1.本发明涉及包括抗病毒剂和载体聚合物的可喷洒抗病毒制剂，其中抗病毒剂包括硫酸化多糖，并且载体聚合物包括非硫酸化多糖。尤其，本发明涉及可喷洒抗病毒制剂，其可用作鼻喷剂或多表面喷剂。
背景技术：
2.病毒的传播可通过四种途径发生：通过与携带者的身体接触的直接接触；通过与受污染物体的相互作用的间接接触；飞沫和空气传播，通常通过咳嗽、打喷嚏和呼吸；以及气溶胶化，即悬浮在气流中的雾化病毒。
3.由于病毒有效地局部传播到呼吸道，所以呼吸道病原体的空气传播(无论是通过飞沫还是雾化)是尤其有害的。空气传播的病毒有很多，包括：流感病毒、鼻病毒、肾上腺病毒、肠道病毒和冠状病毒。冠状病毒是与多种胃肠道、中枢神经系统和呼吸系统疾病(mers、sars)有关的冠状病毒(coronaviridae(covs))科；最新的毒株(sars-cov-2)因其在2020年疫情中的巨大影响而备受关注。与所有的冠状病毒一样，sars-cov-2含有螺旋衣壳内的大的正链rna基因组，所有这些基因组都位于出芽时形成的磷脂双层包膜内。与病毒膜相关的是三种主要蛋白：膜蛋白和包膜蛋白(与组装相关)以及刺突蛋白。刺突蛋白使其呈冠状，对病毒的存活至关重要，介导病毒进入宿主细胞。另外，该蛋白在决定宿主范围和组织嗜性方面也发挥关键作用，同时还负责诱导许多宿主免疫反应。迄今为止，病毒进入宿主细胞的促进作用被认为是通过刺突蛋白内的特定基序产生的，这些基序与ace2受体发生强烈相互作用。ace2在调节氧气/二氧化碳转移中的作用是公知的，通常在呼吸道上皮细胞中发现。尤其是sars-cov-2已被发现靶向纤毛细胞和杯状细胞，随后的病毒散发会导致高病毒载量，尤其是在上呼吸道内。
4.呼吸的空气主要通过鼻子。即使鼻腔对气流的阻力最大，健康人每天平均也会吸入10,000l空气。只有当这种途径变得超负荷时，身体才会通过口腔进行呼吸。因此，鼻腔起到两个主要作用：环境控制，创设正确的湿度和空气温度水平；以及清除外来颗粒，包括灰尘、空气中的飞沫和病原体。从解剖学上讲，鼻子由两个长约10cm至15cm、高约5cm的空腔组成，总表面积约为150cm2。吸入的空气通过鼻前庭(鼻孔)向上流动，穿过狭缝状的鼻道结构(下、中、上)，然后通过鼻咽返回。在细胞水平上，空腔的大部分由典型的气道上皮细胞组成，包括四种主要细胞类型：基底细胞、纤毛/无纤毛柱状细胞和杯状细胞。柱状细胞无论是否有纤毛，都被微绒毛包裹。它们的作用是防止干燥，支持纤毛清除杯状细胞中产生的粘蛋白。另外，纤毛和微绒毛的存在大大增加了有效表面积(约9.6m2)，为过滤提供了高效的平台。不幸的是，如此大的表面积在病毒进入时也提供了更大的暴露。
5.空气传播的风险不仅通过通风系统和人群施加，而且病毒还会从包括个人防护设备在内的无生命物体上重新悬浮，这大大增加了对新型设备的需求，这些设备不仅能够防止衰退(contraction)，还能够阻止此后的传播。
6.本发明是在考虑到这些问题的情况下开发的。
技术实现要素：
7.根据本发明的第一方面，提供了包括抗病毒剂和载体聚合物的可喷洒的抗病毒制剂。抗病毒剂包括硫酸化多糖，并且载体聚合物包括非硫酸化多糖。
8.在使用中，制剂在施加其的表面上形成涂层。为了本发明的目的，重要的是该制剂是可喷洒的而不是可喷射的，以确保当该制剂施加至表面时，例如非解剖表面(如台面)或解剖表面(例如口腔或鼻腔)时，有足够的涂层覆盖。由于鼻腔的表面积相对较大且难以进入，因此均匀地覆盖鼻腔尤其具有挑战性。当用作鼻喷剂时，可喷射制剂不仅覆盖性差，而且在接触鼻壁时还会引起刺激，对患者的依从性产生负面影响。本发明的发明人已经发现，含有抗病毒剂和载体聚合物的可喷洒抗病毒制剂，抗病毒剂包括硫酸化多糖且所述载体聚合物包括非硫酸化多糖，在将该可喷洒抗病毒制剂喷洒到表面(包括鼻腔内的表面)上时实现了良好的涂层覆盖。
