黄芩素在制备治疗pcos卵巢功能障碍相关药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及药物应用领域，具体涉及黄芩素在制备治疗pcos卵巢功能障碍相关药物中的应用。
背景技术：
2.多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,pcos)是育龄期女性常见的内分泌代谢异常综合性疾病,临床上以肥胖、高雄激素血症、稀发排卵或不排卵及胰岛素抵抗为主要特征，继而引起无排卵性不孕及一系列代谢系统并发症,包括心血管疾病、血脂异常、ii型糖尿病、向心性肥胖等。pcos病因复杂、临床表现异质化,其发病机制仍不完全明确。近年来，随着研究的深入,氧化应激被认为是pcos发病的因素之一，ros表达增加或卵泡内抗氧化能力减弱，可能引起机体氧化抗氧化机制失衡(活性氧代谢失衡)，从而产生氧化应激损伤。
3.有文献报道，母体高雄激素血症和胰岛素抵抗导致妊娠子宫和胎盘铁死亡的激活。有研究证实，pcos后小卵泡壁高表达p53。众所周知，p53不仅可以引起细胞凋亡，也能诱导细胞铁死亡。隐丹参酮通过调节氧化应激、线粒体膜电位、细胞凋亡和铁死亡保护pcos造成的卵巢组织损伤。有研究发现铁介导的线粒体自噬通过激活tfrc/pink1信号促进kgn细胞铁死亡，说明铁代谢在pcos的发生和发展中起着重要作用。
4.黄芩素，是中药黄芩的主要成分，是黄芩中含量最高的黄酮类化合物之一。黄芩素在体内可转化为黄芩苷，黄芩苷具有显著的生物活性，具有抑菌、利尿、抗炎、抗变态及解痉作用，并且具有较强的抗癌反应等生理效能。
5.有研究报道，黄芩苷通过抑制卵巢组织中gata1向hsd3b2启动子的募集，可能成为pcos高雄激素血症的有效治疗剂，并可以减弱pcos大鼠内分泌和生殖功能障碍。因此，铁死亡可能参与了pcos卵巢功能损害过程，黄芩素是否可以通过调控卵巢铁死亡改善pcos卵巢组织损伤及功能障碍，需要深入研究以明确调控机制，进而干预以调控病理状态下卵巢功能，对于pcos的预防及治疗有潜在价值。
6.pcos卵巢中囊状卵泡的防治一直是pcos疾病面临的巨大挑战，慢性炎症、氧化应激是进展期pcos主要表现，是现代pcos调理与干预的关键科学问题。
技术实现要素：
7.为此，本发明提供黄芩素在制备治疗pcos卵巢功能障碍相关药物中的应用，以解决现有治疗pcos卵巢功能障碍效果差的问题。
8.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
9.根据本发明第一方面提供的黄芩素在制备治疗pcos卵巢功能障碍相关药物中的应用，所述药物的有效成分为黄芩素。
10.进一步的，所述pcos卵巢功能障碍为pcos卵巢细胞铁死亡或dhea诱导卵巢颗粒细胞铁死亡。
11.进一步的，黄芩素在调节pcos卵巢功能障碍的信号途径为调控分子acsl4、gpx4、fth1、cox2。
12.根据本发明第二方面提供的一种治疗pcos卵巢细胞铁死亡的药物，其特征在于，包括黄芩素和药学上可接受的载体或赋形剂。
13.进一步的，所述药物的给药途径为口服、透皮、肌肉、皮下或静脉注射。
14.进一步的，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、霜剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。
15.根据本发明第三方面提供的一种治疗dhea诱导卵巢颗粒细胞铁死亡的药物，包括黄芩素和药学上可接受的载体或赋形剂。
16.进一步的，所述赋形剂包括粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂、湿润剂中的一种或几种。
17.进一步的，所述填充剂为纤维素、甘露糖醇、乳糖中的一种或几种。
18.进一步的，所述崩解剂包括聚乙烯吡咯烷酮、淀粉、羟基乙酸淀粉钠中的一种或几种；所述润滑剂为硬脂酸镁；所述润湿剂为十二烷基硫酸钠。
19.本发明具有如下优点：
20.本发明验证了铁死亡参与了pcos的病理生理过程；铁死亡关键调控分子acsl4、gpx4、fth1、cox2是黄芩素调节pcos卵巢功能障碍的重要信号途径。本发明拟从细胞内源性保护机制入手，在细胞和整体水平上探讨炎症、氧化应激反应、铁死亡及其相互作用与pcos的本质联系。并探讨黄芩素通过调控铁死亡改善pcos的抗氧化应激紊乱。首先，pcos模型后拟给予铁死亡抑制剂或黄芩素进行治疗，检测正常或pcos情况下慢性炎症和氧化应激分子的变化。其后检测铁死亡反应的关键调控分子acsl4、gpx4、fth1、cox2等表达/活化，深入了解黄芩素通过调控铁死亡防治pcos的相关分子机制，探索其可能干预靶点。总之，本发明通过对铁离子信号转导和铁死亡关键调控分子表达/活化的分析与调节，将对pcos的发生机制形成完整的新认识，从而有助于深刻阐明pcos的发病本质，为开展针对性防治策略提供新思路、开辟新途径。
