1.本发明涉及农业生物技术中植物培养领域，尤其涉及一种马蓝组织培养的方法。
背景技术：
2.马蓝(strobilanthes cusia)，别名南板蓝、大青、山青、山蓝、青黛、靛蓝、蓝靛叶等，属于爵床科马蓝属的多年生草本植物。马蓝在浙江、江西、湖南、福建、广东、广西、四川、云南等省区都有分布，其野生资源分布较分散，植株群落之间呈零星的分布状态,存在着逐渐消失的危险。马蓝整株植株都具有较高药用价值，富含生物碱、木质素、五环三萜、喹唑酮类等化合物，具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抑菌、保肝功能，并且在临床应用中取得了很好的治疗效果。同吋，马蓝作为一种耐阴生的常绿植物，其花色为紫色,开花时间为少花的秋冬季节,可以作为一种耐阴的地被植物在园林中应用。
3.由于对马蓝的药用价值的开发和利用,马蓝的野生资源在逐渐减少,虽然目前已存越来越多的人工种植,而主要采取的繁殖方式为种子繁殖和扦插繁殖,远远满足不了市场对其需求，且随着采用扦插繁殖的代数增加,植株的优良性状和品质会有很大降低。
4.因此，亟需一种马蓝组织培养的方法，使得在短时间内快速大量繁殖,并获得基因型一致的优良种苗,大大加快育苗进程。
技术实现要素：
5.本发明的目的在于提供出一种马蓝组织培养的方法，本发明以马蓝嫩梢茎段、腋芽茎段为外植体，经过芽诱导、增殖、生根以及炼苗移栽等步骤建立了马蓝组织培养技术体系，从而实现了本发明的目的。
6.本发明提供一种马蓝组织培养的方法，包括如下步骤：
7.(1)消毒：所述消毒包括初步清洗和深度消毒；
8.(2)诱导培养：将所述外植体于75％的酒精漂洗20s，无菌水冲洗2次，后移入8％的双氧水震荡消毒60s，消毒后的马蓝组织移入无菌水清洗3～5min，再次移入0.1％氯化汞中消毒5min，消毒后的外植体使用手术刀切除黑色死亡部分，无菌水多次清洗，后移入培养皿，用无菌滤纸吸干水分，将外植体切取为0.5～1.0cm的茎段，接种到诱导培养基中进行诱导培养；
9.(3)增殖培养：将所述步骤(2)得到的生芽生长到1-2cm时，从基部切取芽并转入增殖培养基上进行继代培养，接种后在25℃～28℃下进行暗培养1～3d，然后置于每天光照10～12h，光照强度为2000～3000lx的条件下进行培养；
10.(4)生根培养：步骤(3)的丛生芽长至2cm时，置于生根培养基上诱导生根；
11.(5)炼苗移栽：步骤(4)的幼苗根生长到1cm时，打开培养瓶炼苗3～5d，然后将幼苗取出，移栽于装有砂质壤土的营养袋或苗圃地中；浇透水，搭小拱棚覆盖塑料膜保湿，每隔2～3d少量浇水，幼苗长出新叶后缓慢增加光照，降低湿度，直至完全见光，然后进行常规管理。
12.本发明中，初步清洗包括如下步骤：将外植体用洗衣粉清洗干净，置于流水中冲洗0.5～1.0h，无菌水冲洗2次，移入乙二胺四乙酸二钠溶液中清洗5～20min，蒸馏水浸泡10～20min，再将所述外植体移入十二烷基磺酸钠溶液清洗10～20min，清洗完毕后移入无菌水中洗净、晾干、紫外灭菌30～60min。
13.进一步地，所述乙二胺四乙酸二钠溶液中清洗5min；蒸馏水浸泡10min，紫外灭菌30min。
14.初步清洗：去除表面灰尘及易去除的杂菌，乙二胺四乙酸二钠溶液是一种金属螯合剂，可清除外植体表面微量金属离子；十二烷基磺酸钠溶液可与外植体表面裸露的杂菌蛋白结合，从而杀死杂菌，同时又具有发泡、去污、浸透作用，有利于下一步深度消毒。
