1.本技术涉及药物递送载体技术领域，特别涉及一种复合凝胶材料及其制备方法、凝胶支架及其用途。
背景技术：
2.现有的药物递送载体主要涉及单一类型药物的递送，然而，对于很多疾病的治疗，例如神经组织损伤的修复过程是非常复杂的，从炎症反应、细胞募集到细胞分化和再生，通常涉及多种信号分子。因此，单次给药的治疗不能同时抑制或激活多种生物化学信号，导致治疗效果不理想。为了提高药物递送载体的治疗效果，有必要设计一种级联的药物递送载体，具体地，该药物递送载体可以根据疾病治疗的阶段，在不同的时间段内释放不同的药物，从而达到良好的治疗效果。
技术实现要素：
3.本技术公开了一种复合凝胶材料及其制备方法、凝胶支架及其用途，以解决现有药物递送载体大部分为单一类型的药物递送且不能分级递送的问题。
4.为达到上述目的，本技术提供以下技术方案：
5.第一方面，本技术提供一种复合凝胶材料，该复合凝胶材料包括凝胶体和凝胶颗粒，凝胶颗粒分散埋设于凝胶体的内部；凝胶体的硬度低于凝胶颗粒的硬度，凝胶体负载第一递送物，凝胶颗粒负载第二递送物。
6.进一步地，还包括分散埋设于凝胶颗粒内部的纳米颗粒，纳米颗粒用于负载第三递送物。
7.进一步地，凝胶颗粒的硬度与复合凝胶材料的硬度的比值大于等于2。
8.进一步地，凝胶颗粒的粒径为250μm-300μm；凝胶体的粒径为100-200nm。
9.进一步地，凝胶颗粒为水凝胶微球，凝胶体为水系凝胶体。
10.进一步地，第一递送物为抗炎药物，第二递送物和第三递送物均为营养因子。
11.进一步地，在机械振动作用下，凝胶体优先凝胶颗粒解体。
12.第二方面，一种第一方面的复合凝胶材料的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
13.含有第二递送物的凝胶溶液交联形成凝胶颗粒；
14.将含有凝胶颗粒和第一递送物的混合凝胶溶液交联形成凝胶体。
15.进一步地，凝胶溶液的制备步骤中还包括加入包埋有第三递送物的纳米颗粒。
16.第三方面，一种凝胶支架，该凝胶支架包括壳体和设于壳体内的第一方面的复合凝胶材料或者采用第二方面的制备方法制备的复合凝胶材料。
17.第四方面，第三方面的凝胶支架在制备神经损伤产品中的用途。
18.进一步地，第一递送物为抗炎药物，第二递送物和第三递送物均为营养因子。
19.进一步地，在第一机械振动作用下，凝胶体解体，从而释放凝胶颗粒和第一递送物，在第二机械振动作用下，凝胶颗粒解体，从而释放第二递送物；
20.其中，第二机械振动的强度高于第一机械振动的强度；
21.优选的，第一机械振动和第二机械振动均为超声波或次声波。
22.采用本技术的技术方案，产生的有益效果如下：
23.本技术提供的复合凝胶材料包括凝胶体和凝胶颗粒，凝胶颗粒分散埋设于凝胶体的内部；由于凝胶体的硬度低于凝胶颗粒的硬度，结构较为疏松，在超声的作用下可以较快地打开凝胶体的交联网络结构，从而释放内部负载的凝胶颗粒和第一递送物，实现第一递送物在治疗早期的释放，而凝胶颗粒内部负载的第二递送物可以在治疗过程中缓慢长期的释放。因此，本技术中的复合凝胶材料可以在不同的时间段内释放不同的递送物，尤其是应用于药物递送时，可以根据疾病治疗的阶段，分级释放不同的药物，从而达到良好的治疗效果。
附图说明
24.图1为本技术一种实施例的复合凝胶材料的制备流程及结构示意图；
25.图2为本技术实施例1中的纳米颗粒的电镜图；
26.图3为本技术实施例1中纳米颗粒的直径分布图；