21.本发明发现fer-1(铁死亡抑制剂)可显著降低pcos大鼠卵巢囊性卵泡和初级卵泡的百分比，明显增加早期窦性卵泡的百分比，降低闭锁卵泡的百分比。初步认为黄芩素通过抑制铁死亡信号通路活化，减轻炎症反应，减弱卵巢颗粒细胞脂质过氧化，进而改善pcos卵巢功能紊乱。
22.本发明将面向pcos临床诊治和基础研究中的难点和重点科学问题，探讨pcos卵巢功能障碍的发生机制和分子靶向思路，聚焦pcos卵巢组织铁死亡相关蛋白的表达情况，同时关注铁死亡在pcos卵巢功能障碍中的调控作用，重点研究其精细调控机制。并基于脂质过氧化反应与铁死亡探讨pcos病理生理机制，将为防治pcos卵巢组织病理损伤及功能障碍开辟新途径，具备潜在的临床转化及应用前景。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据
提供的附图引伸获得其它的实施附图。
24.本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
25.图1为本发明实施例1提供的pcos大鼠体重变化及发情周期改变情况；其中，*p《0.05，与con组比较；#p《0.05，与pcos组比较；
26.图2为本发明实施例提供的pcos大鼠卵巢组织病理变化；其中，*p《0.05，与con组比较；#p《0.05，与pcos组比较；
27.图3为本发明实施例1提供的pcos大鼠血清及卵巢内氧化应激分子变化；其中，*p《0.05，与con组比较；#p《0.05，与pcos组比较；
28.图4为本发明实施例1提供的pcos大鼠血清炎症因子水平变化；其中，*p《0.05，与con组比较；#p《0.05，与pcos组比较；
29.图5为本发明实施例1提供的pcos大鼠卵巢内ros和fe
2
含量变化；其中，*p《0.05，与con组比较；#p《0.05，与pcos组比较；
30.图6为本发明实施例1提供的pcos大鼠卵巢细胞细胞形及线粒体形态变化；其中，a-正常组；b-pcos组；c-pcos fer-1组；d-pcos 黄芩素组；
31.图7为本发明实施例1提供的pcos大鼠卵巢内铁死亡关键调控分子表达变化；其中，*p《0.05，与con组比较；#p《0.05，与pcos组比较；
32.图8为本发明实施例2提供的dhea刺激后kgn细胞活性；其中，*p《0.05，与con组比较；#p《0.05，与dhea组比较；
33.图9为本发明实施例2提供的dhea刺激后kgn细胞内氧化应激分子表达情况；其中，*p《0.05，与con组比较；#p《0.05，与dhea组比较；
34.图10为本发明实施例2提供的dhea刺激后kgn细胞内fe
2
含量变化；其中，*p《0.05，与con组比较；#p《0.05，与dhea组比较；
35.图11为本发明实施例2提供的激光共聚焦显示kgn细胞内ros含量变化；其中，*p《0.05，与con组比较；#p《0.05，与dhea组比较；
36.图12为本发明实施例2提供的dhea刺激后kgn细胞形态及线粒体结构变化图；a-control组；b-dhea组；c-dhea fer-1组；d-dhea 黄芩素；
37.图13为本发明实施例2提供的dhea刺激后kgn细胞内线粒体膜电位变化；其中，*p《0.05，与con组比较；#p《0.05，与dhea组比较；
38.图14为本发明实施例2提供的dhea刺激后kgn细胞内acsl4、gpx4、fth1、cox2表达变化；其中，*p《0.05，与con组比较；#p《0.05，与dhea组比较。
具体实施方式
39.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
40.实施例1
41.本实施例提供高黄芩素调节pcos卵巢细胞铁死亡及其信号机制：
42.1.bhi：脑心浸液培养基；
43.pmsf：苯甲基黄酰氟；
44.2.研究内容
45.采用正常sd雌性大鼠，建立dhea诱导pcos大鼠模型，观察卵巢组织内炎症反应、氧化应激及铁死亡关键分子表达水平及黄芩素的调控作用。正常sd大鼠、dhea诱导pcos大鼠模型。部分动物用于观察外周血及卵巢组织内炎症反应(tnf-α、il-6、il-18)，取大鼠卵巢组织，冠状位切片，光镜下观测卵巢形态、观察闭锁卵、囊状卵泡及黄体等各类型卵泡。同前述方法观察卵巢内线粒体形态变化、氧化应激反应、fe
2