15.本发明中，深度消毒包括如下步骤：将所述外植体于75％的酒精漂洗20s，无菌水冲洗2次，后移入8％的双氧水震荡消毒60s，消毒后的马蓝组织移入无菌水清洗3～5min，再次移入0.1％氯化汞中消毒5min。
16.深度消毒：对外植体体外难以清除的杂菌以及体内大部分内生真菌进行进一步杀菌，酒精具有较强穿透力但不能彻底消毒，常配合其他消毒剂使用，同时酒精具有较强的湿润作用，可以排除材料上的空气，利于其他消毒剂渗入；过氧化氢对外植体几乎无毒害，并且容易清洗，可通过氧化还原反应杀死细菌和病毒；升汞属于重金属，通过使细菌蛋白质变性，从而达到消毒效果。该步消毒是从不同程度进行深度消毒。
17.本发明中，外植体选自嫩梢茎段、腋芽茎段。
18.进一步地，所述乙二胺四乙酸二钠溶液浓度为1mm～3mm，优选为1mm。
19.进一步地，所述十二烷基磺酸钠溶液的浓度为0.1％。
20.进一步地，所述诱导培养基的ph为5.4～6.4，优选为5.8。
21.进一步地，步骤(2)所述诱导培养基包括：ms培养基、1.0～3.0mg/l 6-ba、0.1～2.0mg/l naa、15～30g/l蔗糖、3.5～6.0g/l琼脂。
22.更进一步地，步骤(2)所述诱导培养基包括：ms培养基、1.0mg/l 6-ba、0.5mg/l naa、24g/l蔗糖、5.4g/l琼脂。
23.本发明的有益效果：马蓝属于爵床科马蓝属的多年生草本植物，其根茎均可入药，在临床应用中均取得了很好的治疗效果。目前马蓝的主要繁殖方式采取扦插繁殖和传统的种子繁殖方式,但这些繁殖方法繁殖率低、繁殖周期长,无法满足规模化生产需求，而本发明以马蓝的嫩梢茎段或腋芽茎段为外植体，经过芽诱导、增殖、生根以及炼苗移栽等步骤建立了马蓝组织培养快繁技术体系，为马蓝组培的进一步工厂化育苗提供技术支撑,并为以后马蓝的遗传转化和品种改良等奠定基础。
附图说明
24.图1为激素配比为6-ba1.0mg/l naa0.5mg/l马蓝嫩梢、茎的生长情况；
25.图2为激素配比为6-ba2.0mg/l naa0.5mg/l马蓝嫩梢、茎的生长情况；
26.图3为激素配比为6-ba0.5mg/l iba 0.1mg/l增殖培养基马蓝生长情况；
27.图4为培养基马蓝生根情况；
28.图5为马蓝嫩梢、茎、叶移栽生长情况。
具体实施方式
29.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。另外，如果没有明确说明，在下面的实施例中所采用的所有试剂均为市场上可以购得的，或者可以按照本文或已知的方法合成的，对于没有列出的反应条件，也均为本领域技术人员容易获得的。
30.实施例1马蓝组织培养
31.1 实验方法
32.1.1实验材料
33.供试外植体为马蓝植株嫩梢、茎、叶，由雅安迅康药业有限公司提供。
34.1.2实验步骤
35.(1)材料准备：将采回的生长健壮，无病虫害的外植体嫩梢、腋芽(直径约0.2cm左右，确保枝条无破损)。
36.(2)消毒：材料用洗衣粉清洗干净，置于流水中冲洗0.5～1.0h，无菌水冲洗2次，后移入浓度为1mm的乙二胺四乙酸二钠溶液(ph为6，吐温20 0.2％)中清洗5min，蒸馏水浸泡10min，枝条移入浓度为0.1％十二烷基磺酸钠(sds)溶液(吐温20 0.2％)(容器置于磁力搅拌器)清洗10min，清洗完毕后，马蓝枝条移入无菌水中洗净、晾干并放入超净台紫外照射灭菌30min。
