1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种诱导干细胞成骨分化的方法。
背景技术：
2.干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，它可以分化成多种功能细胞，具有经培养不定期地分化并产生特化细胞的能力。目前对于干细胞成骨分化时，需要添加化学诱导剂。也有研究表明，可通过微图案的方式诱导干细胞成骨分化时，但采用微图案进行诱导时，是将细胞接种到微图案中，这样细胞就必须先形成了微图案的形貌，如采用正方形微图案进行诱导，细胞就必须先形成正方形的形貌，同时细胞是生长在微图案凹槽中的，也就是说微图案尺寸远大于细胞的大小。因此，研究一种不限制细胞形成微图案形貌且不采用化学诱导剂就能诱导干细胞成骨分化的方法是非常有意义的。
技术实现要素：
3.为了解决现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种诱导干细胞成骨分化的方法，以解决现有技术中诱导干细胞成骨分化时要采用化学诱导剂或者限定细胞先形成微图案形貌才能成骨分化的问题。
4.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种诱导干细胞成骨分化的方法，包括以下步骤：
5.通过多个正多边形微图案的水凝胶诱导干细胞成骨分化；其中，正多边形边长大于等于干细胞短轴长，相邻两个正多边形的间距小于等于干细胞短轴长。
6.本发明的有益效果为：现有技术中有采用微图案方式来诱导干细胞成骨分化，但是现有技术中是将干细胞接种到微图案凹槽中，多个细胞生长最终形成微图案形貌后才有利于干细胞最终的成骨分化。但是本发明中干细胞是附在正多边形微图案表面，只要正多边形边长大于等于干细胞短轴长，相邻两个正多边形的间距小于等于干细胞短轴长，那么单个干细胞就可以附在一个甚至多个正多边形微图案表面，干细胞生长分化不受微图案限制，也就是说干细胞不需要生长成正多边形形貌，在本发明中干细胞直接在正多边形微图案表面就能被诱导进行成骨分化。
7.在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
8.进一步，多个正多边形的排列方式为等间距排列或非等间距排列。等间距排列可以为对齐方式的等间距排列，也可以是交错的等间距排列等。
9.进一步，相邻两个正多边形的间距小于等于15μm。
10.采用上述进一步技术方案的有益效果为：因为干细胞短轴长大概在15-30μm，当相邻两个正多边形的间距小于等于15μm，就可以保证细胞能够附在正多边形微图案表面进行生长，并对其诱导分化成骨。
11.进一步，正多边形为等边三角形。
12.进一步，等边三角形边长为15-60μm，优选边长为15μm。
13.采用上述进一步技术方案的有益效果为：当正多边形为等边三角形时，可有效诱导干细胞进行成骨分化，当等边三角形边长为15-60μm的情况下，更有利于干细胞成骨分化，尤其是当等边三角形边长为15μm，成骨分化效果最佳。
14.进一步，干细胞为间充质干细胞。
15.进一步，诱导干细胞成骨分化的方法具体为：制备含有多个正多边形微图案水凝胶的玻片，然后将干细胞接种在玻片上进行培养。
16.进一步，干细胞的接种量为30-50μl/cm2，干细胞的浓度为1-9
ⅹ
105个/ml；优选干细胞的接种量为40μl/cm2，干细胞的浓度为5
ⅹ
105个/ml。
17.进一步，在接种干细胞之前，向玻片加入纤连蛋白溶液，于37℃、5％co2条件下孵育2-4h；纤连蛋白溶液浓度为40-60μg/ml，优选纤连蛋白溶液浓度为50μg/ml。
18.进一步，接种干细胞的培养过程为：37℃、5％co2培养条件下培养至细胞贴壁后吸去培养基，然后加入低糖dmem基础培养基继续培养24h。
19.本发明具有以下有益效果：
20.本发明利用不同尺寸连续正多边形微图案实现了对骨髓间充质干细胞的成骨促进作用。以等边三角形为例，利用不同尺寸连续等边三角形微图案实现对骨髓间充质干细胞的成骨促进作用，微图案的产生是primo通过将紫外光投射到涂有防污层(mpeg-sva)的基底上，在uv和光引发剂(plpp)的共同作用下局部降解防污涂料。然后添加蛋白质仅吸附在照明区域，从而产生微图案。