含量改变。同时检测激素水平，包括促lh、fsh、t、ee2。明确pcos状态下铁离子累积的情况，论证黄芩素通过调控铁死亡改善pcos后卵巢病理损伤及功能障碍。
46.2.1pcos大鼠模型制备：将1g dhea粉末溶解于100ml注射用无菌芝麻油中，配成10mg/ml的油剂。模型组小鼠颈背部皮下注射含dhea的油剂，按照6mg/100g体质量剂量注射，每天注射一次，连续注射20天；对照组按体重注射相应体积的无菌芝麻油，连续注射20天；空白组不做任何处理。dhea致pcos大鼠模型后分别给予腹腔注射fer-1(铁死亡抑制剂)(5mg/kg)和黄芩素(100mg/kg)干预治疗28天。
47.2.2卵巢形态学观察：取小鼠双侧卵巢，10％多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，he染色，行病理学分析。光镜下观测卵巢形态、观察闭锁卵、囊状卵泡及黄体等各类型卵泡。
48.2.3阴道涂片测试发情周期变化：大鼠阴道开口，连续行阴道图片两个性周期共10d,无菌棉签先在生理盐水中浸湿后，放入阴道侧壁上1/3处涂抹，取出棉签同一方向涂抹于载玻片上，1％瑞士蓝染色。对照组大鼠阴道上皮细胞涂片呈周期性变化，周期在4-5天，动情周期变化规律；模型组大鼠阴道上皮细胞持续角化，其始终处于动情间期，失去规律的动情周期变化。
49.2.4蛋白印迹法(westernblot)分析检测acsl4、gpx4、fth1、cox2蛋白表达及活化水平：提取卵巢组织内总蛋白，采用bca法对各样本进行蛋白定量。
50.western blot实验
51.a.将玻璃板清洗干净并晾干后，置于制胶架上固定。根据说明书制备12％的分离胶和浓缩胶后，放进电泳槽中，加上蛋白样本。
52.b.电泳：加入电泳液，开始跑电泳，条件为先恒压80v，30min。当样品进入分离胶后改为恒压120v，60min。
53.c.转膜：然后按照白板、棉毡、2层滤纸、pvdf膜、凝胶、2层滤纸、1层棉毡、黑板的顺序制备转膜夹，转膜条件为恒流300ma、60min。
54.d.牛奶封闭：随后用5％脱脂牛奶对已转好的pvdf膜进行封闭，摇床慢速摇晃，室温2h。
55.e.一抗孵育：将pvdf膜浸入一抗孵育液中，置于4℃冰箱过夜。一抗的稀释比例st2(1:1000)、β-actin(1:1000)。
56.f.次日：用1
×
tbst缓冲液在摇床上快速清洗pvdf膜，3min/次，3次。将清洗好的pvdf膜浸入对应的二抗中，于室温下，摇床上孵育2h。
57.g.用1
×
tbst缓冲液清洗pvdf膜，反复三次，每次3min。配置ecl的wb显色液，现配现用，后将pvdf膜置于显像仪中进行曝光。最后，用imagelab软件对条带进行密度分析。
58.2.5酶联免疫法检测性激素lh、fsh
59.将各种试剂移至室温平衡半小时，取浓缩洗涤液，根据当批检测数量，用蒸馏水1：20稀释，混匀后备用。校准品s0～s5及质控品。将预包被板从密封袋中取出，每个校准点及质控依次各设两孔，每孔加入相应校准品及质控品50μl；其余每个检测孔直接加待测血清50μl。然后每孔加入酶标抗体50μl，充分混匀，贴上不干胶封片，置37℃温育1小时。手工洗板。每孔加显色剂a液50μl，显色剂b液50μl，振荡混匀后，置37℃避光显色15分钟，每孔加终止液50μl。用酶标仪读数，单波长酶标仪需先用空白对照孔调零点，然后测定各孔吸光值。
60.2.6还原型谷胱甘肽(gsh)和超氧化物歧化酶(总sod)测定：
61.样本组织处理：新鲜卵巢组织使用pbs冲洗2次，称取0.1g卵巢组织，加入匀浆器/均质仪中；加入1ml提取液，迅速冰上充分研磨；4℃8000g离心10min；取上清液置于4℃待测。分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节双波长至412nm，蒸馏水调零。在1.5ml离心管中依次加入试剂及样品，混匀，室温静置2min，测定412nm处吸光值。
62.将收集的全血4℃8000g离心10min，将上清移入新的试管中放置于4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存。4℃8000g离心10min；取上清液置于4℃待测。分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节双波长至412nm，蒸馏水调零。取适量标准品稀释成不同浓度的标准点。在1.5ml离心管中依次加入试剂及样品，混匀，室温静置2min，测定412nm处吸光值。
63.2.7丙二醛(mda)检测：