27.图4为本技术实施例1中的凝胶颗粒的光镜图；
28.图5为本技术实施例1中的凝胶颗粒的扫描电子显微镜图(横截面)；
29.图6为本技术实施例1中的壳体的结构示意图；
30.图7为本技术实施例1中的凝胶支架的扫描电子显微镜图(横截面)；
31.图8为本技术实施例2中的不同样品的细胞存活率对比图；
32.图9为本技术实施例3中的不同样品的活性氧水平的细胞流式结果图；
33.图10为本技术实施例3中的不同样品的活性氧水平的荧光强度统计图；
34.图11为本技术实施例3中的不同样品巨噬细胞水平的测试图；
35.图12为本技术实施例4中的不同组的坐骨神经髓鞘结构的透射电镜图(横截面)；
36.图13为本技术实施例4中的不同组的坐骨神经髓鞘的厚度对比图；
37.图14为本技术实施例4中的不同组的大鼠坐骨神经髓鞘的g比率值对比图；
38.图15为本技术实施例5中的不同组的大鼠坐骨神经指数对比图；
39.图16为本技术实施例5中的不同组的大鼠足迹以及大鼠腓肠肌的形态对比图。
40.附图标号：100-凝胶体；200-凝胶颗粒；300-纳米颗粒；400-壳体；
41.10-第一递送物；20-第二递送物；30-第三递送物。
具体实施方式
42.为了使本技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本技术作进一步地详细描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本技术保护的范围。
43.本技术实施例描述的应用场景是为了更加清楚的说明本技术实施例的技术方案，并不构成对于本技术实施例提供的技术方案的限定，本领域普通技术人员可知，随着新应用场景的出现，本技术实施例提供的技术方案对于类似的技术问题，同样适用。其中，在本
申请的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
44.现有的药物递送载体主要涉及单一类型药物的递送，然而，对于很多疾病的治疗，需要根据疾病的发展阶段，分级递送不同类型的药物。下面以外周神经损伤的修复为例进行说明。
45.外周神经损伤的过程包括在微观层面上发生的一系列级联过程。第一阶段为损伤发生后约5-7天，主要涉及瓦勒氏变性和局部炎症反应。在此期间，吞噬中性粒细胞和巨噬细胞被募集到损伤部位，以清除细胞碎片，从而为随后的再生奠定基础。如果第一阶段炎症控制不佳，就会形成神经胶质疤痕，阻碍轴突的生长，并对周围组织造成进一步的损伤。因此，在第一阶段，服用适量的抗炎药物可以促进后续细胞的再生。第二阶段主要在损伤后的修复期，主要涉及细胞的增殖、迁移、以及组织重塑。轴突再生从近端开始，其特征是雪旺细胞增殖形成邦纳带，引导生长锥的组装和延伸。然而，神经细胞在受损后再生的能力有限，使得轴突很难通过受损神经的间隙生长，尤其是当神经损伤之间的间隙很大时，神经内的营养不足，难以完成神经再生，因此，第二阶段持续递送生长因子可以有效地促进神经修复。
46.综上，外周神经损伤后的再生过程非常复杂，通常涉及多种信号分子，为了提高治疗效果，本技术中提供了一种复合凝胶材料，图1为本技术一种实施例的复合凝胶材料的制备流程及结构示意图，参照图1，该复合凝胶材料包括凝胶体和凝胶颗粒，凝胶颗粒分散埋设于凝胶体的内部；凝胶体的硬度低于凝胶颗粒的硬度，凝胶体负载第一递送物，凝胶颗粒负载第二递送物。
