in therapeutic monoclonal antibodies:from bench to clinic.edited by an j.2009john wiley&sons,inc and in strohl w.r.and strohl l.m.,therapeutic antibody engineering,woodhead publishing 2012中总结了人源化所涉及的方法。
[0764]
尽管ignar与免疫球蛋白相比具有不同的起源，并且与免疫球蛋白可变结构域相比具有非常小的序列同源性，但免疫球蛋白和ignar可变结构域之间存在一些结构相似性，因此可以将类似的过程应用于vnar结构域。例如，wo2013/167883(其通过引用并入)提供了vnar的人源化的描述，还参见kkovalenko o.v.,et al.j biol chem.2013.288(24):
p.17408-19。
[0765]
人源化抗原特异性结合分子与野生型抗原特异性结合分子的不同之处可以在于一个或多个框架氨基酸残基被dpk-9的相应框架氨基酸残基取代。dpk-9是一种人种系vl支架，是可变κ亚组1(vκ1)的成员。dpk-9的序列根据：
[0766]
diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsissylnwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsg tdftltisslqpedfatyycqqsystpntfgqgtkveik
[0767]
(seq id no：132)。
[0768]
本文所用的术语“嵌合抗原受体(car)”可以指例如人工t细胞受体、嵌合t细胞受体或嵌合免疫受体，并且涵盖将人工特异性移植到特定免疫效应细胞上的工程改造受体。car可用于将抗原特异性结合蛋白(例如单克隆抗体或vnar)的特异性赋予t细胞，从而允许产生大量特异性t细胞，例如用于过继性细胞治疗。例如，car可将细胞的特异性定向至例如肿瘤相关抗原。car可包含胞内活化结构域、跨膜结构域和包含肿瘤相关抗原结合区的胞外结构域。在特定方面，car包含衍生自单克隆抗体的单链可变片段(scfv)与cd3-zeta跨膜和胞内结构域融合的融合体。在其他具体方面，car包含本文所述的vnar结构域与cd3-zeta跨膜和胞内结构域的融合体。其他car设计的特异性可能源自受体的配体(例如肽)或源自模式识别受体，例如dectins。在具体的实施方式中，可以通过使用对b谱系分子cd 19具有特异性的car来重新定向t细胞的特异性，从而靶向恶性b细胞。在某些情况下，可以修饰抗原识别结构域的间距以减少活化-诱导细胞死亡。在某些情况下，car包含用于额外共刺激信号传导的结构域，例如cd3-zeta、fcr、cd27、cd28、cd 137、dap 10和/或ox40。在某些情况下，分子可以与car共表达，包括共刺激分子、用于成像(例如，用于正电子发射断层摄影)的报告基因、在添加前药后有条件消融t细胞的基因产物、归巢受体、趋化因子、趋化因子受体、细胞因子和细胞因子受体。
[0769]
本文使用的术语“缀合”可以指化学连接两个或更多个化学部分的任何方法。通常，缀合将通过共价键进行。在本发明的上下文中，化学部分中的至少一个将是多肽，并且在一些情况下，缀合将涉及两个或更多个多肽，其中一个或多个可以通过重组dna技术产生。许多用于缀合多肽的系统是本领域已知的。例如，可以使用n-羟基-琥珀酰亚胺通过多肽分子中存在的赖氨酸残基实现缀合，或者使用马来酰亚胺基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯通过多肽分子中存在的半胱氨酸残基实现缀合。在一些实施方式中，缀合通过短效的可降解的键联发生，所述键联包括但不限于生理学可裂解的键联，包括酯、碳酸酯、氨基甲酸酯、硫酸酯、磷酸酯、酰氧基烷基醚、缩醛和缩酮、腙、肟和二硫键。在一些实施方式中，并入可被胞内或胞外酶如组织蛋白酶家族成员裂解的，可在还原条件或酸性ph下裂解的接头，以使得缀合的部分能够从与其缀合的多肽或蛋白质中释放。
[0770]
一种特别优选的缀合方法是使用基于内含肽的技术(us2006247417)。简而言之，将目标蛋白表达为工程改造的内含肽结构域的n末端融合体(muir 2006nature 442,517
–
518)。蛋白质-内含肽联合处后续的n至s酰基转移产生硫酯连接的中间体，该中间体可以用双氨氧基试剂或氨基硫醇进行化学裂解，分别得到所需的蛋白质c末端氨氧基或硫醇衍生物。这些c末端氨氧基和硫醇衍生物可以分别与醛/酮和马来酰亚胺官能化部分以化学选择性方式进行反应，以得到位点特异性c末端修饰的蛋白。
[0771]
在另一个优选的缀合方法中，直接表达带有额外的半胱氨酸的vnar，该额外的半
胱氨酸在vnar的c末端区域处或其附近或者并入短c末端标签序列内，从而能够与硫醇反应性有效负载例如马来酰亚胺官能化部分缀合。
[0772]
本文提及的缀合还旨在涵盖使用可以赋予许多有用性质的接头部分。接头部分包括但不限于肽序列，例如多甘氨酸、gly-ser、val-cit或val-ala。在某些情况下，可以选择接头部分，使得其可在某些条件下例如通过使用酶、亲核/碱性试剂、还原剂、光照射、亲电子/酸性试剂、有机金属和金属试剂、或氧化剂而裂解，或者可以具体选择在此类条件下的抵抗裂解的接头。
[0773]
多肽可以与多种功能部分缀合以实现多种目标。功能部分的实例包括但不限于聚合物，例如聚乙二醇，用以降低免疫原性和抗原性或提高溶解度。进一步的非限制性实例包括多肽与治疗剂或细胞毒剂的缀合。
[0774]
术语“可检测标记”在本文中用于指定实体可以通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学、化学或其他手段被可视化或以其他方式检测。可以选择可检测标记，使得其产生的信号可被测量并且其强度与结合实体的量成比例。用于标记和/或检测蛋白质和肽的多种系统是本领域已知的。标记可以是可直接检测的(即，它不需要任何进一步的反应或操作即可检测，例如，荧光团是可直接检测的)或者它可以是可间接检测的(即，它通过与另一个可检测的实体反应或结合而变得可检测，例如，半抗原在与包含报告物(例如荧光团)的适当抗体反应后可通过免疫染色来检测)。合适的可检测剂包括但不限于放射性核素、荧光团、化学发光剂、微粒、酶、比色标记、磁性标记、半抗原、分子信标和适体信标。
[0775]
本文考虑了在体外或在患者中杀伤表达ror1的细胞或抑制表达ror1的细胞生长的方法，一般来说，本文在细胞的上下文中使用的术语“杀伤”是指导致细胞死亡。这可以通过多种机制来实现，例如坏死或其他细胞损伤，或诱导细胞凋亡。当本文使用短语“抑制生长”或“抑制增殖”时，旨在涵盖防止细胞发育，更具体地涵盖防止细胞分裂。
[0776]
本文所用的烷基是含有1至40个碳原子的直链或支链、取代或未取代的基团(优选未取代的)。烷基可以在任何位置被任选取代。本文所用的术语“烯基”表示从具有至少一个碳-碳双键的直链或支链脂肪族部分中除去单个氢原子而衍生的基团。本文所用的术语“炔基”是指从具有至少一个碳-碳三键的直链或支链脂肪族部分中除去单个氢原子而衍生的基团。
[0777]
术语“烷基”、“芳基”、“杂芳基”等还包括多价种类，例如亚烷基、亚芳基、“亚杂芳基”等。亚烷基的实例包括亚乙基(-ch
2-ch
2-)和亚丙基(-ch
2-ch
2-ch
2-)。示例性亚芳基是亚苯基(-c6h
4-)，示例性亚杂芳基是亚吡啶基(-c5h3n-)。
[0778]
芳环是可具有0、1、2或更多个、优选0、1或2个环杂原子的环芳族基团。芳环可以被任选取代和/或可以与一个或多个可含有0、1、2或更多个环杂原子的芳族或非芳族环(优选芳族)稠合以形成多环系统。
[0779]
芳环包括芳基和杂芳基。芳基和杂芳基可以是单核的，即仅具有一个芳环(例如苯基或亚苯基)，或多核的，即具有两个或更多个芳环，所述两个或更多个芳环可以是稠合的(例如萘基或亚萘基)、单独共价连接的(例如联苯)、和/或稠合和单独连接的芳环的组合。优选地，芳基或杂芳基是在基本上整个基团上基本上缀合的芳族基团。芳基可含有5至40个环碳原子、5至25个碳原子、5至20个碳原子或5至12个碳原子。杂芳基可以是含有1个或多个选自n、o、s和p的环杂原子的5至40元环、5至25元环、5至20元环或5至12元环。芳基或杂芳基
可以与一个或多个芳族或非芳族环(优选芳族环)稠合以形成多环系统。
[0780]
芳基和杂芳基优选表示具有至多25个环原子的单环、双环或三环芳族或杂芳族基团，所述基团也可以包含稠环并且任选被取代。
[0781]
优选的芳基包括但不限于苯、亚联苯基、三亚苯基、[1,1':3',1'’]三联苯基-2'-亚基、萘、蒽、联萘、菲、芘、二氢芘、苝、并四苯、并五苯、苯并芘、芴、茚、茚并芴、螺二芴等。
[0782]