64.样本组织处理：新鲜卵巢组织使用pbs冲洗2次，称取0.1g卵巢组织，加入匀浆器/均质仪中；加入1ml提取液，迅速冰上充分研磨；4℃8000g离心10min；取上清液置于4℃待测。分光光度计/酶标仪预热30min以上，蒸馏水调零。取适量标准品用蒸馏水稀释不同浓度，根据标本预实验的结果选择浓度点。在1.5ml离心管中，加入0.3ml试剂一，再加入0.1ml样本，混匀。95℃水浴中保温30min，置于冰浴中冷却，10000g，25℃，离心10min。吸取200μl上清液于微量石英比色皿或96孔板中，测定532nm和600nm处的吸光度。
65.将收集的全血4℃8000g离心10min，将上清移入新的试管中放置于4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存。分光光度计/酶标仪预热30min以上，蒸馏水调零。取适量标准品用蒸馏水稀释不同浓度，根据标本预实验的结果选择浓度点。在1.5ml离心管中，加入0.3ml试剂一，再加入0.1ml样本，混匀。95℃水浴中保温30min，置于冰浴中冷却，10000g，25℃，离心10min。吸取200μl上清液于微量石英比色皿或96孔板中，测定532nm和600nm处的吸光度。
66.2.8铁含量检测:
67.在酸性分析缓冲液中，铁载体蛋白会将铁分解成溶液。如果分析缓冲液的ph值为中性，铁将与铁载体蛋白紧密结合。然而，在酸性条件下(ph值低于5.5)，铁不再与载体蛋白具有结合亲和力，并将以铁/三价铁离子的形式解离并释放到溶液中，其浓度可以使用此试剂盒测量。该试剂盒中的铁分析缓冲液具有酸性ph值，能够将铁/三价铁离子释放到溶液中。操作步骤按照铁试剂盒说明书进行。
68.2.9活性氧ros检测：
69.称取约0.05克卵巢组织，按1:20(质量/体积)比例加入冰冷的100mmol/l磷酸缓冲液，用玻璃匀浆器匀浆。1000g，4℃离心10分钟，取上清液待测。在96孔酶标板中加入190μl匀浆上清液，10μl的1mmol/l dcfh-da溶液(dcfh-da终浓度为50μmol/l)，用微量移液器吸打，使之充分混匀。置于酶标仪中，37℃保温，30分钟后于激发波长485nm，发射波长538n m检测荧光强度。另取50μl匀浆上清液，30倍稀释，取100进行蛋白定量。结果以荧光强度/毫克蛋白表示。
70.将收集的全血4℃8000g离心10min，将上清移入新的试管中放置于4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存。在96孔酶标板中加入190μl上清液，10μl的1mmol/l dcfh-da溶液(dcfh-da终浓度为50μmol/l)，用微量移液器吸打，使之充分混匀。置于酶标仪中，37℃保温，30分钟后于激发波长485nm，发射波长538n m检测荧光强度。另取50μl匀浆上清液，30倍稀释，取100进行蛋白定量。结果以荧光强度/毫克蛋白表示。
71.2.10elisa检测炎症因子tnf-α、il-6、il-18水平
72.收集学血清，室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。按照elisa试剂盒操作进行。
73.2.11电透射镜观察卵巢细胞形态变化：
74.取出的卵巢组织放在洁净的蜡版上，滴一滴预冷的固定液，用两片新的、锋利的刀片成“拉锯式”将组织切下并修小，然后用牙签或镊子将组织块移至盛有冷的固定液的小瓶中。如果组织带有较多的血液和组织液，应先用固定液洗几遍，然后再切成小块固定。应用超薄切片机进行切片，再经戊二醛和饿酸双重固定，丙酮脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸枸椽酸电子又重染色，透射电镜观察。扫描电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定，乙醇逐级脱水，co2临界点干燥，扫描电镜观察。
75.2.12统计学分析
76.采用spss27.0软件(spss inc.,chicago,usa)进行统计分析，所有数据以均数
±
标准差(x
±
sd)表示。不同组间的多重比较采用单因素方差分析(anova)和dunnett-t检验进行检验。p《0.05为差异有统计学意义。
77.3.结果
78.3.1黄芩素改善pcos大鼠卵巢病理损伤