9.可喷洒性
10.本文中使用的术语“可喷洒的”是指当从普通喷嘴喷出时，制剂会产生卷流，而不是流体射流，而当喷出时形成射流的制剂可视为是“可喷射的”。射流可视为是一种相干的流体流，而当射流中断形成小的离散液滴时，就会形成卷流。射流会在从喷嘴喷出后立即中断，或在距离喷嘴一定距离处形成卷流。
11.为了本公开的目的，如果喷出时射流在喷嘴0cm至5cm范围内中断形成液滴的卷流，则该制剂可视为是可喷射的。不希望受理论约束，认为，当喷洒时在喷嘴0cm至5cm的范围内形成液滴的卷流的制剂产生足够的液滴分布，以覆盖有限的内部空间(如口腔或鼻腔)内的粘膜表面，并且当喷洒到较大的外表面(如台面)上时提供良好的覆盖。在一些实施方式中，在期望将制剂用作口腔喷剂或鼻喷剂的情况下，当喷洒时制剂可在喷嘴的0cm至2.5cm的范围内形成卷流。
12.在一些实施方式中，可以通过测量从设定距离喷洒制剂的设定区域的覆盖率来评估“可喷洒性”。在一些实施方式中，使用以下程序来确定覆盖百分比：
13.·
将10ml制剂与0.1ml黑色墨水在falcon管中充分混合；
14.·
将falcon管的盖子更换为普通的喷雾器(喷嘴孔径750μm)；
15.·
通过按压手动致动器10次准备好喷雾器；
16.·
将制剂垂直向上喷一次，喷在距离喷雾器喷嘴10cm处悬挂的水平纸张上；
17.·
干燥纸张，然后以600dpi灰度扫描；
18.·
使用图像分析软件比如imagej，将图像裁切成喷雾分布周围2000
×
2000像素的大小；和
19.·
图像分析软件用于分析喷雾覆盖的2000
×
2000像素面积的百分比，例如使用imagej中的“分析颗粒(analyse particles)”功能。
20.在一些实施方式中，如果通过上述程序确定的百分比覆盖率为至少13％，则该制剂被认为是“可喷洒的”。在一些实施方式中，通过该制剂实现的覆盖百分比可为至少13％、至少15％、至少20％或至少25％。一般来说，制剂实现的覆盖率越高，该制剂越可视为是可喷洒性的。
21.可以在图像分析软件中应用比例尺，以确定与2000
×
2000像素裁切图像中的1cm相对应的像素数量，从而可以将覆盖百分比转换为以cm2计的面积。由此，可以使用方程式1
来计算喷洒分布半径：
[0022][0023]
使用上述程序，如果分布半径为至少1.8cm，则该制剂可被视为“可喷洒的”。在一些实施方式中，制剂实现的分布半径可为至少1.8cm、至少2.0cm、至少2.2cm或至少2.4cm。通常，分布半径越大，制剂越可视为是可喷洒的。
[0024]
分布半径和喷嘴在喷洒时与纸张的距离可反过来用于确定喷洒角度，即，使用等式2来计算卷流中液滴偏离喷洒制剂所沿的中心轴的最大角度(其中adj为喷嘴在喷洒时与纸张保持的距离，opp为分布半径)：
[0025][0026]
使用上述程序，如果喷洒角度至少为10
°
，则制剂可视为是“可喷洒的”。在一些实施方式中，通过制剂实现的喷洒角度可为至少10
°
、至少11
°
、至少12
°
、至少13
°
或至少14
°
。一般来说，喷洒角度越大，制剂约可视为可喷洒的。将理解，在射流在距离喷嘴一定距离处而不是在喷出后立即中断成为液滴的卷流的实施方式中，卷流所形成的远离射流中心轴的实际角度可大于从喷嘴计算的角度。然而，为了本公开的目的，有效的喷洒角度视为是从喷嘴到制剂喷洒的表面所计算的角度，就好像射流在从喷嘴喷出时立即中断而成为卷流一样。
[0027]
制剂
[0028]