优选的杂芳基包括但不限于：5元环，如吡咯、吡唑、噻咯、咪唑、1,2,3-三唑、1,2,4-三唑、四唑、呋喃、噻吩、硒吩、恶唑、异恶唑、1,2-噻唑、1,3-噻唑、1,2,3-恶二唑、1,2,4恶二唑、1,2,5-恶二唑、1,3,4-恶二唑、1,2,3-噻二唑、1,2,4-噻二唑、1,2,5-噻二唑、1,3,4-噻二唑；6元环，如吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪、1,3,5-三嗪、1,2,4-三嗪、1,2,3-三嗪、1,2,4,5-四嗪、1,2,3,4-四嗪、1,2,3,5-四嗪；以及稠合系统，如咔唑、吲哚、异吲哚、吲嗪、吲唑、苯并咪唑、苯并三唑、嘌呤、萘并咪唑、菲并咪唑、吡啶咪唑、吡嗪咪唑、喹喔啉咪唑、苯并恶唑、萘并恶唑、蒽并恶唑、菲并恶唑、异恶唑、苯并噻唑、苯并呋喃、异苯并呋喃、二苯并呋喃、喹啉、异喹啉、蝶啶、苯并5,6-喹啉、苯并-6,7-喹啉、苯并-7,8-喹啉、苯并异喹啉、吖啶、吩噻嗪、吩恶嗪、苯并哒嗪、苯并嘧啶、喹喔啉、吩嗪、萘啶、氮杂咔唑(azacarbazole)、苯并咔啉、菲啶、菲咯啉、噻吩并[2,3b]噻吩、噻吩并[3,2b]噻吩、二噻吩并噻吩、二噻吩并吡啶、异苯并噻吩、二苯并噻吩、苯并噻二唑噻吩、2,5-二氢吡咯并[3,4-c]吡咯-1,4-二酮(吡咯并吡咯二酮，dpp)、2-氧代-1h-吲哚-3-亚基、[3,3'-联吡咯并[2,3-b]吡啶亚基]-2,2'(1h,1'h)-二酮(吡啶异靛)和(3e)-3-(2-氧代-1h-吲哚-3-亚基)-1h-吲哚-2-酮(异靛)，或其组合。杂芳基可以被烷基、烷氧基、硫代烷基、氟、氟烷基或另外的芳基或杂芳基取代基取代。优选杂芳基是噻吩。
[0783]
特别优选的杂原子选自o、s、n、p和si。通常，氢将使本发明分子中包含的杂原子的化合价完整，例如对于n而言，可以是-nh-或-nh2，其中涉及一个或两个其他基团。
[0784]
如本文所用，术语“任选取代的”意指任选取代的部分中的氢原子中的一个或多个被合适的取代基取代。除非另有说明，否则“任选取代的”基团可以在基团的每个可取代的位置具有合适的取代基，并且当任何给定结构中的不止一个位置可以被选自特定基团的不止一个取代基所取代时，取代基可以在每个位置是相同的或不同的。本发明预期的取代基的组合优选是导致形成稳定的化合物的取代基的组合。如本文所用，术语“稳定的”是指化合物在化学上是可行的并且能在室温(即16℃-25℃)下存在足够长的时间以允许对其进行检测、分离和/或用于化学合成。
[0785]
任何上述基团(例如，本文中称为“任选取代的”的那些，包括烷基、芳基和杂芳基)可以任选地包含一个或多个取代基，优选选自：甲硅烷基、磺基、磺酰基、甲酰基、氨基、亚氨基、次氮基、巯基、氰基、硝基、卤素、-nco、-ncs、-ocn、-scn、-c(＝o)nr0r
00
、-c(＝o)x0、-c(＝o)r0、-nr0r
00
、c
1-12
烷基、c
1-12
烯基、c
1-12
炔基、c
6-12
芳基、c
3-12
环烷基、具有4至12个环原子的杂环烷基、具有5至12个环原子的杂芳基、c
1-12
烷氧基、羟基、c
1-12
烷基羰基、c
1-12
烷氧基-羰基、c
1-12
烷基羰氧基或c
1-12
烷氧基羰氧基，其中一个或多个h原子任选地被f或cl和/或其组合取代；其中x0为卤素且r0和r
00
独立地为h或任选取代的c
1-12
烷基。任选的取代基可以包含同一基团和/或多个上述基团中的所有化学上可能的组合(例如氨基和磺酰基，如果直接彼此连接，则表示氨磺酰基)。在一个实施方式中，取代基不是酰基。本文所用的酰基是指这
样的酰基：其是通过从含氧酸例如羧酸中除去一个或多个羟基而衍生的部分。它含有双键氧原子和烷基。
[0786]
在一些实施方式中，这些基团可以是未取代的。例如，蒽环类(pnu)衍生物可以具有式(v)：
[0787][0788]
其中[x]是选自包含以下的组中的任选的间隔物：未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的芳基、未取代的杂芳基、一个或多个杂原子、聚乙二醇或其组合；
[0789]
[l1]和[l2]是选自由以下组成的组中的任选的接头：缬氨酸(val)、瓜氨酸(cit)、丙氨酸(ala)、天冬酰胺(asn)、肽、-(ch2)
n-、-(ch2ch2o)
n-、对氨基苄氧基羰基(pab)、val-cit-pab、val-ala-pab、ala-ala-asn-pab、val-ala、asn-ala、除甘氨酸外的任何氨基酸，及其组合。
[0790]
在其中基团是未取代的实施方式中，[x]优选选自包含以下的组：聚乙二醇和其中代表与所述分子的其余部分连接的点，并且其中[r]是选自包含以下的组中的任选的间隔物：未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的芳基、未取代的杂芳基、一个或多个杂原子、聚乙二醇或其组合。
[0791]
一般而言，术语pab意指对氨基苄氧基羰基。有时，在文献中，术语pab可用于表示对氨基苄基。在本说明书中，pab意在表示对氨基苄氧基羰基。
[0792]
术语“靶标结合分子”是指与给定靶标结合的任何分子。在本文中，“靶标”和“抗原”可以互换使用。靶标结合分子的实例包括天然或重组蛋白，其中包括免疫球蛋白或抗体、免疫球蛋白fc区、免疫球蛋白fab区、fab、fab'、fv、fv-fc、单链fv(scfv)、scfv-fc、(scfv)2、双抗体、三抗体、四抗体、双特异性t细胞衔接体、内含肽、内含肽融合体、vnar结构域、单域抗体(sdab)、vh结构域、支架蛋白(affibodies、centyrins、darpins等)和核酸，其中包括已开发用于与靶标结合或天然与靶标结合的适体或小分子或天然产物。
[0793]
对蛋白质和生物分子进行化学修饰以引入硫醇的方法已经很成熟。方法包括：胺基与2-亚氨基噻吩(traut试剂)反应，用含有nhs-酯的异双官能剂(例如n-琥珀酰亚胺基s-乙酰硫醇酯(sata)或n-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(spdb))修饰胺基，然后
分别用羟胺和还原剂处理，并用半胱胺来裂解工程改造的内含肽融合蛋白，以生成c末端硫醇蛋白和肽。
[0794]
短语“选自包含以下的组”可以用短语“选自由......组成的组”替代，反之亦然，无论它们在本文中出现在何处。
[0795]
本文描述的pnu衍生物可以根据标准合成方法来制备。质谱可用于验证已产生了正确的分子(表4)。
[0796]
表4：pnu衍生物的质谱表征
[0797]
[0798][0799]
将参考以下实施例进一步理解本发明。
[0800]
实施例
[0801]
实施例1-抗ror1 vnar b1环文库序列的生成b1蛋白文库设计。
[0802]
为了更好地了解b1和ror1之间的相互作用，我们解析了b1与ror1 ig结构域复合情况下的晶体结构(数据未显示)。这种晶体结构告知了表达和筛选的蛋白文库中的哪些位置发生改变。我们之前注意到，第88和94位的b1色氨酸残基突变为丙氨酸(标准丙氨酸扫描方法)会导致蛋白质功能或表达丧失。从晶体结构观察到，cdr3环中的这些残基似乎对于
ror1结合很重要。因此，设计了b1环文库，通过改变cdr1和cdr3区内的选定位置来修改蛋白质的生物物理特性。从b1:ror1复合物的结构分析中获知每个特定环位置处发生的突变的集合，以便改变生物物理特性，同时保持结构完整性和高亲和力结合。
[0803]
文库构建
[0804]
b1的序列和环文库设计如图1所示。文库是通过cdr1和cdr3的受控诱变合成的。位于cdr环内的残基30、32、88、94和95是随机化的。
[0805]
文库构建
[0806]
使用特异性引物通过pcr扩增b1环文库dna，引入sfii限制性位点以克隆到pedv1噬菌粒运载体中。将连接至pedv1的文库dna转化至电感受态tg1大肠杆菌(lucigen)中。文库大小经计算为8
×
104。
[0807]
挑取84个单克隆并测序，作为文库的质量控制。已发现一个序列是wt b1克隆。基于cdr1和cdr3多样性，总共鉴定了70个独特的克隆。
[0808]
这些序列包含c末端hismyc标签，以能够通过imac层析进行纯化和通过elisa和流式细胞术评估ror1结合。
[0809]
筛选文库中的ror1特异性vnar序列
[0810]
由于b1与人ror1和小鼠ror1均结合，因此使用重组人和小鼠ror1-fc蛋白来筛选cdr环文库。总共928个克隆以96孔形式表达；提取周质部分并在elisa中分析与ror1的结合。除了b1 wt序列之外，还发现了23个与ror1结合的独特序列。
[0811]
ror1 vnar结合物的表达
[0812]
在tg1大肠杆菌中表达23个克隆，并使用ni-nta sepharose进行imac纯化。将蛋白质透析至pbs ph 7.4，测量吸光度abs280并计算浓度。获得的产量在1.5至9mg/l范围内。通过sds-page分析蛋白质的纯度。
[0813]
表5总结了通过elisa表征的不同环变体与人和小鼠ror1的结合。
[0814]
方法
[0815]
文库合成
[0816]
cdr环文库由geneart gene synthesis根据提供的设计合成。
[0817]
文库亚克隆至pedv1
[0818]
使用phusion high-fidelity pcr master mix和以下引物在总反应体积1ml中对11.4ng(10μl)合成文库进行pcr扩增：
[0819]
280：5
’‑
ctaccgtggcccaggcggcc-3’(seq id no：133)
[0820]
287：5
’‑
ggtgatggtgggcccctgaggcct-3’(seq id no：134)
[0821]
使用promega pcr纯化试剂盒纯化扩增子，用sfii消化并连接到同样用sfii限制酶打开的pedv1运载体中。以1:3的比例进行连接(0.54μg运载体与1.62μg文库dna连接)。
[0822]
cdr环文库的筛选：96孔形式中单克隆的周质表达和结合elisa
[0823]
1.接种含有1ml 2xty/0.1％葡萄糖/100μg/μl amp的greiner 96深孔板。在培养室中以180rpm、37℃下生长5小时，直至微浑浊。