47.因为凝胶体的硬度低于凝胶颗粒的硬度，凝胶体的结构更加松散，在机械振动刺激下，凝胶体可以优先解体，从而释放凝胶颗粒和第一递送物，凝胶颗粒在更强的机械振动刺激下逐渐解体，从而释放第二递送物。因此，本技术实施例提供的复合凝胶材料可以根据需要分阶段递送待递送物，例如药物。
48.其中，机械振动可以是超声波，也可以是次声波，优选为超声波。应用于药物递送领域时，超声波可以在体外控制体内药物的递送，减少在人体内植入外源的刺激源。
49.在本技术的一些实施例中，凝胶颗粒的硬度与复合凝胶材料的硬度的比值大于等于2，具体的，凝胶颗粒的硬度为复合凝胶材料的硬度的2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、9倍或者10倍等等。
50.在本技术的一些实施例中，凝胶颗粒的粒径为250μm-300μm。凝胶体的粒径为100nm-200nm。
51.为了实现更多阶段的分级递送，参照图1，本技术实施例中的复合凝胶材料还包括分散埋设于凝胶颗粒内部的纳米颗粒，纳米颗粒用于负载第三递送物。首先，凝胶体的交联网络结构被打开，释放凝胶颗粒和第一递送物；然后凝胶颗粒的交联网络结构被打开，释放埋设于凝胶颗粒内部的纳米颗粒和第二递送物；最后随着纳米颗粒在体内的降解，埋设于纳米颗粒内部的第三递送物被释放出来。因此，该复合凝胶材料可以实现不同类型的递送物分三个阶段依次释放，其中，第一递送物、第二递送物和第三递送物可以不同，也可以相同，具体根据递送物需要持续释放的时间以及不同阶段对递送物的要求进行设定。
52.可以理解的是，纳米颗粒具有优良的生物相容性、生物降解性以及低免疫原性、低毒性和较好的机械强度。其中，本技术中不对纳米颗粒的具体类型进行限定，纳米颗粒可以
是合成的脂类或者合成高分子材料。纳米颗粒优选为聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactide-co-glycolide)，plga)，plga可以实现较长时间的缓释、控释效果。
53.其中，本技术中不对凝胶颗粒的形状进行限定，凝胶颗粒可以是球状、板状、棒状、角状、海绵状等等。其中，本技术中不对凝胶的类型进行限定，可以是水凝胶或者掺杂其他材料的复合水凝胶。
54.在本技术的一些实施例中，凝胶颗粒为水凝胶微球，凝胶体为水系凝胶体。
55.其中，当本技术实施例中复合凝胶材料应用于制备神经损伤产品时，第一递送物可为抗炎药物，第二递送物和第三递送物均可为营养因子。
56.基于同样的发明构思，本技术实施例提供一种本技术各种可能的实施方式的复合凝胶材料的制备方法，继续参照图1，该制备方法包括如下步骤：
57.含有第二递送物20的凝胶溶液交联形成凝胶颗粒200；
58.将含有凝胶颗粒200和第一递送物10的混合凝胶溶液交联形成凝胶体100。
59.在一些优选的实施例中，凝胶溶液的制备步骤中还包括加入包埋有第三递送物30的纳米颗粒300。
60.可以理解的是，本技术中不对纳米颗粒的制备方法进行限定，具体根据纳米颗粒的类型选择合适的制备方法。其中，以plga纳米颗粒为例进行说明，在一些可选的实施例中，plga纳米颗粒采用超声乳化的方法制备。采用超声乳化法制备的纳米颗粒具有均一的粒径、较高的包封率和载药量。具体的，其包封率可以达到80％以上，载药量可以达到40％以上。