在一些实施方式中，制剂用作多表面喷洒剂。在使用中，该多表面喷洒剂可喷洒在任何表面上，例如台面、个人防护器材的设备或物品的外表面或呼吸机管道的内表面。使用后，可安全地擦除或洗掉多表面喷洒剂。
[0029]
在一些实施方式中，制剂用于施用在粘膜表面上。在一些实施方式中，制剂用作口腔喷剂和/或鼻喷剂。将理解，用作口腔喷剂或鼻喷剂的制剂必须是无毒的并且在粘膜表面上使用是安全的。因此，优选该制剂不含或基本不含通常用于其抗病毒特性的氧化剂，比如过氧化氢，其可能刺激脆弱的粘膜。使用后，喷雾剂可通过身体的自然粘液清除过程去除，或也可由使用者手动去除，例如，通过饮用液体(如水)将口腔喷剂冲洗到食道中，或者擤鼻子去除鼻喷剂。
[0030]
在一些实施方式中，该制剂不含或基本不含氧化剂，例如过氧化氢。在一些实施方式中，制剂包括小于0.01％w/v的氧化剂。
[0031]
本发明的可喷制剂包括硫酸化多糖作为抗病毒剂。已发现硫酸化多糖对一系列空气传播的病毒具有抗病毒活性，包括流感病毒、鼻病毒、腺病毒、肠道病毒和冠状病毒。所要求保护的制剂中硫酸化多糖的抗病毒活性有助于抑制这些病毒。本发明的发明人还发现，硫酸化多糖非常有效地与空气传播的病毒结合，尤其是与冠状病毒例如sars-cov-2结合，从而将病毒颗粒限制在制剂内并防止其进一步传播。因此，本发明的制剂具有双重的预防作用，当喷洒到表面上时，通过提供捕获病毒颗粒并防止它们通过喷洒层的物理屏障，以及通过在病毒被喷洒层捕获时对病毒具有抗病毒作用，来防止空气传播病毒的感染和/或传播。
[0032]
在一些实施方式中，可喷洒的抗病毒制剂用于预防空气传播病毒的感染和/或传
播。在一些实施方式中，空气传播病毒选自流感病毒、鼻病毒、腺病毒、肠道病毒和冠状病毒中的一种或多种。在一些实施方式中，可喷洒的抗病毒制剂用于预防冠状病毒的感染和/或传播。在一些实施方式中，冠状病毒是sars-cov-2。
[0033]
硫酸化多糖为其中的多个羟基官能团已被硫酸官能团取代的多糖。硫酸化多糖可以合成生产，例如通过化学修饰多糖，或者天然产生，例如在某些类型的海藻或藻类中生产。适合与本发明一起使用的硫酸化多糖的非限制性示例包括角叉藻聚糖、岩藻多糖、石莼胶聚糖(ulvans)和硫酸肝素。
[0034]
对于预期施加于粘膜表面的本发明的实施方式，尤其，该制剂包括与粘膜有利地相互作用硫酸化多糖至关重要，因此具有良好的粘膜粘附性。不希望受理论束缚，认为具有良好粘膜粘附性的硫酸化多糖可有助于改善制剂在粘膜表面(例如在口腔或鼻腔中)的寿命，从而延长对空气传播病毒的预防作用。因此，在一些实施方式中，制剂包括粘膜粘附性硫酸化多糖。
[0035]
角叉藻聚糖是从红海藻(red seaweed)中提取的天然硫酸化多糖的一个示例。存在具有不同硫酸化水平的几种不同类型的角叉藻聚糖，最常见的是κ-角叉藻聚糖、ι-角叉藻聚糖和λ-角叉藻聚糖。在这三种类型中，κ-角叉藻聚糖是硫酸化最少的，每个半乳糖重复单元具有一个硫酸基团；ι-角叉藻聚糖的每个半乳糖重复单元具有两个硫酸基团；λ-角叉藻聚糖是硫酸化程度最高的，每个半乳糖重复单元具有三个硫酸基团。本发明的发明人发现，角叉藻聚糖不仅表现出良好的粘膜粘附性，而且与空气传播病毒如冠状病毒，尤其是sars-cov-2非常有效地结合。
[0036]
在本发明的一些实施方式中，硫酸化多糖包括角叉藻聚糖。在一些实施方式中，角叉藻聚糖选自λ-角叉藻聚糖、ι-角叉藻聚糖和κ-角叉藻聚糖。在一些实施方式中，角叉藻聚糖为λ-角叉藻聚糖。
[0037]
不希望受理论约束，认为硫酸化多糖的粘膜粘附特性并不是可影响喷雾制剂在表面上的寿命的唯一因素。例如，优选地，制剂不是在其自身质量作用下简单地从表面流出，尤其是在倾斜或倒置的表面上，因此制剂的粘度也可对保持力有影响。具有较高粘度的制剂可在表面上具有较高的保持力。然而，在某些情况下，具有较高粘度的制剂的可喷洒性也会较差。