[0824]
2.用110μl/孔的1mm iptg在2xty/amp中的溶液(iptg最终浓度＝100μm)诱导；28℃下以相同速度振荡过夜。
[0825]
3.在4℃和3500rpm下旋转培养物15分钟。倒出上清液并在纸巾上拍干。
[0826]
4.将250μl/孔的冰冷tes缓冲液(50mm tris/hcl、ph 8.0/1mm edta、ph 8.0/20％蔗糖)添加到沉淀中。涡旋。
[0827]
5.添加250μl 1:5稀释于水的tes缓冲液(冰冷的)。保持在冰上(或在脊中)30分钟。如上旋转。将上清液置于冰上直至准备使用。
[0828]
elisa
[0829]
1.用1μg/ml huror1-fc、小鼠ror1-fc、人ror2-fc或hsa包被96孔板，并在4℃下孵育过夜。
[0830]
2.3xpbst清洗板。
[0831]
3.用200μl/孔4％ mpbs封闭包被的板。室温孵育1小时。
[0832]
4.3xpbst清洗。
[0833]
5.将板与100μl/孔的peri-prep在室温下孵育1小时。
[0834]
6.添加100μl抗his-hrp(1:1000在pbst中)并在室温下孵育1小时。
[0835]
7.2xpbst清洗，2xpbs清洗。
[0836]
8.添加100μl/孔的tmb底物。用50μl/孔1m h2so4终止反应。
[0837]
ror1 vnar结合物的大规模表达和纯化
[0838]
1.从甘油储备液接种克隆至20ml 2xty/0.1％葡萄糖/100μg/μl amp中。在37℃下在培养室中以250rpm振荡生长过夜。
[0839]
2.在tb 磷酸盐 1％葡萄糖 100μg/ml amp培养基中按1:50稀释过夜培养物(10ml o/n培养物加入500ml培养基；450ml tb 50ml磷酸盐)并在37℃下剧烈摇晃(250rpm)孵育全天或尽可能长时间。
[0840]
3.在20℃下以4,000xg离心15分钟，使细胞沉淀。
[0841]
4.将细胞重悬于等体积的tb 磷酸盐 1％葡萄糖 100μg/ml amp培养基中，并在30℃下振荡孵育过夜。
[0842]
5.在20℃下以4,000xg离心15分钟使细胞沉淀，并将细胞重悬于相同体积的tb 磷酸盐 100μg/ml amp培养基(无葡萄糖)中。将iptg添加到最终浓度为1mm iptg。30℃振荡孵育4-5小时。
[0843]
6.4500xg离心20分钟收集细胞[此时沉淀可在-20℃下冷冻]。
[0844]
7.将沉淀重悬于10％培养物体积的冰冷tes缓冲液(500ml培养物为50ml)中，并在冰上轻轻摇动15分钟。
[0845]
8.加入等体积的冰冷的5mm mgso4(mgso4最终浓度为2.5mm)并继续在冰上轻轻摇动15分钟。
[0846]
9.在4℃下以8000xg离心30分钟，使悬浮液沉淀。上清液含有释放的周质蛋白。
[0847]
10.添加10xpbs(ph 7.4)[最终浓度1xpbs]到peri-prep提取物中，然后进行imac纯化。
[0848]
固定化金属亲和层析(imac)纯化
[0849]
1.将2至3ml镍树脂(his pur ni-nta树脂，thermo fisher#88222)添加到100ml渗透休克溶液(周质提取物)中，并在室温下在滚筒上孵育1小时。
[0850]
2.让周质提取物通过柱(poly prep层析柱10ml，bio-rad#7321010)。
[0851]
3.用50至100ml pbs清洗树脂。
[0852]
4.用5x1ml 500mm咪唑(ph 8)洗脱蛋白质。
[0853]
5.在透析盒(slide a lyzer透析盒7.000mwco，thermo fisher#66707)中在3x5升pbs中搅拌透析洗脱液。
[0854]
6.通过sds-page分析蛋白质。
[0855]
使用根据氨基酸序列预测的理论消光系数，根据280nm处的吸光度确定纯化蛋白质的浓度。所有蛋白质均通过还原和非还原sds page分析和质谱进行表征。通过质谱法证实了所需的二硫键的形成。
[0856]
尺寸排阻色谱法
[0857]
通过尺寸排阻色谱法评估环工程改造变体。使用分析sec柱(superdex 75 10/300gl)通过尺寸排阻色谱(sec)评估b1环变体的单体性和生物物理特性。在ph 7.4的pbs中进行色谱分析。sec上的洗脱体积可以衡量不同蛋白质的相对疏水性。由于与柱基质相互作用，洗脱体积增加，表明疏水性增加。
[0858]
在相同条件下运行的sec洗脱体积如表5所示。
[0859]
通过bli评估与人和小鼠ror1的结合
[0860]
使用生物层干涉测量法(bli)octet k2系统(fortebio)测定结合动力学。使用胺偶联将人或小鼠ror1-hfc融合蛋白(胞外结构域)在醋酸钠ph5缓冲液中固定至cooh2芯片或ar2g传感器上。在不同浓度下测试vnar，并使用用于生物层干涉的octet数据分析高通量软件(fortebio)确定ka(m-1
s-1
)、kd(s-1
)和kd(nm)值。
[0861]
表5.总结了这些分子对人和小鼠ror1的亲和力的bli数据。
[0862][0863]
通过流式细胞术评估环变体vnar与细胞表面ror1结合
[0864]
使用内含肽技术重新表达环变体vnar。为了表达为内含肽融合体，针对大肠杆菌
表达(geneart，thermo)对编码vnar的dna进行了优化，并将该dna框内克隆到内含肽表达运载体中。这得到了编码目标vnar蛋白与工程改造内含肽结构域融合而该工程改造内含肽结构域又与几丁质结合结构域(cbd)融合的融合体的基因，从而能够在几丁质柱上进行纯化。
[0865]
转化的大肠杆菌细胞在1l摇瓶中生长，直至od
600nm
＝～0.6，4℃冷激2小时，然后用0.5mm iptg在18℃过夜诱导蛋白表达。通过在裂解缓冲液(50mm磷酸钠ph 7.4、0.5m nacl、15％甘油、0.5mm edta、0.1％ sarkosyl、1mm aebsf)中超声裂解细胞，并离心以去除细胞碎片。通过固定在几丁质珠(neb，s6651)上，从澄清的细胞裂解物中纯化vnar内含肽融合蛋白。用裂解缓冲液(lysis buffer)、然后用切割缓冲液(cleavage buffer)(50mm磷酸钠ph 6.9、200mm氯化钠)充分洗涤珠，并通过在400mm二氧胺、或o,o'-1,3-丙二基双羟胺或100mm半胱氨酸或半胱胺中过夜化学切割，从珠中释放vnar，以生成vnar的相应的c末端氨氧基、c末端半胱氨酸或c末端硫醇衍生物。
[0866]
然后通过sec(superdex75 26/60ge healthcare)和/或imac(histrap hp，ge healthcare)进一步纯化切割的vnar的上清液。使用根据氨基酸序列预测的理论消光系数，根据280nm处的吸光度确定浓度。所有蛋白质均通过还原和非还原sds page分析和质谱进行表征。通过质谱法证实了vnar结构域中所需的二硫键的形成。然后通过流式细胞术评估这些c末端hismyc标签化蛋白的ror1细胞表面结合情况。
[0867]
在不同的细胞系(a549和a427)中对测试试剂与hror1的细胞表面结合进行了表征，并确定了所得的k
dapp
值。通过在37℃下与0.1％ edta/pbs溶液一起孵育约10分钟或直至细胞容易脱壁，将贴壁的癌细胞从组织培养瓶中分离。将细胞重悬于15ml试管中的冰冷pbs/2％fcs中，并在4℃下以1500rpm离心5分钟。去除上清液并将细胞沉淀重悬于pbs/2％fcs中。使用z1 coulter颗粒计数器(beckman coulter)或chemometec nucleocounter nc-202进行细胞计数，并以每个测试样品5
×
105个细胞等分到96孔板中。将细胞与100μl一系列浓度的测试试剂以及对照物一起在冰上孵育1小时。将样品板以2000rpm离心5分钟。除去上清液，并使用多道移液器将细胞沉淀重悬于0.25ml冰冷的pbs/2％fcs中进行洗涤。样品再次在4℃下以2000rpm离心5分钟。除去上清液并按所述进行另外两次洗涤。在最后的洗涤和离心步骤之后，通过在薄纸上吸干板来除去多余的液体。通过在每个细胞沉淀样品中适当添加100μl抗x6his标签ab(abcam)并在冰上孵育30分钟来测定vnar的结合。如前所述进行洗涤步骤。使用pe-抗小鼠抗体(jir)通过与适当的样品在冰上避光孵育30分钟来检测vnar(带his6标签的)试剂和相应药物缀合物的结合。如前所述进行洗涤步骤。最后将所有细胞沉淀重悬于0.3ml冰冷的pbs/2％fcs中，并避光置于冰上，然后在merck-millipore guava easycyte ht或thermo fisher attune nxt流式细胞仪上进行分析。
[0868]
如图2和图3所示，环文库变体与ror1
hi
人癌细胞系a549结合，但不与ror1
低
人癌细胞系a427结合。2v是对照vnar序列，其源自原始vnar文库，因此代表此类蛋白质，但没有已知的靶标。
[0869]
实施例2-b1环文库变体的人源化和进一步工程改造
[0870]
使用两种不同的策略生成三个先导ror1结合b1环文库vnar的人源化序列衍生物。
[0871]
人源化序列是根据人种系vκ1序列dpk-9设计的。例如，在p3a1 v1中，将vnar的框架区1、3和4突变以与dpk-9的框架区对齐。
[0872]
第二种策略涉及将ror1结合vnar的结合环移植到先前人源化的vnar框架上
(kovalenko et al jbc 2013 288(24)17408-17419；wo2013/167883)。但其中更多位置根据与ror1 ig结构域复合的vnar b1的结构进行了工程改造。