61.可以理解的是，本技术中不对凝胶溶液交联成凝胶颗粒的方法进行限定，其中，以水凝胶颗粒为例进行说明，水凝胶微球的制备方法有溶液聚合、反相悬浮聚合、反相微乳液聚合等等。优选的，本技术中采用静电喷雾的方法制备水凝胶微球，具体步骤如下：
62.将混有纳米颗粒和第二递送物的水凝胶溶液放置于静电纺丝仪器的喷头中，通过在喷头和喷头下面的接收溶液(水凝胶微球的交联溶液)中分别连接高压电源的正极和负极，水凝胶溶液从喷头中喷出到交联溶液中迅速交联形成水凝胶微球。
63.在本技术的一些实施例中，将含有凝胶颗粒和第一递送物的混合凝胶溶液通过快速交联的方法制成凝胶体。
64.其中，形成凝胶体的凝胶单元的浓度小于形成凝胶颗粒的凝胶单元的浓度，以使凝胶体的硬度小于凝胶颗粒的硬度，凝胶体的结构更为松散，在超声的作用下可以较快的打开双交联网络而释放第一递送物。
65.基于同样的发明构思，本技术实施例还提供一种凝胶支架，该凝胶支架包括壳体和设于壳体内的本技术各种可能的实施例中的复合凝胶材料或者采用本技术各种可能的实施例中的制备方法制备的复合凝胶材料。壳体包裹复合凝胶材料有助于将凝胶支架植入到人体之内。
66.其中，壳体用于桥接受损伤的神经管。壳体的形状优选为管状。其中，壳体的材料具有优良的生物相容性和生物降解性，例如聚乳酸、聚己内酯、聚乙醇酸或者壳聚糖等。
67.基于同样的发明构思，本技术实施例还提供本技术实施例中的凝胶支架在制备神经损伤产品中的用途。其中，第一递送物可为抗炎药物，第二递送物和第三递送物可为营养因子。该凝胶支架的工作过程和工作原理如下：
68.首先，将凝胶支架植入人体内，在第一机械振动作用下，凝胶体的交联网络打开，释放出凝胶颗粒和第一递送物，例如抗炎药物，抗炎药物可以在治疗早期对神经损伤后早期炎症反应进行有效控制；然后，在第二机械振动作用下，凝胶颗粒的交联网络结构打开并释放负载的纳米颗粒和第二递送物，第二递送物可为营养因子，营养因子可以促进轴突的生长。而且，随着纳米颗粒的水解，可以实现治疗过程中缓慢长期释放第三递送物，例如营养因子，从而起到长期地促进神经再生的作用。
69.需要说明的是，第二机械振动的强度高于第一机械振动的强度，其中，第一机械振动和第二机械振动均可为超声波或次声波，优选为超声波。因为，在应用于神经损伤的修复中，超声不仅可以作为诱导凝胶交联网络结构打开的因素，而且可以产生神经调控效应，促进内源性神经营养素的分泌，促进细胞分化和轴突再生。
70.综上，本技术中各种可能的实施例复合凝胶材料和凝胶支架具有如下有益效果：
71.1)本技术中的复合凝胶材料可以在不同的时间段内释放不同的递送物，尤其是应用于药物递送时，可以根据疾病治疗的阶段，分级释放不同的药物，从而达到良好的治疗效果；
72.2)本技术中的凝胶支架用于制备神经损伤产品时，可以在治疗前期释放抗炎药物缓解损伤部位的炎症，并在随后的时间内持续释放营养因子，达到了较好的神经损伤修复的效果；
73.3)本技术中凝胶支架的壳体可以桥接受损伤的神经，有助于凝胶支架负载的药物对损伤神经的靶向治疗；
74.4)本技术首次提出了超声响应型水凝胶神经支架，超声不仅可以调控药物的释放，而且可以促进神经的再生。
75.下面结合具体实施例和对比例对本技术中的复合凝胶材料、凝胶支架及其应用做进一步详细说明。
76.实施例1