79.正常sd雌性大鼠、dhea诱导pcos大鼠模型，通过制作dhea致pcos大鼠模型后分别给予腹腔注射fer-1(铁死亡抑制剂)和黄芩素干预治疗28天。观察外周血及卵巢组织内卵泡比变化情况。pcos组大鼠的体重明显高于对照组(图1a)，黄芩素可降低dhea处理的pcos大鼠的体重。发情周期作为pcos大鼠卵巢功能变化的另一个指标。对照组所有大鼠表现出正常的发情周期。然而dhea诱导的pcos大鼠出现明显的周期性损害；pcos组10只大鼠中只有2只表现出正常的发情周期(图2b)。在fer-1组，10只大鼠中有5只表现出正常的发情周期(图1b)，黄芩素组中，10只大鼠中有6只表现出正常的发情周期。此外，我们还评估了黄芩素对每个卵巢切片中不同卵泡百分比的影响。发现pcos大鼠囊性卵泡和初级卵泡的百分比显著增加(图2)。黄芩素给药可显著降低囊性卵泡和初级卵泡的百分比(图2)。虽然pcos和对照组大鼠之间早期窦性卵泡和闭锁卵泡的百分比没有显著变化，但黄芩素显著增加早期窦性卵泡的百分比，降低闭锁卵泡的百分比。表明，黄芩素可以改善卵巢功能和组织学变化。
80.3.2黄芩素可降低pcos大鼠卵巢及外周血中脂质过氧化水平
81.正常雌性sd大鼠、dhea诱导pcos大鼠模型，通过制作dhea致pcos大鼠模型后分别给予腹腔注射fer-1(铁死亡抑制剂)和黄芩素干预治疗28天。我们进一步我们分析了pcos大鼠卵巢及外周血氧化应激分子活化情况，发现pcos大鼠卵巢及血清mda生成明显增多，超氧化歧化酶sod、gsh生成明显减少，给予fer-1治疗后，mda水平减低，超氧化歧化酶sod、gsh水平升高(p《0.01)，给予黄芩素治疗后，mda水平减低，超氧化歧化酶sod、gsh水平升高(p《0.01，图3)，初步说明，黄芩素可以改善pcos大鼠卵巢病理损伤，并降低脂质过氧化水平。
82.3.3黄芩素减轻pcos大鼠炎症反应及改善性激素水平
83.正常雌性sd大鼠、dhea诱导pcos大鼠模型，通过制作dhea致pcos大鼠模型后分别给予腹腔注射fer-1(铁死亡抑制剂)和黄芩素干预治疗28天。结果显示，pcos大鼠血清性激素lh、e2、t水平明显升高，而fer-1或黄芩素治疗后lh、e2、t生成水降低，黄芩素治疗后lh、e2、t生成水降低(p《0.01，表1)。血清fsh无明显变化，见表1。此外，pcos大鼠血清炎症因子il-6、il-18、tnf-α生成明显增多，而fer-1炎性因子il-6、il-18、tnf-α分泌降低明显，黄芩素治疗后il-6、il-18、tnf-α生成显著减少(p《0.01，图4a-c)。说明fer-1或黄芩素可能减轻炎症反应，并改善pcos大鼠卵巢功能，且pcos的发生可能与铁死亡有关。
84.表1pcos大鼠血清性激素水平变化
[0085][0086]
3.4黄芩素可降低pcos大鼠卵巢内ros和fe
2
含量
[0087]
正常雌性sd大鼠、dhea诱导pcos大鼠模型，通过制作dhea致pcos大鼠模型后分别给予腹腔注射fer-1(铁死亡抑制剂)和黄芩素干预治疗28天。为了明确pcos的发生是否与铁死亡相关，我们检测了卵巢内ros和fe
2
含量。结果显示，pcos大鼠卵巢内ros和fe
2
含量明显增多，fer-1治疗后大鼠卵巢内ros和fe
2
含量明显减少，黄芩素治疗后卵巢内ros和fe
2
含量明显减少(p《0.01，图5)。
[0088]
3.5黄芩素对pcos大鼠卵巢细胞形态变化的影响
[0089]
正常sd雌性大鼠、dhea诱导pcos大鼠模型，通过制作dhea致pcos大鼠模型后分别给予腹腔注射fer-1(铁死亡抑制剂)和黄芩素干预治疗28天。由于铁死亡会导致细胞线粒体变小，膜密度增高，嵴减少、消失，外膜破碎，细胞核中形态变化不明显。我们采用投射电镜观察卵巢细胞形态变化。如图6，结果发现，pcos大鼠卵巢细胞形态稍不规则，细胞核(n)呈圆形或椭圆形；胞质内可见少量均质颗粒(hp)，线粒体(m)呈椭圆形或短杆状、体积偏小，内脊减少、膜密度偏高，粗面内质网(rer)结构清晰；pcos fer-1组中细胞形态基本规则，细胞核(n)呈圆形或椭圆形，胞质内可见均质颗粒(hp)，线粒体(m)大多呈椭圆形或短杆状，内脊减少、膜密度偏高，粗面内质网(rer)结构清晰。pcos 黄芩素组中细胞形态基本规则，细
胞核(n)呈圆形或椭圆形；胞质内线粒体(m)呈椭圆形或短杆状、内脊稍粗，粗面内质网(rer)结构清晰。
[0090]
3.6黄芩素对pcos大鼠卵巢内铁死亡相关分子的影响
[0091]
正常sd雌性大鼠、dhea诱导pcos大鼠模型，通过制作dhea致pcos大鼠模型后分别给予腹腔注射fer-1(铁死亡抑制剂)和黄芩素干预治疗28天。为了明确pcos大鼠卵巢组织内铁死亡的发生机制，我们通过采用westernblot对铁死亡关键调控分子acsl4、gpx4、fth1、cox2进行检测。结果显示，pcos大鼠卵巢内gpx4、fth1蛋白表达明显降低，acsl4、cox2表达增高，fer-1干预后，gpx4、fth1蛋白表达明显升高，acsl4、cox2表达降低(图7)，黄芩素干预后，gpx4、fth1蛋白表达明显升高，acsl4、cox2表达降低(图7)。以上结果提示pcos脂质过氧化增强可能造成卵巢细胞铁死亡，而黄芩素可以减弱卵巢细胞铁死亡反应。