[0873]
其他工程改造位点包括蛋白质的cdr1、hv2和hv4区中的氨基酸变化。
[0874]
类似地，使用这种方法开发了b1的人源化变体，其cdr1、hv2和hv4区以及框架区相应地包含氨基酸变化。因此，b1g4实际上是b1的环文库衍生物或b1的人源化变体的环文库变体，由此cdr1、hv2、hv4和cdr3序列与亲本蛋白中的序列相同。
[0875]
人源化的/移植的环文库vnar序列的示例如下：
[0876]
g3cp g4
[0877]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltdanyglaatywyrknpgssnkerisisgrysesvnkgtmsftltisslqpedsatyycraypwgagapynvqwydgagtkveik(seq id no:71)
[0878]
g3cp v15
[0879]
asvtqsprsasketgesltitcrvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgrysesvnkrtmsfslrissltvedsatyyckaypwgagapynvqwydgqgtklevk(seq id no:72)
[0880]
1h8 g4
[0881]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltdanyglaatywyrknpgssnkerisisgrysesvnkgtmsftltisslqpedsatyycraypwgagapssvqwydgagtkveik(seq id no:73)
[0882]
1h8 v15
[0883]
asvtqsprsasketgesltitcrvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgrysesvnkrtmsfslrissltvedsatyyckaypwgagapssvqwydgqgtklevk(seq id no:74)
[0884]
c3cp g4
[0885]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltdanyglaatywyrknpgssnkerisisgrysesvnkgtmsftltisslqpedsatyycraypwgagaprqvqwydgagtkveik(seq id no:75)
[0886]
c3cpv15
[0887]
asvtqsprsasketgesltitcrvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgrysesvnkrtmsfslrissltvedsatyyckaypwgagaprqvqwydgqgtklevk(seq id no:76)
[0888]
b1g4
[0889]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltdanyglaatywyrknpgssnkerisisgrysesvnkgtmsftltisslqpedsatyycraypwgagapwlvqwydgagtkveik(seq id no:51)。
[0890]
编码人源化构建体的dna针对在大肠杆菌中表达进行密码子优化，并由geneart(thermo)合成。生成所有人源化序列，均带有以下c末端his6标签：
[0891]
qasgahhhhhh(seq id no：102)
[0892]
制备g4序列，其不带有额外的c末端标签。
[0893]
编码这些蛋白质的dna被亚克隆到内含肽表达运载体中，在大肠杆菌中表达并按照先前“vnar内含肽融合蛋白表达的典型方法”部分中所述进行纯化。
[0894]
人源化ror1结合vnar变体表现出与人ror1的高亲和力结合(通过bli评估)、良好的热稳定性，并且几乎没有聚集(通过sec)的证据。如前所述，使用固定在芯片表面的人ror1 ecd
–
fc进行bli。如前所述进行sec。热稳定性测定使用applied biosystems stepone实时pcr系统和protein thermal shift
tm
染料试剂盒(thermo)。设置测定混合物，使蛋白质在20μl中的最终浓度为20μm。将5μl thermal shift
tm
缓冲液与2.5ul 8x thermal shift
tm
染料一起添加。使用stepone软件运行测定，并使用protein thermal shift
tm
软件分析数据。所有数据均来自一阶导数分析。表6显示了hror1结合的bli数据和通过蛋白质热位移测得的热稳定性。
[0895]
表6：人源化vnar环变体的热稳定性和hror1结合数据
[0896][0897][0898]
将g3cp、1h8和c3cp的hv和cdr环移植到人源化vnar框架上，加上cdr1、hv2和hv4区中的额外突变，或者用来自人dpk-9序列的区域替换vnar框架序列，产生了实质上工程改造的蛋白质，这种工程改造的蛋白质是稳定的，具有单体性，并保持与hror1的高亲和力结合。
[0899]
实施例3-抗ror1 vnar p3a1 g1环文库序列的生成
[0900]
文库设计
[0901]
p3a1 g1是结合ror1的vnar p3a1的人源化版本。p3a1 g1环文库旨在在框架内没有任何变化的情况下通过cdr1、hv2和hv4区的随机化来提高该人源化变体的ror1结合亲和力。突变的选择是基于对squalus acanthus vnar序列的数据分析而做出的。p3a1 g1的序列和文库设计如图4所示。
[0902]
通过cdr1、hv2和hv4的受控诱变合成文库。分别位于cdr1、hv2和hv4环内的残基26-33、44-52和61-65被改变为选定的氨基酸，如图4所示，从而产生8.2
×
106种组合的总文库多样性。
[0903]
文库构建
[0904]
使用特异性引物通过pcr扩增p3a1 g1环文库dna，引入sfii限制性位点以克隆到pedv1噬菌粒运载体中。这将额外的ser残基引入cd1中。将连接至pedv1的文库dna转化至电感受态tg1大肠杆菌(lucigen)中。文库大小经计算为2
×
108。挑取192个单克隆并测序，作为文库的质量控制。
[0905]
筛选p3a1 g1文库中的抗原特异性vnar序列
[0906]
使用重组人ror1蛋白进行p3a1 g1文库的选择和筛选。采用两种策略来分离ror1特异性结合物：基于固定在预修饰的链霉亲和素包被珠上的生物素化抗原进行选择，以及用直接固定在免疫管上的抗原进行选择。对预修饰的生物素化抗原珠进行选择涉及3轮淘选，第一轮和第二轮的严格性较低(两轮均用3xpbst和3xpbs洗涤，第一轮和第二轮分别使用100nm和10nm的生物素化huror1)，但第三轮的严格性较高(10xpbst和10xpbs洗涤，0.5nm生物素化huror1)。在免疫管上选择包括2轮淘选，使用的抗原浓度恒定为2ng/ml。选择过程之后，通过针对人或小鼠ror1的单克隆噬菌体和周质提取物elisa来筛选输出物的抗原特
异性结合。在用直接固定在免疫管上的抗原进行的选择中，95％的展示vnar的单克隆噬菌体对人和小鼠ror1具有特异性，而基于固定在预修饰的链霉亲和素包被的珠上的生物素化抗原进行的选择中，4％的展示vnar的单克隆噬菌体对人和小鼠ror1具有特异性。
[0907]
总共表达了来自每个选择活动的9个独特序列，并分析了结合和选择性(表7和8)。
[0908]
[0909]
[0910][0911]
ror1 p3a1 g1环变体的表达
[0912]
在tg1大肠杆菌中表达克隆，并使用ni-nta sepharose通过imac纯化所得的带c末
端hismyc标签的蛋白。将蛋白质透析至pbs ph 7.4，测量吸光度abs
280
并计算浓度。获得的产量在0.5至6.5mg/l范围内。通过sds-page分析蛋白质的纯度。
[0913]
所有蛋白质均通过还原和非还原sds page分析和质谱进行表征。通过质谱法证实了所需的二硫键的形成。
[0914]
通过elisa评估p3a1 g1环变体与hror1的结合
[0915]
p3a1 g1环变体与人ror1的结合最初通过elisa进行评估。简而言之，elisa方法如下。用100ng ror1-hfc抗原包被孔，并在室温下封盖孵育2小时。用pbst(pbs 0.05％ tween20(v/v))以3x400ul/孔洗涤板，然后用4％脱脂奶粉(w/v)的pbst溶液在37℃下封闭1小时。如前所述洗涤板，并单独用pbs进行额外洗涤。将带hismyc标签的结合蛋白在4％牛奶pbst中稀释，并在4℃下孵育过夜。将板用pbst洗涤3次，用pbs洗涤3次，并使用适当的检测二抗的4％牛奶pbst溶液进行结合检测，在室温下1小时。使用的二抗包括：
[0916]
抗c-myc、hrp(invitrogen#r951-25)
[0917]
小鼠抗polyhis、hrp(sigma#a7058)
[0918]
用pbst将板洗涤3次。添加100μl tmb底物(thermo#34029)，并使反应在室温下进行10分钟。添加100μl 2m h2so4以淬灭反应。将板瞬时离心，然后在clariostar酶标仪(bmg labtech)上读取450nm处的吸光度。
[0919]
图5显示了不同变体与人ror1的相对结合，序列nag8.s、af7.s、nac6.s和ae3.s显示出最强的结合信号。