77.该实施例为一种复合凝胶材料和凝胶支架，参照图1，该凝胶支架包括凝胶体100和包裹凝胶体100的壳体400，凝胶体100的内部分散埋设有水凝胶微球和抗炎药物，水凝胶微球的内部分散埋设有纳米颗粒300和营养因子，纳米颗粒300的内部包埋有营养因子，其中，营养因子为神经生长因子(nerve growth factor，ngf)，抗炎药物为维生素b12。
78.该凝胶支架的制备方法如下：
79.s1：采用w1/o/w2乳化溶剂蒸发技术制备负载有ngf的plga纳米颗粒300，得到的纳米颗粒300粒径均一，约为110nm；
80.s2：采用静电喷雾的方法制备水凝胶微球：静电喷雾施加的电压为 25v，-5v，将负载有ngf和plga纳米颗粒300的水凝胶溶液通过静电喷雾到交联溶液中迅速交联形成水凝胶微球，制备的水凝胶微球的直径约为260μm；
81.s3：把水凝胶微球和抗炎类药物混合入具有超声响应性的水凝胶溶液中，交联在预制成管状的壳体400中，制备成超声响应型级联药物递送凝胶支架(简称载药支架)。
82.图2为本技术实施例1中的纳米颗粒的电镜图，图3为本技术实施例1中纳米颗粒的直径分布图，参照图2和图3，实施例1中的plga纳米颗粒的粒径均一，约为110nm。
83.图4为本技术实施例1中的凝胶颗粒的电镜图，图5为本技术实施例1中的凝胶颗粒
的扫描电子显微镜图(横截面)，参照图4和图5，实施例1中的凝胶颗粒(水凝胶微球)的粒径大小均一。
84.图6为本技术实施例1中的壳体的结构示意图，参照图6，实施例1中的壳体为管状，便于桥接受损伤的神经管。
85.图7为本技术实施例1中的凝胶支架的扫描电子显微镜图(横截面)，参照图7，实施例1中的凝胶支架的壳体内包裹有凝胶体。
86.实施例2检测载药支架和不同超声强度的刺激对细胞活性的影响
87.将实施例1中制备的载药支架植入神经细胞pc12中并分为四份样品，四份样品给予不同强度的超声刺激之后，通过活死细胞染色测定四份样品和空白样品的细胞活性，图8为本技术实施例2中的不同样品的细胞存活率统计图，参照图8，植入载药支架的细胞、0.1w/cm2的超声刺激植入载药支架的细胞、0.5w/cm2的超声刺激植入载药支架的细胞和空白样品的细胞存活率基本一致，说明支架材料以及适当强度的超声刺激对于细胞活性没有影响，然而1.0w/cm2的超声刺激植入载药支架的细胞的存活率相对于空白样品下降，说明过强的超声强度会降低细胞活力。
88.实施例3抗炎效果评估
89.将实施例1中首先脂多糖诱导小鼠单核巨噬细胞raw264.7，raw264.7是常用的炎症细胞模型之一。样品1为脂多糖诱导的raw264.7(后续简称炎症模型)，样品2为在炎症模型细胞中植入实施例1中的载药支架，样品3为超声刺激样品2中的细胞，样品4为未作处理的普通raw264.7细胞，分别观察样品1-4中细胞的活性氧的水平，图9为本技术实施例3中的不同样品的活性氧水平的细胞流式结果图，图10为本技术实施例3中的不同样品的活性氧水平的荧光强度统计图，参照图9和图10，样品2中的活性氧荧光水平显著低于样品1，说明植入实施例1中的载药支架的raw264.7细胞内活性氧的水平显著降低，同时，样品3中活性氧荧光水平显著低于样品2，说明超声刺激有助于打开载药支架的凝胶体的交联结构，促进抗炎药物的释放，降低细胞内活性氧的含量，从而有效控制炎症反应。