[0092]
本发明采用透射镜检测了卵巢内细胞形态变化，发现正常对照组大鼠卵巢细胞形态基本规则，细胞核呈圆形或椭圆形；胞质内可见均质颗粒，线粒体呈椭圆形或短杆状、内脊清晰、结构完整；pcos大鼠卵巢细胞形态稍不规则，细胞核呈圆形或椭圆形；胞质内可见少量均质颗粒，线粒体呈椭圆形或短杆状、体积偏小，内脊减少、膜密度偏高；fer-1组中细胞形态基本规则，线粒体大多呈椭圆形或短杆状，内脊减少、膜密度偏高；黄芩素组中细胞形态基本规则，胞质内线粒体呈椭圆形或短杆状、内脊稍粗。此外，fer-1或黄芩素干预后，铁死亡关键分子gpx4、fth1蛋白表达明显升高，acsl4、cox2表达降低。以上结果提示pcos脂质过氧化增强可能造成卵巢细胞铁死亡，而黄芩素可以减弱卵巢细胞铁死亡反应。
[0093]
同时，黄芩素可降低dhea处理的pcos大鼠的体重。发情周期作为pcos大鼠卵巢功能变化的另一个指标。pcos大鼠出现明显的周期性损害；经过fer-1或黄芩素干预治疗后，近一半大鼠表现出正常的发情周期。此外，我们还评估了黄芩素对每个卵巢切片中不同卵泡百分比的影响。发现pcos大鼠囊性卵泡和初级卵泡的百分比显著增加，黄芩素给药可显著降低囊性卵泡和初级卵泡的百分比。虽然pcos和对照组大鼠之间早期窦性卵泡和闭锁卵泡的百分比没有显著变化，但黄芩素显著增加早期窦性卵泡的百分比，降低闭锁卵泡的百分比。综上结果说明黄芩素可以改善卵巢功能和组织学变化。
[0094]
本实施例采用大鼠pcos造模后，检测卵巢中氧化应激及铁死亡反应水平，分析黄芩素调节铁死亡反应水平对pcos卵巢功能障碍的作用以及与脂质过氧化反应、慢性炎症反应的关系。部分动物用于测量基础体温、监测子宫内膜发育情况、观察机体炎症反应(il-18、il-6、tnf-α)、性激素水平(lh、fsh、t、ee2)、氧化应激相关sod、mda表达水平变化、卵巢组织病理变化及卵巢颗粒细胞数量变化等。另外部分动物，留取卵巢组织，同前述方法观察fe
2
和ros含量改变情况、铁死亡反应情况。观察到卵巢组织内增强的脂质过氧化和显著的铁累积，以及血清中增加的性激素lh、e2、t水平，黄芩素可逆转这一现象。黄芩素通过抑制acsl4控制的铁死亡来改善pcos的卵巢病理损害及功能障碍。本实施例为pcos防治提供了一个新的靶点。
[0095]
实施例2
[0096]
本实施例提供高dhea诱导卵巢颗粒细胞铁死亡的信号机制及黄芩素的干预作用。
[0097]
1.材料：kgn细胞(人卵巢颗粒细胞)购自meisen ctcc(ctcc-003-0105)。
[0098]
2.实验方法
[0099]
2.1kgn人卵巢颗粒细胞复苏培养
[0100]
首先打开水浴箱，将水预热至37℃，从液氮罐中取出kgn人卵巢颗粒细胞，迅速放置于预热的水浴箱中，来回摇晃，使细胞冻存管中的细胞快速融化。待细胞冻存管中细胞冻存溶液彻底融化后，用酒精对冻存管进行消毒，并用无菌棉纱布擦拭干净，随后移至超净工作台，用无菌吸管将冻存管中的细胞悬液转移到无菌离心管中，用含10％的胎牛血清的rpmi-1640完全培养基稀释混匀，转入离心机，800rpm，离心5min后，将上清液弃去，加入适量完全培养基，吹打细胞沉淀直至细胞被吹散成单个细胞，待细胞吹打均匀后装入培养皿中，放于含5％co2的37℃恒温孵育箱中培养。
[0101]
2.2kgn人卵巢颗粒细胞的培养与传代
[0102]
kgn人卵巢颗粒细胞复苏成功后接种于细胞培养瓶，随后将其放入恒温孵育箱中培养。细胞复苏后的第2天需倒置显微镜下观察细胞形态和细胞生长情况，观察有无细菌游动，防止细胞污染；随后每天加入少许新鲜完全培养基，培养2-3天，当细胞生长覆盖培养瓶底80％左右时，将细胞悬浮液轻柔吹打至单个细胞的细胞悬液，随后转移至无菌离心管中，800rpm离心3min。离心结束后弃上清，加入适量新的完全培养基，轻轻吹打混匀，按照细胞密度1:3比例传代，并补充新鲜完全培养基完全覆盖细胞，置于恒温培养箱中继续培养。
[0103]
2.3kgn人卵巢颗粒细胞增殖-毒性检测
[0104]
我们采用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8，cck-8)法检测kgn人卵巢颗粒细胞活性检测和细胞增殖-毒性检测，将kgn人卵巢颗粒细胞(1.5
×
