pgc-1
α
激动剂在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及pgc-1α激动剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
2.肿瘤免疫治疗，例如pd1抗体及car-t，car-nk，car-nkt治疗等，已成为最有前景的肿瘤治疗策略。免疫治疗的主要目的在于增强患者免疫细胞的抗肿瘤免疫应答，从而更加高效地清除肿瘤细胞。但是，肿瘤组织内部特殊的微环境会导致抗肿瘤免疫细胞功能异常，即耗竭，从而抑制免疫细胞对肿瘤的杀伤，导致肿瘤免疫逃逸。因此，找到新的逆转或恢复耗竭免疫细胞的方法或药物，是发展免疫治疗新策略的关键。
3.nkt细胞是一类连接着天然免疫和获得性免疫的固有样t淋巴细胞，在自身免疫疾病、感染、代谢性疾病和肿瘤等多种疾病的发生发展中具有重要的调控作用。此外，nkt细胞也是免疫治疗的重要候选细胞，且取得了初步临床治疗效果。在肿瘤免疫治疗中，nkt细胞展现了细胞因子风暴毒副作用较小、移植物抗宿主风险低的优势。同时，研究人员也发现临床治疗的结果与患者体内产生ifn-γ的nkt细胞数目呈正相关。但是，部分对nkt细胞免疫治疗不响应的肿瘤患者体内nkt细胞的功能受到明显抑制，说明nkt细胞耗竭是造成nkt细胞肿瘤免疫治疗的主要因素之一。因此，发现增强肿瘤中耗竭nkt细胞ifn-γ应答的靶点或药物，将有利于发展新的免疫治疗策略。
4.zln005是新型过氧化物增殖激活受体协同激活子(pgc-1α)激活剂，是一种小的苯并咪唑化合物，分子式是c
17h18
n2，化学结构如式i所示。作为pgc-1α的激动剂，它参与调控线粒体功能等多种生理过程，因此zln005也参与调控在多种疾病的发生、发展。例如，zln005通过促进sirt1表达和自噬来保护心肌细胞免受高糖诱导的细胞毒性，zln005也可通过诱导pgc-1α促进视网膜色素上皮细胞代谢，防止氧化损伤，改善缺血诱导的神经元损伤，降低糖尿病小鼠血糖水平，缓解胰岛素抵抗等症状。然而，zln005在增强nkt细胞抗肿瘤功能，抑制肿瘤生长方面的功能尚未发现。
技术实现要素：
5.有鉴于此，本发明提供了pgc-1α激动剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.pgc-1α激动剂单用，或与nkt细胞抗原或nkt细胞联用在制备抗肿瘤药物中的应用。
8.本发明中，所述pgc-1α激动剂为zln005、zln005d4、vpa中的至少一种。一些具体实施例中，所述pgc-1α激动剂为zln005。zln005的化学结构如下：
[0009][0010]
本发明中，所述nkt细胞抗原为αgalcer、pbs57、αgc acc8、αgc acc20:2、och中的至少一种；一些具体实施例中，所述nkt细胞抗原为αgalcer。
[0011]
本发明中，pgc-1α激动剂单用可直接促进nkt细胞线粒体功能和产生ifn-γ，增强nkt细胞杀伤肿瘤功能。pgc-1α激动剂与nkt细胞抗原联用能够改善肿瘤微环境、抑制肿瘤细胞生长。其中，所述改善肿瘤微环境包括：促进免疫细胞产生ifn-γ和颗粒酶，和/或提高肿瘤微环境中浸润nkt、cd8 t、nk细胞的比例，促进上述免疫细胞的抗肿瘤功能。
[0012]
本发明中，pgc-1α激动剂单用或与nkt细胞抗原联用提高nkt细胞的线粒体功能。
[0013]
本发明中，pgc-1α激动剂单用或与nkt细胞抗原联用提高免疫细胞抗肿瘤功能。
[0014]
本发明中，所述nkt细胞包括分离的野生ntk细胞、经体外扩增的ntk细胞或经改造的nkt细胞。其中，所述经改造的nkt细胞可以是本领域常见的类型，包括但不仅限于car-nkt、tcr-nkt。
[0015]
本发明中，所述肿瘤包括结肠癌、黑色素瘤、肝癌、肺癌、乳腺癌中的至少一种。一些具体实施例中，所述肿瘤为结肠癌，具体可为mc38结肠癌。
[0016]
本发明还提供一种组合物，包括pgc-1α激动剂和nkt细胞抗原。一些实施方案中，所述pgc-1α激动剂为zln005、zln005d4、kl1333、vpa、mogroside vi b、ac-svvvrt-nh2中的至少一种；所述nkt细胞抗原为αgalcer、pbs57、αgc acc8、αgc acc20:2、och等中的至少一种。一些具体实施例中，所述pgc-1α激动剂为zln005；所述nkt细胞抗原为αgalcer。
[0017]
本发明首次发现了pgc-1α激活剂(如zln005)与nkt细胞抗原(如αgalcer)联用或pgc-1α激活剂单用处理nkt细胞，能够促进肿瘤耗竭和失能nkt细胞的线粒体功能和ifn-γ的产生，改善肿瘤微环境中浸润nkt、cd8t、nk细胞比例和抗肿瘤功能，进而改善肿瘤微环境、抑制肿瘤生长，为肿瘤免疫治疗提供了新方案，也为其他nkt细胞功能异常的疾病治疗提供了新的药物靶点，具有重要的临床应用前景和价值。
附图说明
[0018]