21.采用本发明方法可以有效诱导干细胞成骨分化，分化过程不需要限定细胞生长形成微图案形貌，也不需要添加化学诱导剂，采用本发明方法对干细胞进行诱导成骨分化，其效果比化学诱导剂效果还优异。
附图说明
22.图1为微图案的荧光观察结果。
23.图2为三角形微图案的大小。
24.图3为不同大小三角形微图案细胞图片。
25.图4为不同大小三角形微图案细胞面积对比结果。
26.图5为不同大小三角形微图案细胞长短轴对比结果
27.图6为不同大小三角形微图案细胞圆度对比结果。
28.图7为三角形微图案对rbmscs成骨相关指标表达影响结果。
29.图8为三角形微图案对rbmscs成脂相关指标表达影响结果。
30.图9为三角形微图案与圆形微图案对rbmscs成骨相关指标表达影响结果。
31.图10为三角形微图案与化学诱导对rbmscs成骨相关指标表达影响结果；其中，*是与control组对比，#是osteogenesis与15μm对比。
具体实施方式
32.以下所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
33.实施例1：
34.一、实验方法
35.1、细胞培养
36.采用雌性未育2月龄的sprague-dawley大鼠，全骨髓法从中分离骨髓间充质干细胞，具体过程如下：
37.采用75％酒精对处死的大鼠进行消毒，并将股骨和胫骨与肌肉分离。剪掉两端骨骺，用低糖dmem基础培养基(l-dmem)反复冲洗骨髓腔。1500rmp室温离心8min，弃上清，用3ml l-dmem完全培养基(含15％fbs)重悬细胞，转入25cm2培养瓶中，于37℃、5％co2培养箱中静置培养。3h后首次换液(l-dmem完全培养基)，以后每一天换一次液，直至第三天，之后每2-3天换一次液。原代细胞生长至65％-70％融合状态，用胰蛋白酶消化传代。此后细胞生长至80％-90％融合状态才传代。细胞传至第三代可获得纯化的骨髓间充质干细胞。
38.2、微图案的制备
39.使用inkscape软件进行图案绘制，具体过程如下：
40.将玻片正面朝上放入电浆仪器进行3min的电浆处理，(电浆为o
2 air plasma，强度为30w)，目的是对玻片进行表面清洁。向处理过的玻片上滴加500μg/ml pll溶液(多聚赖氨酸溶液)，室温孵育1h后用0.1m hepes缓冲液清洗，再加入100mg/ml的mpeg-sva溶液(溶于0.1m hepes缓冲液)室温孵育1h，继续用pbs缓冲液清洗，最后加入plpp溶液，在primo定制化微环境系统上使用uv光刻制微图案，微图案为等边三角形，相邻两个三角形相距2μm，一排有多个连续三角形，设置多排，每两排的间距是30μm。
41.uv激发结束后，用pbs缓冲液清洗，再加入40μl 50μg/ml纤连蛋白溶液，于37℃、5％co2培养箱中孵育3h，最后再用pbs缓冲液清洗。
42.将40μl浓度为5
ⅹ
105个/ml的rbmscs接种在刻制好并已经孵育好纤连蛋白的微图案中，37℃、5％co2培养箱中放置3h，贴壁后吸去培养基，加入l-dmem完全培养基(含15％fbs)继续培养24h进行后续实验。
43.3、细胞形态分析
44.rbmscs(大鼠骨髓间充质干细胞)在微图案上培养24h后，使用显微镜观察并进行拍照记录，使用image j圈出细胞的形状，然后自动测出细胞面积、长短轴比、圆度，使用spss进行分析。
45.4、q-pcr检测微图案上细胞的分化情况
46.细胞培养24h，使用trizol法提取微图案上rbmscs中的总rna，将mrna溶解于7μl无酶水中，用分光光度计测定mrna浓度，再逆转录反应合成cdna。通过q-pcr分析成骨特异性标记物runx-2、col-1、alp、ocn、opn，成脂特异性标记物ppar-γ、ap 2、c/ebp a的变化，q-pcr反应过程如下：总反应体系为10μl，包含2
×
taq sybr green qpcr mix 5μl、cdna 1μl、上下游引物(10μm)各0.4μl、无酶水3.2μl。扩增条件如下：94℃预变性3min，94℃变性10s，60℃退火60s，共40个循环。使用的引物如表1所示。