105细胞/孔)接种于12孔板，每孔加入完全培养液1ml。将细胞分为4组:control、dhea(20μm/l)、dhea fer-1(20μm/l)、dhea 黄芩素(20μm/l)。加入fer-1或黄芩素药物培养细胞预处理5h，再加入dhea刺激kgn 48小时。
[0105]
细胞活性检测实验
[0106]
细胞增殖-毒性检测：
[0107]
a.在96孔板中接种100μl的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24小时(37℃，5％co2)。
[0108]
b.向培养板中加入10μl/孔的不同浓度干扰药物。
[0109]
c.将培养板在培养箱孵育一段适当的时间。
[0110]
d.向每孔加入10μl cck-8溶液(注意不要再孔中生成气泡，它们会影响od值的读数)。
[0111]
e.将培养板在培养箱内孵育6小时。
[0112]
f.用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
[0113]
2.4线粒体膜电位检测：
[0114]
先收集细胞。对于六孔板的一个孔，吸除培养液，根据具体实验如有必要可以用pbs或其它适当溶液洗涤细胞一次，加入1ml细胞培养液。细胞培养液中可以含有血清和酚红。加入1ml jc-1染色工作液，充分混匀。细胞培养箱中37℃孵育20分钟。在孵育期间，按照每1ml jc-1染色缓冲液(5x)加入4ml蒸馏水的比例，配制适量的jc-1染色缓冲液(1x)，并放置于冰浴。37℃孵育结束后，吸除上清，用jc-1染色缓冲液(1x)洗涤2次。加入2ml细胞培养液，培养液中可以含有血清和酚红。荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察。
[0115]
2.5电透射镜观察细胞形态变化：
[0116]
取细胞，滴一滴预冷的固定液，用两片新的、锋利的刀片成“拉锯式”将组织切下并
修小，然后用牙签或镊子将组织块移至盛有冷的固定液的小瓶中。如果组织带有较多的血液和组织液，应先用固定液洗几遍，然后再切成小块固定。应用超薄切片机进行切片，再经戊二醛和饿酸双重固定，丙酮脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸枸椽酸电子又重染色，透射电镜观察。扫描电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定，乙醇逐级脱水，co2临界点干燥，扫描电镜观察。
[0117]
2.6共聚焦显微镜检测细胞内ros变化：
[0118]
收集kgn细胞2
×
105个，采用pbs洗涤液1200rpm，离心8min，共洗涤2次。完全弃去细胞上清，加入4％的多聚甲醛2ml室温下固定20min，固定完成后加入适量的缓冲液洗涤细胞，1200rpm，室温离心8min。弃细胞悬液后加入0.2％triton，并在室温下反应20min，之后加入适量的pbs洗涤细胞，1200rpm，室温离心8min。离心后将细胞转移至1.5ml ep管中，移液枪加入1％bsa重悬细胞，室温下封闭30min，1200rpm，室温离心8min。此时以(1：200)的稀释比例加入兔抗鼠ros多克隆抗体与pbs溶液，4℃过夜；次日移液枪加入1ml pbs漂洗细胞，1200rpm，室温离心8min，加入fitc标记羊抗兔多克隆抗体(1:200)4℃过夜；pbs漂洗细胞，1200rpm，室温离心8min，移液枪吸取20μl滴入载玻片上，并迅速盖片，置于激光扫描共聚焦显微镜下观察。
[0119]
2.7统计学分析
[0120]
采用spss27.0软件(spss inc.,chicago,usa)进行统计分析，所有数据以均数
±
标准差(x
±
sd)表示。不同组间的多重比较采用单因素方差分析(anova)和dunnett's检验进行检验。p《0.05为差异有统计学意义。
[0121]
3.结果
[0122]
3.1黄芩素对dhea刺激后卵巢颗粒细胞内脂质过氧化的改善作用
[0123]
培养kgn细胞，分别加入fer-1(10μmol/l)、黄芩素(20μmol/l)干预5h，采用dhea(20μmol/l)刺激kgn细胞24h、48h、72h。分组：control、dhea、dhea fer-1、dhea 黄芩素。分别检测了dhea刺激24h、48h、72h后kgn细胞活性，结果显示，fer-1或黄芩素预处理后，dhea刺激的kgn细胞活性降低，kgn细胞活性增强。然后我们分析了kgn细胞内氧化应激分子活化情况，发现dhea刺激后kgn细胞内mda生成明显增多，超氧化歧化酶sod、gsh生成明显减少，加入fer-1或黄芩素干预后，mda水平减低，超氧化歧化酶sod、gsh水平升高(p《0.01，图8和图9)。初步说明，dhea可加强卵巢颗粒细胞氧化应激反应，而fer-1或黄芩素可以降低脂质过氧化水平，说明黄芩素可能通过调节铁死亡反应改善卵巢颗粒细胞功能。