[0038]
在一些实施方式中，该制剂在25℃下具有0.05pa.s至100pa.s的动态粘度。将理解，制剂中的各个组分可以具有不同的固有粘度，但在一些实施方式中，制剂整体的动态粘度为0.05pa.s至100pa.s。不希望受理论约束，认为在一些实施方式中，制剂的总粘度可受到制剂的各个组分之间的粘度改变相互作用以及比如各个组分的浓度和总稀释水平的因素的影响。在一些实施方式中，制剂在25℃下的动态粘度为0.05pa.s至50pa.s、0.05pa.s至10pa.s，0.1pa.s至10pa.s、0.1pa.s至5pa.s或0.1pa.s至2pa.s。
[0039]
本发明的制剂进一步包括载体聚合物。载体聚合物包括非硫酸化多糖。适用于本发明的非硫酸化多糖的非限制性示例包括，胞外多糖(gellan)、葡聚糖、藻酸盐、果胶和黄原胶。在一些实施方式中，载体聚合物包括粘膜粘附性非硫酸化多糖。在一些实施方式中，载体聚合物包括胞外多糖。本发明的发明人已经发现，胞外多糖与硫酸化多糖一起提供了特别好的可喷洒性和保持特性。
[0040]
载体聚合物可用于改变制剂的总聚合物含量，这可有助于改善制剂在喷洒时形成
的涂层的均匀性和厚度，从而改善喷洒制剂提供的物理屏障的有效性。在单独使用硫酸化多糖不能提供所需特性的实施方式中，载体聚合物也可用于改变相关特性，例如粘度、可喷洒性和/或保持性。
[0041]
例如，发现包括中等浓度的ι-角叉藻聚糖作为硫酸化多糖，例如0.2％w/v至0.6％w/v的一些实施方式具有约0.1pa.s至5pa.s的粘度，并且表现出良好的保持性和可喷洒性，因此不需要高比例的载体聚合物。另一方面，包括更高浓度的硫酸化多糖，例如超过1.0％w/v，或包括具有更高硫酸化程度的硫酸化的多糖，如λ-角叉藻聚糖的一些实施方式可能需要更高比例的载体聚合物来改善可喷洒性。也可以将较高比例的载体聚合物添加到包括非常低浓度的硫酸化多糖的一些实施方式中，以增加制剂的总聚合物含量。
[0042]
不希望受理论约束，认为制剂的可喷洒性可部分受到硫酸化多糖的硫酸化程度和浓度以及总聚合物含量的影响，因为发现具有中等硫酸化程度的多糖(例如ι-角叉藻聚糖)可在比具有较高硫酸化程度(例如λ-角叉藻聚糖)的多糖更高的浓度下具有可喷洒性。然而，发现浓度和可喷洒性之间的关系与硫酸化多糖的固有粘度无关。例如，λ-角叉藻聚糖具有比ι-角叉藻聚糖更低的固有粘度，因此被预测为更易喷洒。然而，发现含有λ-角叉藻聚糖的制剂实际上比ι-角叉藻聚糖的可喷洒性低，因此需要添加载体聚合物以获得良好的可喷洒性能。不希望受理论约束，相比于硫酸化多糖的固有粘度，认为制剂的可喷洒性可以与硫酸化多糖的表面张力更相关，并且载体聚合物可以与硫酸化多糖发生相互作用以改变表面张力，从而改善可喷洒性。
[0043]
在一些实施方式中，可喷洒的抗病毒制剂包括稀释剂。稀释剂可用于将制剂中的抗病毒剂、载体聚合物和其他组分稀释至所需浓度，以达到所需粘度水平，和/或达到所需可喷洒性水平。稀释剂可为适用于医疗用途的任何溶剂。在一些实施方式中，稀释剂是盐水溶液。例如，盐水溶液可为磷酸盐缓冲盐水溶液。
[0044]
在一些实施方式中，基于制剂的总体积，制剂中抗病毒剂的浓度为0.1％w/v至1.0％w/v。在一些实施方式中，基于制剂的总体积，制剂中抗病毒剂的浓度为0.1％w/v至0.9％w/v、0.1％w/v至0.8％w/v、0.1％w/v至0.7％w/v、0.1％％w/v至0.6％w/v或0.1％％w/v至0.5％w/v。