90.采用小鼠肌肉内植入模型测试样品1-4的组织中的巨噬细胞水平，图11为本技术实施例3中的不同样品巨噬细胞水平的测试图，参照图11，cd11b代表巨噬细胞，cd11c代表m1型巨噬细胞(促炎型)，cd206代表m2型巨噬细胞(抗炎型)，经过超声刺激的载药支架的治疗后，小鼠模型中的m2型巨噬细胞增加，代表抗炎水平提高，即合对照组相比，经过载药支架治疗后的组织中的巨噬细胞向m2型巨噬细胞分化的更多，表明载药支架可以显著降低组织中的炎症水平，促进神经再生的进程。
91.实施例4神经修复的形态学评估
92.在大鼠坐骨神经损伤后，分别植入不同的载药支架或进行自体移植手术，术后12周，采集坐骨神经组织，固定包埋切片后，用透射电子显微镜对再生神经的有髓鞘轴突进行形态学评估，其中，通过神经细胞的数量、髓鞘的厚度以及g比率(g比率＝神经纤维轴突直径/总神经纤维(轴突 髓鞘)的直径)来评估神经修复的效果。神经细胞的数量越多，髓鞘的厚度越厚，代表髓鞘再生效果越好；g比率值越小，代表神经轴突的修复水平越高。
93.图12为本技术实施例4中的不同组的坐骨神经髓鞘结构的透射电镜图(横截面)，图13为本技术实施例4中的不同组的坐骨神经髓鞘的厚度对比图，图14为本技术实施例4中的不同组的大鼠坐骨神经髓鞘的g比率值对比图，一并参照图12至图14，“自体移植”组作为
阳性对照组具有数量最多的神经细胞、最厚的神经髓鞘和较为密集的轴突，即神经损伤修复效果越好；排在第二位的是“载药支架(负载抗炎药物和营养因子) 超声”组，排在第三位的是“载药支架(负载抗炎药物和营养因子)”组，说明载药支架可以有效递送抗炎药物和神经因子，从而促进神经损伤的修改，而且超声刺激有助于递送药物的释放，更好地发挥作用；“抗炎药物 超声”组的髓鞘厚度小于“营养因子 超声”组的髓鞘厚度，说明在损伤后的修复期主要是依赖于营养因子促进神经的再生。
94.实施例5神经修复的功能学评估
95.依次通过肌电图测试、腓肠肌评估和行走轨迹分析对实施例4中各组样品中神经功能进行评估。肌电图测试结果中，载药支架(负载抗炎药物和营养因子) 超声”组的复合肌肉动作电位的幅值(3.84
±
0.11mv)与自体移植组(4.19
±
0.18mv)最接近。综合来看，载药支架(负载抗炎药物和营养因子) 超声”组对缓解去神经支配引起的肌肉萎缩和神经功能的恢复非常有效。
96.图15为本技术实施例5中的不同组的大鼠坐骨神经指数对比图，参照图15，在大鼠坐骨神经损伤后的第0，6，8，10和12周对大鼠进行步态测试并计算坐骨神经指数，数据结果表明“载药支架(负载抗炎药物和营养因子) 超声”组的修复效果最接近“自体移植”组的修复效果，达到了较好的修复效果。
97.对大鼠坐骨神经损伤后3个月的大鼠步态和腓肠肌的形态进行了记录，图16为本技术实施例5中的不同组的大鼠足迹以及大鼠腓肠肌的形态对比图，参照图16，“载药支架(负载抗炎药物和营养因子) 超声”组的大鼠右脚(神经损伤)的步态与左脚(健康)差异较小且最接近“自体移植”组，此外，对比大鼠坐骨神经损伤后3个月后的腓肠肌的形态，“载药支架(负载抗炎药物和营养因子) 超声”组的大鼠右侧的坐骨神经萎缩程度较轻，与“自体移植”组相比差异最小，并且大鼠右侧腓肠肌的形态接近大鼠左侧的腓肠肌的形态，说明经过超声刺激后，载药支架对于神经损伤的修复效果较好。
98.以上，仅为本技术的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本技术揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。因此，本技术的保护范围应以权利要求的保护范围为准。