[0920]
还使用相同的elisa方法将变体nag8.s、af7.s、nac6.s和ae3.s与人ror1的结合，与亲本p3a1 g1序列的结合进行了比较。
[0921]
图6中显示的剂量响应数据表明，这些环文库序列与人ror1的结合比亲本p3a1g1蛋白更强。
[0922]
通过elisa表征p3a1 g1环变体的小鼠ror1和ror2结合
[0923]
通过elisa进一步表征了选择的p3a1 g1环变体与小鼠ror1和人ror2的结合。采用与上述相同的elisa程序，但在板上包被有mror1-hfc或hror2-hfc。所测试的变体均未与人ror2结合。在测试的变体中，nac6.s和ae3.s与小鼠ror1结合。
[0924]
p3a1 g1环文库变体作为内含肽融合蛋白的表达
[0925]
p3a1 g1环变体vnar nag8.s、nac6.s和ae3.s使用内含肽技术重新表达，但从cdr1环中删除了ser。如上所述，表达了带有并入vnar结构域c末端的his标签qackahhhhhhg(seq id no：163)或hismyc标签qackahhhhhhgaefeqkliseedlg(seq id no：164)的内含肽融合体。
[0926]
在表达并在几丁质珠上捕获后，通过在400mm二氧胺或o,o'-1,3-丙二基双羟胺或100mm半胱氨酸或半胱胺中过夜化学切割，从珠中释放内含肽vnar，以生成vnar的相应的c末端氨氧基、c末端半胱氨酸或c末端硫醇衍生物。
[0927]
然后通过sec(superdex75 26/60ge healthcare)和/或imac(histrap hp，ge healthcare)进一步纯化切割的vnar的上清液，以得到蛋白质nag8、nac6和ae3。使用根据氨基酸序列预测的理论消光系数，根据280nm处的吸光度确定浓度。所有蛋白质均通过还原和非还原sds page分析和质谱进行表征。通过质谱法证实了vnar结构域中所需的二硫键的形成。
[0928]
然后通过bli进一步评估这些带c末端hismyc或his标签的蛋白的ror1结合，通过sec进一步评估热稳定性和生物物理特性。
[0929]
通过bli评估与人和小鼠ror1的结合
[0930]
使用生物层干涉测量法(bli)octet k2系统(fortebio)测定结合动力学。使用胺偶联将人或小鼠ror1-hfc融合蛋白(胞外结构域)在醋酸钠ph5缓冲液中固定至cooh2芯片或ar2g传感器上。在不同浓度下测试vnar，并使用用于生物层干涉的octet数据分析高通量软件(fortebio)确定ka(m-1
s-1
)、kd(s-1
)和kd(nm)值。结合参数如表9所示。
[0931]
热稳定性测定
[0932]
热稳定性测定使用applied biosystems stepone实时pcr系统和protein thermal shift
tm
染料试剂盒(thermo)。设置测定混合物，使蛋白质在pbs ph 7.4中在20μl中的最终浓度为20μm。添加2.5μl 8x thermal shift
tm
染料。使用stepone软件运行测定，并使用protein thermal shift
tm
软件分析数据。所有数据均来自一阶导数分析，tm值详见表9。
[0933]
尺寸排阻色谱法
[0934]
使用分析sec柱(superdex 75increase 10/300gl)通过尺寸排阻色谱(sec)评估p3a1环变体的单体性和生物物理特性。在ph 7.4的pbs中进行色谱分析。
[0935]
在相同条件下运行的％单体度和sec洗脱体积如表9所示。
[0936]
表9：p3a1 g1变体nag8、nac6和ae3的ror1结合和物理特性总结
[0937][0938]
实施例4-vnar重新格式化为多聚体
[0939]
将ror1结合环变体vnar通过使用不同的基于glyser的接头进行基因融合成功地重新格式化为异质二聚体和三聚体，以产生双特异性结合物、ror1双互补位结合物和ror1双互补位双特异性结合物。
[0940]
双特异性结合物
[0941]
通过使用pgvqpspgggggs(seq id no：96)接头将ror1环变体vnar结合物与人源化vnar ba11(与血清白蛋白具有高亲和力)结合，开发出了几种基于双特异性vnar的结合物。
[0942]
表达的蛋白质带有c末端标签qackahhhhhhgaefeqkliseedl(seq id no：97)或qackahhhhhh(seq id no：104)以帮助纯化和表征。该标签还包含单个半胱氨酸残基，以使用硫醇介导的化学偶联策略促进有效负载与蛋白质的位点选择性生物缀合。
[0943]
如前所述，使用biolayer干涉仪(k2 octet仪器/pall fortebio)测定结合动力
学。对于bli实验，使用胺偶联将ror1-hfc(胞外结构域)和hsa在醋酸钠ph5缓冲液中固定至ar2g传感器。在不同浓度下测试基于vnar的分子，并使用octet数据分析ht软件(pall fortebio)确定ka(m-1
s-1
)、kd(s-1
)和kd(nm)值。
[0944]
也在基线、缔合和解离条件下使用饱和水平的hsa(200nm)进行了hror1结合的结合动力学。
[0945]
通过流式细胞术测定与ror1hi a549癌细胞系的结合。进行剂量响应，并使用作为vnar浓度的函数的平均荧光强度(背景校正)的变化来确定细胞表面ror1结合物的k
dapp
。
[0946]
这些双特异性vnar的表征如表10所示。
[0947]
表10：含有ror1 vnar环文库变体的双特异性蛋白的表征
[0948][0949]
通过与c末端标签中的单个半胱氨酸残基缀合进一步修饰双特异性vnar结合物。
[0950]
双互补位结合物
[0951]
将不同的ror1环变体vnar结合物组合，同时额外插入或不额外插入结合血清白蛋白的人源化vnar ba11，开发了几种ror1双互补位结合物。使用pgvqpapggggs(seq id no：90)接头将vnar结构域连接在一起，并且表达的蛋白质带有c末端标签qackahhhhhhgaefeqkliseedl(seq id no：97)或qackahhhhhh(seq id no：104)以帮助纯化和表征。该标签还包含单个半胱氨酸残基，以使用硫醇介导的化学偶联策略促进有效负载与蛋白质的位点选择性生物缀合。
[0952]
如前所述，使用biolayer干涉仪(k2 octet仪器/pall fortebio)测定结合动力学。对于bli实验，使用胺偶联将ror1-hfc(胞外结构域)在醋酸钠ph5缓冲液中固定至ar2g传感器。在不同浓度下测试基于vnar的分子，并使用octet数据分析ht软件(pall fortebio)确定ka(m-1
s-1
)、kd(s-1
)和kd(nm)值。
[0953]
这些双特异性vnar的表征如表11所示。
[0954]
表11：含有ror1 vnar环文库变体的双互补位蛋白的表征
[0955][0956]
与单个ror1结合单体相比，双互补位结合物显示出对ror1结合的亲和力增加。
[0957]
含有ba11的构建体是双互补位双特异性蛋白结合物的例子。
[0958]
此外，通过将ror1环变体vnar结合物与人源化vnar ba11组合或通过使用pgvqpcpgggggs(seq id no：177)将不同的ror1环变体vnar结合物组合，开发了几种基于双特异性和双互补位vnar的结合物。该接头序列还包含单个半胱氨酸残基，以使用硫醇介导的化学偶联策略(在该接头中)促进有效负载与蛋白质的位点选择性生物缀合。
[0959]
表达的蛋白质带有c末端标签qasgahhhhhh(seq id no：102)或qackahhhhhh(seq id no：104)以帮助纯化和表征。
[0960]
表12：具有含半胱氨酸的接头序列的含有ror1 vnar环文库变体的双特异性和双互补位蛋白的表征
[0961][0962]
通过与接头序列中的单个半胱氨酸残基缀合进一步修饰双特异性vnar结合物。
[0963]
在缀合之前，将20当量的tcep添加到双特异性蛋白中，以去除接头硫醇的半胱氨酸/谷胱甘肽封端。在室温下温育一小时后，通过在hitrap sp阳离子交换层析柱(cytiva)上纯化除去tcep。为了装载到柱上，将蛋白质在50mm磷酸钠缓冲液ph6.0中稀释三倍。然后通过梯度递增的由50nm磷酸钠ph6.0，1m nacl组成的洗脱缓冲液来洗脱蛋白质。为了缀合，添加4当量的含有马来酰亚胺的有效负载并在室温下孵育1小时。然后使用与上述相同的方案通过阳离子交换除去游离的有效负载。
[0964]
表13：具有含半胱氨酸的接头序列的含有ror1 vnar环文库变体的双特异性和双互补位蛋白质药物缀合物的表征
[0965][0966]
不受任何特定理论的束缚，预期可以通过增加生产规模和通过采用优化的纯化工艺来提高缀合物收率。
[0967]
实施例5-vnar重新格式化为fc融合蛋白
[0968]
vnar fc融合蛋白
[0969]
蛋白质与fc结构域的融合可以提高蛋白质的溶解度和稳定性，显著延长血浆半衰期并提高整体治疗效果。人igg1 fc序列如下所示，更多示例如图7所示。
[0970]
人igg1 fc(hfc)
[0971]
epkssdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no：145)
[0972]
vnar环变体通过标准[g4s]3接头与工程改造的higg1 fc结构域进行基因融合，该结构域在higg1 fc序列中包含半胱氨酸取代s239c(eu编号)。vnar fc融合蛋白在cho k1细胞中瞬时表达为分泌蛋白，并使用mabselect
