一种海滨木槿基因组dna快速提取方法及应用
技术领域
1.本发明涉及生物提取技术领域，更具体的说是涉及一种海滨木槿基因组dna快速提取方法。
背景技术：
2.目前普遍应用的植物基因组dna的提取方法的原理：低温液氮条件下研磨植物的不同组织，保证样品dna的稳定性。通过在提取缓冲液中加入十二烷基肌酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基硫酸钠等离子型表面活性剂，能够溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，将dna游离出来。加入抗氧化剂或还原剂β-巯基乙醇、二硫苏糖醇降低酶类的活性。加入苯酚和氯仿等有机溶剂，使蛋白质变性，通过几次离心和有机溶剂的抽提，再用无水乙醇沉淀dna、晾干、溶解，最终获得植物基因组dna。使用传统方法提取dna浓度高，但不能保证基因组dna的质量，大大降低了dna的反应效率。同时，传统方法的实验步骤繁琐且涉及氯仿等危化品的多次使用，影响实验者的健康、污染环境、实验成本高。
技术实现要素：
3.有鉴于此，本发明的目的在于提供海滨木槿基因组dna快速提取方法，以解决上述问题。
4.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
5.一种海滨木槿基因组dna快速提取方法，包括以下步骤：
6.1)样品研磨：取新鲜植物组织放入研钵，在研钵中加入液氮充分碾磨成粉末状；
7.2)裂解细胞：将植物组织粉末与裂解液混合，水浴加热；
8.3)去沉淀：在步骤2)的混合物中加入沉淀液，离心，取上清液待用；
9.4)吸附：在上清液中加入吸附液和悬浮磁珠，混合均匀；室温静置8-10min，离心，再放置于磁力架上，待溶液变清，去除上清液，沉淀物待用；
10.5)漂洗：在沉淀物中加入漂洗液，磁力架上静置55-65s，去除上清液，重复漂洗步骤一次，沉淀物待用；
11.6)洗脱dna：在步骤5)得到的沉淀物中加入洗脱液，混匀静置5-6分钟后置于磁力架上1-2min，待溶液变清，转移洗脱的基因组dna溶液至新的容器，保存即可。
12.优选的，加入裂解液或者洗脱液前需要进行45-55℃预热。
13.优选的，所述步骤2)水浴加热温度为45-55℃，加热时间为25-35min。
14.优选的，所述吸附液包括10～30％peg8000，15-20％nacl。
15.优选的，所述裂解液包括0.4-0.6mnacl,100-200mmtris,50-100mm edta,2-5％sds，ph5-6。
16.优选的，所述裂解液还包括10mg/mlrnasea。
17.优选的，所述沉淀液包括5-6m醋酸钾溶液；所述漂洗液包括70％-80％无水乙醇；所述洗脱液包括1mm-3mmtris-hcl，ph7.5-8.5。
18.优选的，所述磁珠尺寸为10-100纳米。
19.本发明的另一目的是将上述方法应用于一个或多个20mg或100mg新鲜植物样品dna纯化。
20.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明有益效果如下：
21.本发明的试剂盒中各试剂均能发挥其独特的专一性。本发明通过独特的裂解液、除杂液、dna助提剂三种试剂相互作用，能够快速高效、稳定的提取基因组dna。所述裂解液中的各组分协同增效，能够破坏细胞壁快速渗透细胞，并溶解细胞，释放基因组dna并维持其稳定性。所述dna助提剂，一方面可以有效除去植物细胞在裂解后所释放的多酚、多糖、萜类物质和膜蛋白等。同时，dna助提剂可以保护基因组dna，防止反应时间过长造成dna二聚化。最后除杂液迅速溶解膜蛋白后，破坏蛋白质的结构。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
23.图1为利用本发明提出的方法获得的基因组dna在1％琼脂糖凝胶下的电泳图；图1中1-12为海滨木槿，13-16为其他物种(白菜)对照，m为marker，hindⅲ酶切λdna。
24.图2为利用实施例2的方法获得的基因组dna在nanodrop2000测量结果；图中，1-12为不同的海滨木槿。m1为lamdadna，m2为1kbdnamarker。
具体实施方式
25.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