47.表1q-pcr引物
[0048][0049][0050]
二、实验结果
[0051]
1、三角形微图案的制备及表面纤连蛋白的粘附情况
[0052]
使用primo刻制好微图案后，通过使用荧光标记的纤连蛋白对刻制好的微图案进行观察，结果如图1所示。
[0053]
由图1可知，微图案按照设定好的图片刻制成功，是等边三角形形状。如图2所示，三角形的边长为15μm、30μm、45μm、60μm，深度为1-2μm。
[0054]
2、三角形微图案表面细胞生长情况
[0055]
细胞在微图案上培养24h后，使用普通显微镜对细胞进行拍照观察。使用image j对图片进行测量分析，包括细胞面积、长短轴比、圆度，具体见图3-图6。其中，图3为不同大小三角形微图案细胞图片；图4为不同大小三角形微图案细胞面积对比结果；图5为不同大小三角形微图案细胞长短轴对比结果；图6为不同大小三角形微图案细胞圆度对比结果。
[0056]
由图3-图6可知，单个细胞可覆盖多个三角形微图案，三角形微图案不限制细胞形貌，这里的意思是细胞形貌不会因为微图案为三角形，细胞就变为三角形，细胞还是正常细胞形貌，不是三角形形貌。三角形微图案的边长越小，细胞就越细长，随着边长的变大，细胞长轴越来越短。通过对细胞进行测量，发现细胞的长短轴比和面积随着三角形微图案边长变长逐渐变小，同时又全部高于对照组；圆度随着三角形微图案边长变长逐渐变大，同时又全部低于对照组。
[0057]
3、三角形微图案对成骨相关指标表达的影响
[0058]
因为细胞可以在微米尺度上识别和区分来自细胞外基质的地形信号，所以干细胞所处微环境的表面形貌可以影响它的分化。干细胞所处的机械微环境能够调节干细胞分化
中涉及的多种信号级联反应，使干细胞能够通过不同底物形貌向不同的方向分化。
[0059]
采用q-pcr的方法，对三角形微图案上的细胞进行成骨相关指标表达影响的检测，包括runx-2、opn、ocn、alp、col-1，结果见图7。
[0060]
由图7可知，三角形微图案组成骨指标较对照组均有增加，说明三角形微图案确实对成骨有促进作用，并且经过对比发现在15μm的时候成骨效果最显著。
[0061]
4、三角形微图案对成脂相关指标表达的影响
[0062]
采用实时荧光定量pcr的方法，对三角形微图案上的细胞进行成脂相关指标表达影响的检测，包括ppar-γ、ap 2、c/ebp a，结果见图8。
[0063]
由图8可知，三角形微图案成脂指标对照组均有显著性降低，说明三角形微图案对成脂具有抑制作用。
[0064]
5、三角形与圆形微图案对细胞成骨相关指标表达的影响
[0065]
为了探究干细胞分化是否具有图案依赖性，设置了圆形微图案进行对比。圆形微图案是直径15μm、30μm、60μm，深度为1-2μm，每排有多个圆形图案，每个圆形图案相距2μm，设置多排，每两排相距30μm。
[0066]
采用q-pcr的方法，对三角形微图案上的细胞与圆形微图案上的细胞进行成骨相关指标表达的检测，包括runx-2、opn、ocn、alp、col-1，结果见图9。
[0067]
由图9可知，三角形微图案的成骨指标表达均高于圆形微图案，且圆形微图案对于成骨基因表达基本没有增加，说明三角形微图案对成骨的促进作用要强于圆形微图案，说明三角形微图案对间充质干细胞成骨分化的诱导存在特异性。
[0068]
6、三角形微图案与化学诱导对成骨相关指标表达的影响
[0069]
本实验还对干细胞进行了化学诱导，看其与三角形微图案对成骨是否不同，化学诱导是配置了成骨诱导培养基，在l-dmem完全培养基的基础上，依次添加50μg/ml抗坏血酸、5mmβ-甘油磷酸钠、0.1μm地塞米松。
[0070]
采用q-pcr的方法，对15μm三角形微图案上的细胞与化学诱导后的细胞进行成骨相关指标表达影响的检测，包括runx-2、opn、ocn、alp、col-1，结果见图10。
[0071]
由图10可知，15μm三角形微图案和化学诱导组较对照组成骨指标均有增加，但是15μm三角形微图案要显著高于化学诱导组，说明三角形微图案对成骨的促进作用要强于化学诱导。
[0072]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。