tm
sure
tm
(evitria，switzerland)从培养基中纯化。将纯化的蛋白质交换到pbs ph 7.4或pbs 100mm arg ph 7.4中，并通过sec(advancebio，agilent，运行缓冲液dpbs ph 7.4)、sds page和质谱进行分析，以确认序列和蛋白质完整性。
[0973]
使用pioneer表面等离子共振(spr)仪器(sensiq/pall fortebio)或生物层干涉测量(bli)octet k2系统(fortebio)测定结合动力学。使用胺偶联将ror1-hfc融合蛋白(胞外结构域)在醋酸钠ph5缓冲液中固定至cooh2芯片或ar2g传感器上。在不同浓度下测试vnar-fc分子，并使用用于生物层干涉的octet数据分析高通量软件(fortebio)确定ka(m-1
s-1
)、kd(s-1
)和kd(nm)值。可选择地，通过将vnar-hfc融合体固定到ahc传感器上来测定结合的动力学参数。在不同浓度下测试人ror1(ecd)，并使用用于生物层干涉的octet数据分析高通量软件(fortebio)确定1:1结合的ka(m-1
s-1
)、kd(s-1
)和kd(nm)值。包括ror1 2a2 mab(biolegend)作为与ror1的阳性/阴性结合的对照。2v是对照vnar序列，其源自原始vnar文库，因此代表此类蛋白质，但没有已知的靶标。如前所述进行sec分析。表14中总结的数据证明了环文库hfc变体相对于亲本b1-hfc蛋白的有利特性。
[0974]
使用先前描述的方法通过流式细胞术测量vnar-fc融合体与癌细胞系表面上的ror1的结合，通过添加100μl pe-抗人抗体(jir)并在冰上孵育30分钟来测定vnar-hfc融合分子的结合。根据作为vnar-hfc浓度的函数的荧光强度的增加来计算kdapp值。图8显示了不同vnar-fc融合体与ror1
hi a549肺腺癌细胞的结合。
[0975][0976]
评估了pbs缓冲液中vnar-hfc融合蛋白的相对稳定性。将g3cp-hfc、g3cpg4-hfc和b1g4-hfc以及亲本b1-hfc以2mg/ml在含有0.05％叠氮化钠的无菌pbs缓冲液ph7.4中于37
℃孵育96小时。在t＝0和t＝96h时测量280nm和320nm处的uv吸光度。通过尺寸排阻色谱法(s200 increase 10/300gl，使用pbs ph 7.4运行缓冲液)评估t＝0和t＝96h时蛋白质的单体性。如图16所示，b1-hfc孵育96小时后，280nm和320nm处的uv吸光度均增加，但环文库变体(即g3cp-hfc和g3cpg4-hfc)则没有增加。320nm处的吸光度特别是归因于聚集颗粒对光的散射。根据280nm处的吸光度计算得出的环文库变体(即g3cp-hfc和g3cpg4-hfc)的蛋白质浓度在整个实验过程中都保持恒定。t＝0与t＝96h时的sec分析(图17)显示出环文库变体(即g3cp-hfc和g3cpg4-hfc)具有良好的稳定性并且比亲本蛋白b1-hfc更稳定。
[0977]
双互补位vnarfc融合蛋白
[0978]
vnar环变体通过标准[g4s]3接头与针对异二聚化进行工程改造的higg1 fc进行基因融合(ridgway1996protein engineering 9(7):617-21)。杵(knob)变体在位置336(t366y)处有色氨酸取代，臼(hole)变体在位置407(y407t)处有苏氨酸取代(eu编号)。该方法用于生成双互补位ror1结合物，其中一个臂包含vnar环变体，另一个臂包含第二ror1结合vnar。此外，杵变体和臼变体的higg1 fc序列中并入了半胱氨酸取代[s239c(eu编号)]，以促进与不同有效负载的生物缀合。
[0979]
vnar fc融合蛋白在cho k1细胞中瞬时共表达为分泌蛋白，并使用mabselect
tm
sure
tm
(evitria，switzerland)从培养基中纯化。将纯化的蛋白质交换到pbs ph 7.4中，并通过sec(advancebio，agilent，运行缓冲液dpbs)、sds page和质谱进行分析，以确认序列和蛋白质完整性。
[0980]
g3cp hfc(s239c y407t)
[0981]
asvnqtprtatketgesltincvvtganyglaatywyrknpgssnqerisisgryvesvnkrtmsfslrikdltvadsatyyckaypwgagapynvqwydgagtvltvnggggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapellggpcvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsffltskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no:146)
[0982]
g3cpg4 hfc(s239c y407t)
[0983]
trvdqspsslsasvgdrvtitcvltdanyglaatywyrknpgssnkerisisgrysesvnkgtmsftltisslqpedsatyycraypwgagapynvqwydgagtkveikggggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapellggpcvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsffltskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no:147)
[0984]
p3a1 hfc(s239c t366y)
[0985]
trvdqtprtatketgesltincvltdtsyglystswfrknpgttdwermsiggryvesvnkgaksfslrikdltvadsatyyckarearhpwlrqwydgagtvltvnggggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapellggpcvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvslyclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no:148)
[0986]
所有蛋白质均通过还原和非还原sds page分析(图9)和质谱(表15)进行表征。
[0987]
如前所述，使用biolayer干涉仪(k2 octet仪器/pall fortebio)测定与ror1的结合。对于bli实验，将ror1-hfc(胞外结构域)固定在传感器上。数据如表15所示。
[0988]
表15：双互补位vnar-fc融合体的ms表征以及通过bli评估与人ror1的结合
[0989][0990]
使用先前描述的方法通过流式细胞术测量双互补位vnar-fc融合体与癌细胞系表面上的ror1的结合。通过添加100μl pe-抗人抗体(jir)并在冰上孵育30分钟来测定vnar-hfc融合分子的结合。根据作为vnar-hfc浓度的函数的荧光强度的增加来计算kdapp值。图10显示了双互补位vnar-fc融合体与ror1
hi a549肺腺癌细胞和ror1
低
a427细胞的结合。g3cp-p3a1 hfc(s239c kih)和g3cpg4-p3a1 hfc(s239c kih)与a549细胞强结合，k
d app分别为0.06nm和0.20nm，但与a427细胞几乎没有结合。
[0991]
实施例6-环变体vnar药物缀合物
[0992]
vnar-hfc药物缀合物
[0993]
生成adc的另一种方法是在抗体的轻链和重链位置上设计半胱氨酸取代或添加，这些半胱氨酸为位点特异性标记提供反应性硫醇基团(junutula 2008nature biotechnology 26,925
–
932,jeffrey 2013,sutherland 2016)。
[0994]
抗ror1环文库vnar-hfc融合体是如前所述通过将额外的半胱氨酸工程改造到fc区中而生成的，这使得能够用荧光标记(af488)和细胞毒性药物(ma peg4 vc pab eda pnu 159682以及ma peg4 va pab eda pnu 159682)的马来酰亚胺衍生物来进行位点特异性标记(图11)。
[0995]
vnar-hfc-药物缀合物的生成
[0996]
使用改编自文献[junutula et al,2008nat biotech,jeffrey et al,2013bioconj chem]的部分还原、重折叠和标记方法，这些蛋白质用马来酰亚胺pnu衍生物进行位点特异性标记。简言之，在pbs 100mm l-精氨酸ph7.4(含有1mm edta)中制备1mg/ml vnarh fc溶液。添加20摩尔当量的tcep，并在4℃下孵育至少48小时。添加30摩尔当量的dhaa，将ph调节至6.5并在室温下孵育1小时。将重折叠的vnar fc s239c进行广泛透析或将缓冲液更换为pbs 50mm l-精氨酸，并通过uv进行定量，然后与4或5摩尔当量马来酰亚胺pnu溶液反应，室温过夜。通过sec纯化缀合物，并通过分析型hic、分析型sec和lc-ms进行分析。表16总结了制备的缀合物。
[0997]
表16：vnar-pnu缀合物的特征总结
[0998][0999]