图1示本发明实施例1中zln005对失能和肿瘤耗竭nkt的线粒体功能。其中，图1a显示失能nkt细胞tmrm表达，图1b显示肿瘤耗竭nkt细胞tmrm表达；
[0019]
图2示本发明实施例2中zln005对失能nkt细胞ifn-γ产生的影响；
[0020]
图3示本发明实施例3中zln005对nkt细胞gzmb产生的影响；
[0021]
图4示本发明实施例4中zln005和αgalcer联合治疗可明显抑制肿瘤生长；其中，图4a显示治疗方案，图4b到图4c显示肿瘤体积和肿瘤的变化，图4d显示肿瘤微环境中浸润nkt、nk和cd8 t细胞的比例，图4e到图4g显示肿瘤浸润nkt、nk和cd8 t细胞产生ifn-γ和
57tetramer，冰上避光染色45分钟。
[0046]
(6)对于tmrm的检测，上述细胞在hanks缓冲液中加入tmrm染料，37℃培养箱中放置20分钟。
[0047]
(7)流式检测对照组和zln005处理组nkt细胞tmrm表达，结果见图1，数据点为3次重复实验统计的结果。
[0048]
zln005处理后能明显增加耗竭和失能nkt细胞tmrm(图1)的水平，说明zln005能促进耗竭和失能nkt细胞线粒体功能。
[0049]
实施例2zln005可恢复失能nkt细胞产生ifn-γ的能力
[0050]
(1)在96孔板中用10μg/ml anti-cd3和anti-cd28抗体，4℃过夜铺板。
[0051]
(2)对于诱导失能的小鼠，摘除小鼠肝脏，研磨后悬液在40％percoll中重悬，下层加入70％percoll，经过密度梯度离心(升速6，降速2，2000rpm，20分钟)后提取中间层肝脏淋巴细胞。加入流式抗体染色(冰上避光45分钟)，用流式分选出tcrβ
cd1d-pbs57 tetramer
细胞，分选细胞加入(1)中预处理96孔板中，每孔5
×
104个细胞。
[0052]
第一组，失能nkt细胞，dmso处理，对照组。
[0053]
第二组，失能nkt细胞，zln005(20μm)处理。
[0054]
(3)步骤(2)处理后的细胞24小时后，流式分析检测nkt细胞胞内产生ifn-γ的比例。结果见图2。
[0055]
结果显示，zln005处理后，失能nkt细胞产生ifn-γ的能力明显增强，说明zln005能促进失能(耗竭)nkt细胞的功能。
[0056]
实施例3zln005不影响nkt细胞产生颗粒酶b的能力
[0057]
(1)在96孔板中用10μg/ml anti-cd3和anti-cd28抗体，4℃过夜铺板。
[0058]
(2)对照和诱导失能的小鼠，摘除小鼠肝脏，研磨后悬液在40％percoll中重悬，下层加入70％percoll，经过密度梯度离心(升速6，降速2，2000rpm，20分钟)后提取中间层肝脏淋巴细胞。加入流式抗体染色(冰上避光45分钟)，用流式分选出tcrβ
cd1d-pbs57 tetramer
细胞，分选细胞加入(1)中预处理96孔板中，每孔5
×
104个细胞。
[0059]
(3)步骤(2)处理后的细胞24小时后，流式分析检测nkt细胞胞内产生gzmb的比例。结果见图3。
[0060]
结果显示，zln005不影响nkt细胞产生gzmb的水平，说明zln005不参与调控nkt细胞颗粒酶的产生。
[0061]
实施例4zln005促进nkt细胞介导的抗肿瘤功能，抑制肿瘤生长
[0062]
(1)给小鼠皮下接种50万个mc38肿瘤细胞系。
[0063]
(2)7天后给小鼠腹腔注射3μgαgalcer并每2天灌胃一次zln005(15mg/kg)治疗小鼠。分组如下：
[0064]
第一组，对照组，给小鼠腹腔注射pbs并灌胃溶剂。
[0065]
第二组，对照组，给小鼠腹腔注射pbs并灌胃zln005。
[0066]
第三组，对照组，给小鼠腹腔注射αgalcer并灌胃溶剂。
[0067]
第四组，给小鼠腹腔注射αgalcer并灌胃zln005，联合治疗。
[0068]
随后每2天测量并记录一次小鼠肿瘤大小，实验流程见图4a。肿瘤体积和重量统计结果见图4b和图4c。
[0069]
(3)为了检测zln005对肿瘤微环境中浸润免疫细胞及其功能的影响，我们在荷瘤小鼠治疗4周后检测了瘤内nkt、nk和cd8 t细胞的比例和功能。结果见图4d-4g。
[0070]
结果显示，zln005治疗能促进nkt细胞治疗组浸润更多nkt和cd8 t细胞，促进nkt、nk和cd8 t细胞产生更多ifn-γ。说明zln005能明显增加免疫细胞的抗肿瘤功能，抑制细胞生长。
[0071]
以上实施例的结果显示，zln005能促进肿瘤耗竭nkt和失能nkt细胞线粒体功能和ifn-γ的产生；促进nkt细胞介导的抗肿瘤效果，改善肿瘤微环境中浸润nkt、cd8 t细胞比例，并增加nkt、cd8 t、nk细胞抗肿瘤功能，进而抑制肿瘤生长。这些结果说明zln005对于逆转耗竭nkt细胞功能进而改善肿瘤微环境、抑制肿瘤生长具有重要的作用，也为制备相关药物提供了新的理论依据。
[0072]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。