37.(3)接种：马蓝组培消毒采用75％的酒精、8％的双氧水和0.1％升汞交替消毒的方式。取马蓝枝条于75％的酒精漂洗20s，无菌水冲洗2次，后移入8％的双氧水震荡消毒60s(双氧水可用密闭容器封存)，消毒后的组织移入无菌水清洗3min，再次移入0.1％升汞消毒5min，消毒后的组织使用手术刀切除黑色死亡部分，无菌水多次清洗，后移入培养皿，用无菌滤纸吸干水分。将外植体切取为0.5～1.0cm的带腋芽茎段，接种到经过高温灭菌含有不同激素用量和配方的诱导培养基中。
38.(4)培养基：以ms为基本培养基，根据不同阶段的培养目的，添加不同种类，浓度和配比的植物生长调节剂、蔗糖和琼脂，ph值5.8，设置不同浓度，配比处理。
39.(5)培养条件：培养室温度20～25℃，光照强度2000～3000lx，光照时间12h/d。
40.(6)炼苗移栽：当幼苗根生长到1cm以上时，打开培养瓶炼苗3～5d，然后将幼苗取出，移栽于装有砂质壤土的营养袋或苗圃地中；浇透水，搭小拱棚覆盖塑料膜保湿，每隔2～3d少量浇水，以保持土壤湿润。当幼苗长出新叶后缓慢增加光照，降低湿度，直至完全见光，然后进行常规管理。
41.2 实验结果
42.2.1 外植体的诱导
43.马蓝嫩梢和茎可不经过愈伤组织直接诱导丛生芽，不同培养基及激素组合丛生芽诱导率不同，生长表现有不同。而马蓝的叶片需经过愈伤组织的诱导，从而在进行不定芽的培养。
44.表1不同培养基及激素组合对马蓝嫩梢、茎诱导的情况
[0045][0046]
如表1和图1～2所示，通过以上不同浓度激素配比的培养基培养后，其中ms 6-ba1.0mg/l naa 0.5mg/l的培养基(蔗糖24g/l、琼脂5.4g/l、ph 5.8)的诱导效果最佳。待马蓝嫩稍、茎和愈伤组织在诱导30d后，分化出的丛生芽长势好，伸长高，易于分切，以便于进行增殖培养。
[0047]
2.2增殖培养
[0048]
当丛生芽生长到1-2cm时，从基部切取芽并转入不同浓度的增殖培养基上进行继代培养。接种后，先在25℃～28℃下进行暗培养1～3d，然后置于每天光照10～12h，光照强度为2000～3000lx的条件下进行培养。不同浓度的6-ba对增殖的效果不同，随着6-ba的浓度增高，增殖倍数不同，芽的长度也表现出不同的伸长。因此，在增殖培养阶段选择以下几种培养基进行增殖，从而挑选出生长情况最佳的培养基。
[0049]
表2不同激素浓度对继代增值的影响
[0050][0051]
如表2和图3所示，将诱导出的丛生芽或愈伤组织接种于以上培养基中发现，在激素浓度配比为ms 6-ba 0.5mg/l iba 0.1mg/l的培养基中增殖的效果最佳。
[0052]
2.3生根培养
[0053]
当增殖培养基中丛生芽的伸长高度为2cm时，置于含有不同浓度生长素的培养基上诱导生根。
[0054]
表3不同激素浓度对生根的影响
[0055][0056]
表4不同激素浓度对生根的影响
[0057][0058]
如表3～4及如4所示，通过不同浓度的naa对其进行生根诱导时，可以看出在1/2ms 24g/l naa 0.6mg/l的培养基中效果最好。
[0059]
2.4炼苗移栽
[0060]
待根系发育良好，形成完整的植株后打开培养瓶瓶盖，炼苗3～5d左右。然后从培养基中取出幼苗种植于营养土与泥沙混合而成的基质中，如图5所示。移栽后可用多菌灵进行叶面喷施，以提高幼苗的成活率。
[0061]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。