最终缀合物的sds-page和质谱分析确定了，标记已经以定量方式进行，得到药物与抗体比率(dar)为2的高纯度均质蛋白质药物缀合物。
[1000]
通过elisa检测vnar-hfc-药物缀合物与hror1的结合
[1001]
通过elisa评估g3cp hfc和g3cpg4 hfc及其各自的药物缀合物与人ror1的结合。简而言之，elisa方法如下。用100ng ror1-his抗原包被孔，并在室温下封盖孵育2小时。用pbst(pbs 0.05％tween20(v/v))以3x400ul/孔洗涤板，然后用4％脱脂奶粉(w/v)的pbst溶液在37℃下封闭1小时。如前所述洗涤板，并单独用pbs进行额外洗涤。将b1环变体(vnar-hfc融合体)结合蛋白在4％牛奶pbst中稀释，并在4℃下孵育过夜。将板用pbst洗涤3次，用pbs洗涤3次，并使用适当的检测二抗的4％牛奶pbst溶液中进行结合检测，在室温下1小时。用于检测的二抗是兔抗人igg h&l(hrp)，abcam目录号ab6759。用pbst洗涤板3次，然后添加100μl tmb底物(thermo#34029)，并使反应在室温下进行10分钟。然后添加100μl 2m h2so4以淬灭反应。将板瞬时离心，然后在clariostar酶标仪(bmg labtech)上读取450nm处的吸光度。
[1002]
图12显示了g3cp hfc和g3cpg4 hfc pnu缀合物与人ror1强结合，并且在不同的pnu接头有效负载与亲本蛋白缀合后，结合活性没有损失。
[1003]
用抗ror1 vnar药物缀合物处理的癌细胞的体外细胞活力测定
[1004]
将细胞接种到白色透明底96孔板(costar)中并在37℃、5％co2下孵育24小时。第二天，以x10工作储备液为每种测试试剂设置稀释系列。剂量响应x10储备液为：10000、5000、1000、500、100、50、10、5、1、0.5nm等。使用多道移液器将10μl x10储备溶液添加到细胞板中(每孔90μl)。这导致孔中的稀释度为1:10，对于最敏感的细胞系，剂量响应范围为1000nm(第1列)至0.05nm(第10列)或延续至0.5fm(如果需要)。将10μl溶媒对照(pbs)添加到对照孔(第11和12列)。将板在37℃、5％co2下孵育72至96小时。按照制造商的说明使用promega cell titre glo试剂来评估细胞活力。简而言之，将测定板从培养箱中取出并平衡至室温，然后将100μl室温cell titre glo试剂添加到每个100μl测定孔中。将板置于板摇床上，以600rpm摇动2分钟。在使用clariostar酶标仪(bmg)测量发光读数之前，将板在室
温下再静置10分钟。通过计算未处理(仅溶媒)对照孔的平均值并确定每个处理孔相比对照的百分比来分析数据。然后比照log[处理]浓度来绘制对照数据％，并使用graphpad prism软件中的非线性回归拟合得出ic50值。
[1005]
使用以下细胞系：
[1006]
pa-1
–
人卵巢癌细胞系：emem，10％hifcs
[1007]
pa-1ror1 ko
–
ror1敲除的人卵巢癌细胞系：emem，10％hifcs
[1008]
hek293
–
人胚胎肾细胞系：emem，10％ fcs
[1009]
人ror1稳定转染的hek293(hek293.hror1)
–
稳定表达hror1的人胚胎肾细胞系：emem，10％fcs
[1010]
图13显示g3cp-hfc-pnu缀合物(peg4-vc pab eda pnu159682和peg4-va-eda-pnu159682)和g3cpg4-hfc-pnu缀合物(peg4-vc pab eda pnu159682)对ror1阳性pa-1卵巢癌细胞和pa-1ror1ko细胞的细胞杀伤的剂量响应曲线，以及相应的ic
50
值(表17)。pa-1ror1 ko是ror1表达已被敲除的pa-1癌细胞系。
[1011]
表17：g3cp-hfc缀合物对pa-1和pa1 ror1 ko癌细胞的细胞杀伤的ic
50
计算值(nm)。
[1012][1013]
靶向ror1的vnar-hfc缀合物显示出对pa-1细胞系的有效杀伤，而这种杀伤在ror1受体被敲除后会被消除。两种g3cp-hfc pnu缀合物的ic
50
值均存在＞100倍窗口。
[1014]
图18显示出g3cp-hfc-pnu、g3cpg4-hfc-pnu和2v-hfc-pnu缀合物(peg4-vc pab eda pnu159682)对ror1
低
hek293细胞和人ror1稳定转染的hek293细胞(hek293.hror1)的细胞杀伤的剂量响应曲线，具有相应的ic
50
值(表18)。2v是对照vnar序列，其源自原始vnar文库，因此代表此类蛋白质，但没有已知的靶标。
[1015]
表18：g3cp-hfc、g3cpg4-hfc和2v-hfc缀合物对hek293 wt和hek293.hror1细胞的细胞杀伤的ic
50
计算值(nm)。
[1016][1017]
靶向ror1的vnar-hfc缀合物显示出对稳定转染了ror1受体的hek293.hror1细胞系的有效杀伤，但对ror1
低
野生型hek293细胞则没有。g3cp-hfc pnu和g3cpg4-hfc-pnu缀合物杀伤hek293与hek293.hror1细胞的ic
50
值存在＞2000倍的窗口，但2v-hfc-pnu非结合对照缀合物没有窗口。
[1018]
实施例7-蛋白质-药物缀合物在源自患者的三阴性乳腺癌(tnbc)异种移植模型中的体内功效
[1019]
xentech(巴黎)在ror1 hbcx-28患者来源的tnbc异种移植模型中进行了一项疗效研究。
[1020]
远交无胸腺(nu/nu)雌性小鼠(hsd:无胸腺裸鼠-foxn1
nu
)皮下植入相同体内传代的肿瘤。对小鼠进行监测，直到肿瘤植入物在足够数量的动物中达到60至200mm3、优选75至196mm3的研究体积招募标准。将小鼠随机分为治疗组，使得每组中的肿瘤体积之间没有统计学差异。随机化被指定为实验的第0天。第2天，用溶媒或蛋白质-药物缀合物b1-hfc-vc-pab-eda-pnu、b1g4-hfc-vc-pab-eda-pnu、g3cp-hfc-vc-pab-eda-pnu或g3cpg4-hfc-vc-pab-eda-pnu处理小鼠，静脉内注射单剂量0.3mg/kg。所有小鼠在第一次pdc给药前20小时用小鼠igg预引发。在实验期间每周三次用卡尺测量垂直肿瘤直径来评估肿瘤体积。使用公式tv(mm3)＝[长度(mm)x宽度(mm)2]x0.5来计算绝对肿瘤体积(atv)，其中长度和宽度是分别垂直测量的肿瘤的最长和最短垂直直径。在测量肿瘤大小的同时对所有动物进行称重。根据当地福利和最佳兽医实践指南，每天观察并记录小鼠的外观、行为、不良临床征象和一般福利的变化。
[1021]
图14显示了蛋白质-药物缀合物相对于溶媒对照对肿瘤生长的影响。所有蛋白质药物缀合物均具有良好的耐受性，并在该ror1 tnbc pdx模型中显示出高度统计学显著的体内功效。b1g4-hfc-vc-pab-eda-pnu保留了与b1-hfc-vc-pab-eda-pnu相当的体内功效水平(数据未显示)。环文库变体g3cp-hfc-vc-pab-eda-pnu和g3cpg4-hfc-vc-pab-eda-pnu显示出比亲本b1融合体更高的功效，在0.3mg/kg单剂量方案下观察到两种环文库变体完全且持久的消退。
[1022]
xentech(巴黎)还在ror1 hbcx-10患者来源的tnbc异种移植模型中进行了疗效研究。
[1023]
远交无胸腺(nu/nu)雌性小鼠(hsd:无胸腺裸鼠-foxn1
nu
)皮下植入相同体内传代的肿瘤。对小鼠进行监测，直到肿瘤植入物在足够数量的动物中达到75至196mm3的研究体
积招募标准。将小鼠随机分为治疗组，使得每组中的肿瘤体积之间没有统计学差异。随机化被指定为实验的第0天。用溶媒或蛋白质-药物缀合物b1-hfc-vc-pab-eda-pnu、b1g4-hfc-vc-pab-eda-pnu、g3cp-hfc-vc-pab-eda-pnu或g3cpg4-hfc-vc-pab-eda-pnu或g3cp-hfc-va-eda-pnu处理小鼠，剂量为0.3mg/kg，静脉内注射，3次，间隔4天(第2、6和10天，3
×
q4d)。所有小鼠在第一次pdc给药前20小时用小鼠igg预引发。在实验期间每周三次用卡尺测量垂直肿瘤直径来评估肿瘤体积。使用公式tv(mm3)＝[长度(mm)x宽度(mm)2]x0.5来计算绝对肿瘤体积(atv)，其中长度和宽度是分别垂直测量的肿瘤的最长和最短垂直直径。在测量肿瘤大小的同时对所有动物进行称重。根据当地福利和最佳兽医实践指南，每天观察并记录小鼠的外观、行为、不良临床征象和一般福利的变化。
[1024]
图19显示了蛋白质-药物缀合物相对于溶媒对照对肿瘤生长的影响。所有蛋白质药物缀合物均具有良好的耐受性，并在该ror1 tnbc pdx模型中显示出高度统计学显著的体内功效，并观察到该给药方案下完全且持久的消退。
[1025]
实施例8-双互补位环变体vnar药物缀合物
[1026]
双互补位vnar-hfc药物缀合物
[1027]
如前所述通过将额外的半胱氨酸工程改造到fc区中而生成如实施例5中所述的双互补位抗ror1环文库vnar-hfc融合体，其使得能够用标记和细胞毒性药物的马来酰亚胺衍生物进行位点特异性标记。
[1028]
双互补位vnar-hfc-药物缀合物的生成
[1029]