26.一种海滨木槿基因组dna快速提取方法，包括步骤：1)样品研磨：取新鲜组织100mg或干重组织20mg的植物组织放入研钵，在研钵中加入液氮充分碾磨成粉末状；2)裂解细胞：在一个2mlep管加600ul裂解液(50℃预热)，加入50-100mg组织粉末立即混匀。将ep管在50℃水浴30分钟；3)去沉淀：加200ul沉淀液，颠倒混匀。ep管在5000g离心10min。转移上清液约400ul到新的22mlep管；4)吸附：加400ul吸附液和20ul的磁珠(室温)，混合倒管20次。在室温放置10分钟，5000g离心轻离心5s，放置在磁力架上大约3min(直到溶液变清)。去除上清液，不触动沉淀；5)漂洗：向ep管加入1ml70％漂洗液，将ep管放置在磁力架上约60s。去除上清液，不触动沉淀。再重复一次。开盖，让磁珠空气干燥1min；6)洗脱dna：向ep管加80ul的洗脱液(50℃预热)，取下轻弹ep管悬浮磁珠。将ep管轻离心后，放置在磁力架上约2min(直到溶液变清)。转移50-100ul洗脱的基因组dna溶液至一个新的1.5mlep管，-20保存。
27.进一步的，该方法包括：裂解液、沉淀液、吸附液、漂洗液、洗脱液、磁珠、磁力架和收集管等；吸附液包括10～30％peg8000，15-20％nacl。
28.进一步的，裂解液包括0.4-0.6mnacl,100-200mmtris,50-100mm edta,2-5％sds，
ph5-6。
29.进一步的，裂解液还包括10mg/mlrnasea。
30.进一步的，沉淀液包括5-6m醋酸钾溶液。
31.进一步的，漂洗液包括70％-80％无水乙醇。
32.进一步的，洗脱液包括1mm-3mmtris-hcl，ph7.5-8.5。
33.进一步的，磁珠尺寸为10-100纳米，磁力架与收集管配套，1.5ml或300ul两种规格均可；1.5ml适用于单管，300ul适用于96孔板。
34.实施例1
35.一种海滨木槿基因组dna快速提取方法，包括步骤：
36.1)样品研磨：取新鲜组织100mg或干重组织20mg的植物组织放入研钵，在研钵中加入液氮充分碾磨成粉末状；
37.2)裂解细胞：在一个2mlep管加600ul裂解液(50℃预热)，加入50-100mg组织粉末立即混匀。将ep管在50℃水浴30分钟；
38.3)去沉淀：加200ul沉淀液，颠倒混匀。ep管在5000g离心10min。转移上清液约400ul到新的22mlep管；
39.4)吸附：加400ul吸附液和20ul的磁珠(室温)，混合倒管20次。在室温放置10分钟，5000g离心轻离心5s，放置在磁力架上大约3min(直到溶液变清)。去除上清液，不触动沉淀；
40.5)漂洗：向ep管加入1ml70％漂洗液，将ep管放置在磁力架上约60s。去除上清液，不触动沉淀。再重复一次。开盖，让磁珠空气干燥1min；
41.6)洗脱dna：向ep管加80ul的洗脱液(50℃预热)，取下轻弹ep管悬浮磁珠。将ep管轻离心后，放置在磁力架上约2min(直到溶液变清)。转移50-100ul洗脱的基因组dna溶液至一个新的1.5mlep管，-20保存。
42.实施例1中采用的吸附液包括10％peg8000，15％nacl。裂解液包括0.4mnacl,100mmtris,80mmedta,3％sds，ph5.3。裂解液还包括10mg/ml rnasea。沉淀液包括5m醋酸钾溶液。漂洗液包括75％无水乙醇。洗脱液包括2mmtris-hcl，ph8.2。
43.如图1所示，用实施例1的方法提取12个海滨木槿和4个白菜基因组dna，从图中可以看出本专利方法能提取海滨木槿和白菜的基因组dna，主带明显、dna质量较好，浓度高。白菜相比，海滨木槿dna浓度略低，可能与海滨木槿叶片次生代谢产物更复杂、提取难度大有关。
44.实施例2
45.用实施例1的方法(裂解液中没加rna酶)和ctab法提取海滨木槿基因组dna，分别对应图2样品1-6,7-12。从图中可以看出海滨木槿dna能通过ctab法提取出来，但是浓度低、杂质多、没有明显主带，dna质量差；而本专利方法提取的海滨木槿dna有明显主带，相比ctab法提取的dna浓度高、杂质少、质量较好。
46.本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
47.对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。
对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。