[0124]
3.2黄芩素可降低dhea刺激后卵巢颗粒细胞内fe
2
含量
[0125]
为了明确dhea刺激kgn细胞后是否会发生铁死亡，我们检测了kgn细胞内fe
2
含量。结果显示，dhea刺激kgn细胞后，kgn内fe
2
含量明显增多，fer-1或黄芩素干预后kgn细胞内fe
2
含量明显减少(p《0.01，图10)。此外，采用激光共聚焦对ros分布及荧光强度进行检测，发现dhea刺激kgn细胞后，ros荧光强度增强，fer-1或黄芩素干预后kgn细胞内ros荧光强度减弱(p《0.01，图11)。以上结果说明黄芩素可减少卵巢颗粒细胞内ros和fe
2
含量。
[0126]
3.3黄芩素对dhea刺激后卵巢颗粒细胞形态变化的影响
[0127]
培养kgn细胞，分组：control、dhea、dhea fer-1、dhea 黄芩素。由于铁死亡会导致细胞线粒体变小，膜密度增高，嵴减少、消失，外膜破碎，细胞核中形态变化不明显。采用投射电镜观察kgn细胞形态变化如图12。结果发现，dhea组细胞形态稍不规则，线粒体肿胀、部
分內脊断裂、空泡变；粗面内质网(rer)短小、结构清晰；fer-1组中细胞形态稍不规则，细胞核(n)形态稍不规则；胞质内可见均质颗粒(g)；胞质内线粒体(m)呈短杆状或椭圆形，少数线粒体內脊清晰、结构完整；粗面内质网(rer)短小、结构清晰；黄芩素组中细胞形态稍不规则，细胞核(n)形态稍不规则；胞质内可见均质颗粒(g)；胞质内线粒体(m)呈短杆状或椭圆形，部分线粒体內脊清晰、结构完整；粗面内质网(rer)结构清晰。
[0128]
3.4黄芩素对dhea刺激后卵巢颗粒细胞线粒体膜电位的影响
[0129]
培养kgn细胞，分组：control、dhea、dhea fer-1、dhea 黄芩素。采用流式细胞仪检测kgn细胞内线粒体膜电位变化情况。jc-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位的理想荧光探针。在线粒体膜电位较高时，jc-1聚集在线粒体基质中，形成聚合物(j-aggregates),可以产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，jc-1不能聚集在线粒体基质中，形成单体(monomer),可以产生绿色荧光。图13结果显示，dhea刺激kgn细胞的线粒体膜电位降低，fer-1或黄芩素干预后，kgn细胞的线粒体膜电位明显升高。以上结果提示dhea刺激不仅影响卵巢颗粒细胞形态且降低细胞内线粒体膜电位，fer-1或黄芩素干预可增加线粒体膜电位，改善卵巢颗粒细胞功能。
[0130]
3.5黄芩素对dhea刺激后卵巢颗粒细胞内铁死亡相关分子的影响
[0131]
为了明确dhea刺激kgn细胞内铁死亡的发生机制，我们通过采用westernblot对kgn细胞内铁死亡关键调控分子进行检测。结果显示，dhea刺激kgn细胞内gpx4、fth1蛋白表达明显降低，acsl4、cox2表达增高，fer-1干预后，gpx4、fth1蛋白表达明显升高，acsl4、cox2表达降低(图14),黄芩素干预后，gpx4、fth1蛋白表达明显升高，acsl4、cox2表达降低。以上结果提示dhea刺激kgn细胞后脂质过氧化增强可能造成卵巢颗粒细胞发生铁死亡，黄芩素可以减弱卵巢颗粒细胞铁死亡反应。
[0132]
本实施例检测了kgn细胞内ros、fe
2
含量及线粒体功能，发现dhea刺激的kgn内ros和fe
2
含量明显增多，线粒体膜电位降低，细胞形态不规则，线粒体体积偏小，内脊减少、膜密度偏高，铁死亡关键调控分子acsl4表达增高。说明dhea刺激可诱导卵巢颗粒细胞发生铁死亡。
[0133]
本实施例发现加入黄芩素后，dhea刺激的kgn内ros和fe
2
含量明显降低，线粒体膜电位升高，细胞内铁死亡关键调控分子acsl4表达减低。此外，黄芩素可改善dhea诱导的卵巢颗粒细胞的氧化应激水平。说明黄芩素可以改善dhea诱导的卵巢颗粒细胞铁死亡。
[0134]
本实施例采用kgn细胞，体外给予dhea刺激，观察kgn细胞功能状态、fe
2
含量的变化以及脂质过氧化水平及铁死亡标志蛋白表达水平。进一步证实铁黄芩素可抑制死亡信号通路活化，减少卵巢颗粒细胞内ros和铁离子的累积，减弱卵巢细胞膜脂质过氧化反应，进而改善卵巢颗粒细胞功能活性。
[0135]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。