使用如实施例6中所述的部分还原、重折叠和标记方法将双互补位ror1结合蛋白g3cp-p3a1 hfc(s239c kih)和g3cpg4-p3a1 hfc(s239c kih)与mc-vc-pab-mmae或ma-peg4-vc-pab-eda-pnu159682缀合。通过sec纯化缀合物，并通过分析型hic、分析型sec和lc-ms进行分析。表19总结了制备的缀合物。
[1030]
表19：双互补位vnar-pnu缀合物的特征总结
[1031][1032]
使用先前描述的方法通过流式细胞术测量双互补位vnar-fc-pnu缀合物与癌细胞
系表面上的ror1的结合。通过添加100μl pe-抗人抗体(jir)并在冰上孵育30分钟来测定vnar-hfc-pnu分子的结合。根据作为vnar-hfc浓度的函数的荧光强度的增加来计算kdapp值。图20a和b显示出双互补位vnar-fc-pnu缀合物(peg4-vc pab eda pnu159682)与ror1
hi a549肺腺癌细胞和ror1
低
a427细胞的结合以及相应的单互补位pnu缀合物的结合。g3cp-p3a1 hfc(s239c kih)-pnu和g3cpg4-p3a1 hfc(s239c kih)-pnu与a549细胞强结合，k
d app分别为0.92nm和1.83nm，但与a427细胞几乎没有结合。与相应的g3cp-hfc-pnu和p3a1-hfc-pnu缀合物相比，g3cp-p3a1 hfc(s239c kih)-pnu表现出更高水平的与a549细胞的饱和结合(图20a)。类似地，与相应的g3cpg4-hfc-pnu和p3a1-hfc-pnu缀合物相比，g3cpg4-p3a1 hfc(s239c kih)-pnu表现出更高水平的与a549细胞的饱和结合(图20b)。
[1033]
用抗ror1双互补位vnar药物缀合物处理的癌细胞的体外细胞活力测定
[1034]
如实施例6中所述进行cell titre glo测定。将细胞与vnar-hfc缀合物在37℃、5％co2下孵育96小时，并确定作为剂量响应的函数的细胞活力％。比照log[处理]浓度绘制对照数据％，并使用graphpad prism软件中的非线性回归拟合得出ic
50
值。
[1035]
使用以下细胞系：
[1036]
pa-1
–
人卵巢癌细胞系：emem，10％hifcs
[1037]
pa-1ror1 ko
–
ror1敲除的人卵巢癌细胞系：emem，10％hifcs
[1038]
kasumi-2
–
人b细胞前体白血病细胞系：rpmi 1640，10％hifcs
[1039]
mhh-es1
–
人胚胎肾细胞系：rpmi 1640，10％hifcs
[1040]
图21显示了g3cp-p3a1 hfc(s239c kih)-pnu和g3cpg4-p3a1 hfc(s239c kih)-pnu缀合物(peg4-vc pab eda pnu159682)对ror1阳性pa-1卵巢癌细胞和pa-1ror1 ko细胞的细胞杀伤的剂量响应曲线。pa-1ror1 ko是ror1表达已被敲除的pa-1癌细胞系。
[1041]
表20显示了g3cp-p3a1 hfc(s239c kih)-pnu和g3cpg4-p3a1 hfc(s239c kih)-pnu缀合物(peg4-vc pab eda pnu159682)对kasumi-2、mhh-es1、pa-1和pa-1ror1 ko细胞的细胞杀伤的ic
50
值。使用bd biosciences quantibrite珠通过流式细胞术测定每个细胞系的细胞表面ror1受体数量。表20：g3cp-p3a1 hfc(s239c kih)-pnu和g3cpg4-p3a1 hfc(s239c kih)-pnu缀合物对pa-1和pa1ror1 ko癌细胞的细胞杀伤的ic
50
计算值(nm)。
[1042][1043]
靶向ror1的双互补位vnar-hfc缀合物显示出对ror1 癌细胞系的有效杀伤，但对ror1阴性的pa1.ror1ko细胞系则没有。
[1044]
实施例9-双互补位蛋白-药物缀合物在源自患者的三阴性乳腺癌(tnbc)异种移植模型中的体内功效
[1045]
xentech(巴黎)在ror1 hbcx-28患者来源的tnbc异种移植模型中进行了一项疗效研究。
[1046]
远交无胸腺(nu/nu)雌性小鼠(hsd:无胸腺裸鼠-foxn1nu)皮下植入相同体内传代的肿瘤。对小鼠进行监测，直到肿瘤植入物在足够数量的动物中达到100至200mm3的研究体积招募标准。将小鼠随机分为治疗组，使得每组中的肿瘤体积之间没有统计学差异。随机化被指定为实验的第0天。用溶媒或双互补位蛋白-药物缀合物g3cp-p3a1 hfc(s239c kih)-vc-pab-eda-pnu和g3cpg4-p3a1 hfc(s239c kih)vc-pab-eda-pnu治疗小鼠：在第2天，静脉内注射单剂量0.3mg/kg；或间隔四天，3x0.1mg/kg静脉内注射(第2、6和10天，3
×
q4d)。所有小鼠在第一次pdc给药前20小时用小鼠igg预引发。在实验期间每周三次用卡尺测量垂直肿瘤直径来评估肿瘤体积。使用公式tv(mm3)＝[长度(mm)x宽度(mm)2]x0.5来计算绝对肿瘤体积(atv)，其中长度和宽度是分别垂直测量的肿瘤的最长和最短垂直直径。在测量肿瘤大小的同时对所有动物进行称重。根据当地福利和最佳兽医实践指南，每天观察并记录小鼠的外观、行为、不良临床征象和一般福利的变化。
[1047]
图22显示了蛋白质-药物缀合物相对于溶媒对照对肿瘤生长的影响。所有蛋白质药物缀合物均具有良好的耐受性，双互补位环文库变体g3cp-p3a1-hfc-vc-pab-eda-pnu和g3cpg4-p3a1-hfc-vc-pab-eda-pnu在该ror1 tnbc pdx中显示出优异的体内功效，两种试剂下都观察到肿瘤消退。
[1048]
实施例10-ror1 vnar双特异性
[1049]
用于ror1结合vnar的双特异性靶标组合包括，例如，
[1050]
用于延长半衰期的hsa；ror1和血清白蛋白的双特异性接合
[1051]
rtk，例如egfr、her3；双特异性靶向细胞表面的egfr和ror1或her3和ror1。
[1052]
本文已经讨论和举例说明的vnar ba11是hsa结合vnar的例子。讨论了包含hsa结合vnar(例如ba11)和另一种特异性结合分子的双特异性分子。
[1053]
在cho细胞(evitria)中表达通过2个不同长度的g4s接头将n末端ror1 vnar与c末端抗cd3scfv(克隆okt3)组合的ror1 x cd3双特异性序列，并通过imac(histrap excel，ge healthcare)纯化，然后进行sec(superdex 200 26/60，ge healthcare)。类似地，还在cho(evitria)中表达将n末端双互补位ror1 vnar与c末端抗cd3 scfv组合的双互补位ror1 x cd3双特异性序列。
[1054]
cd3 bite类方法；cd3结合序列用作ror1 vnar双特异性抗cd3 scfv克隆okt3(wo 2014028776zyngenia)的实例及其定向和人源化衍生物
[1055]
vh-[g4s]
3-vl
[1056]
diklqqsgaelarpgasvkmscktsgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvssggggsggggsggggsdiqltqspaimsaspgekvtmtcrasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtskvasgvpyrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqwssnpltfgagtklelks(seq id no：149)
[1057]
人源化抗cd3 scfv ucht1(arnett et al pnas2004 101(46)16268-16273)及其衍生物
[1058]
vl-[g4s]
3-vh
[1059]
mdiqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdirnylnwyqqkpdgtvklliyytsrlhsgvpskfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpwtfaggtkleikggggsggggsggggsevqlqqsgpelvkpgasmkisckasgysftgytmnwvkqshgknlewmglinpykgvstynqkfkdkatltvdkssstaymellsltsedsavyycarsgyygdsdwyfdvwgqgttltvfs(seq id no：150)
[1060]
实施例11-ror1 car-t方法
[1061]
可以产生基于本技术中描述的ror1特异性抗原结合分子的嵌合抗原受体(car)。此外，还可以产生表达这种car的工程改造的t细胞，然后将其用于例如过继性细胞治疗。
[1062]
简而言之，可以产生编码ror1特异性car的核酸构建体。ror1特异性car可包括胞内激活结构域、跨膜结构域和包含本文所述的ror1特异性抗原结合分子的胞外结构域。然后可以将核酸构建体并入病毒运载体，例如逆转录病毒运载体(例如，慢病毒运载体)。
[1063]
t细胞可以从需要治疗的患者中分离出来，然后可以被修饰以表达编码car的核酸构建体，例如通过逆转录病毒转染或通过使用诸如crispr-cas-9等方法进行基因编辑。
[1064]
然后，工程改造的t细胞可以重新输注到患者体内，以治疗疾病，例如治疗癌症。