[0045]
在一些实施方式中，制剂的总聚合物浓度由抗病毒剂的浓度和载体聚合物的浓度组成，或基本上由抗病毒剂浓度和载体聚合物的浓度组成。在一些实施方式中，基于制剂的总体积，总聚合物浓度为0.1％w/v至2.0％w/v、0.1％w/v至1.5％w/v、0.1％w/v至1.0％w/v或0.1％w/v至0.5％w/v。通常，当将制剂喷洒到表面上时，为了提供足够厚和均匀的层，需要中等至高的总聚合物含量(例如大于或等于0.4％w/v)，但这必须与其他要求(例如可喷洒性)相平衡，可喷洒性可随着聚合物含量的增加而降低。
[0046]
在一些实施方式中，抗病毒剂与载体聚合物之比为90:10至10:90、75:25至10:90、75:25至25:75或10:90至50:50抗病毒剂:载体聚合物。在一些实施方式中，抗病毒剂与载体聚合物之比为25:75抗病毒剂:载体聚合物。一般来说，在总聚合物浓度较低的实施方式中，抗病毒剂与载体聚合物之比可以较高，但应理解，抗病毒剂与载体聚合物之比和总聚合物浓度可以一起调节，以在制剂中实现所需的粘度、保持性和可喷洒性特性。
[0047]
在一些实施方式中，制剂进一步包括分散剂。分散剂可有助于确保抗病毒剂和其他组分，例如载体聚合物，均匀地分散在整个制剂中。在一些实施方式中，分散剂是一种或
多种表面活性剂和/或盐。表面活性剂的示例包括磷脂，例如甘油磷脂(例如卵磷脂)、山梨醇酯、吐温20-80、蔗糖单酯、十二烷基硫酸钠、聚山梨醇酯和山梨酸钾。盐的示例包括单价盐，例如包括钠(例如nacl)或钾(例如kcl)的盐和二价盐，例如包括钙(例如cacl2)或镁(例如mgso4)的盐。
[0048]
根据本发明的第二方面，提供了喷洒装置，该喷洒装置包括第一方面的制剂、用于在其中容纳制剂的主体和用于喷洒制剂的喷嘴。在一些实施方式中，喷洒装置为鼻喷装置。在一些实施方式中，喷洒装置包括用于通过喷嘴从装置喷出制剂的泵。可选地，喷洒装置可配置为使得当用手按压该装置时，例如通过挤压主体，通过喷嘴喷出制剂。喷洒装置的构造可以基于任何已知的喷洒装置，并且适当的构造对于本领域技术人员来说是已知的。
[0049]
根据本发明的第三方面，提供了鼻喷制剂，其包括抗病毒剂和载体聚合物。抗病毒剂包括硫酸化多糖，并且载体聚合物包括非硫酸化多糖。
[0050]
将理解，关于第一方面描述的任何特征可以同样适用于第三方面，例如硫酸化多糖和载体聚合物的类型和浓度、制剂中的其他组分等。
[0051]
本文所述的制剂可用于预防和/或治疗空气传播病毒，例如冠状病毒。
附图说明
[0052]
图1示出了本发明制剂在鼻腔中的建议机制的示意图；
[0053]
图2为使用中的鼻喷剂的示意图；
[0054]
图3示出了一系列生物聚合物的可喷洒性筛选结果；
[0055]
图4示出了一系列生物聚合物和其混合物的粘度数据；
[0056]
图5示出了胞外多糖和λ-角叉藻聚糖混合物的粘度数据；
[0057]
图6示出了包括胞外多糖和λ-角叉藻聚糖的制剂的可喷洒性结果；
[0058]
图7示出了包括ι-角叉藻聚糖以及ι-角叉藻聚糖和胞外多糖的混合物的制剂的可喷洒性结果；
[0059]
图8示出了包括胞外多糖和λ-角叉藻聚糖的制剂的液滴分布数据；
[0060]
图9示出了包括胞外多糖和λ-角叉藻聚糖的制剂的喷雾覆盖率数据；
[0061]
图10示出了表明包括胞外多糖和λ-角叉藻聚糖的制剂的细胞依从性和感染抑制的体外数据；
[0062]
图11示出了hoechst染色的图像，其表明包括胞外多糖和λ-角叉藻聚糖的制剂的感染抑制作用；
[0063]
图12(a)和图12(b)示出了表明包括κ-角叉藻聚糖、ι-角叉藻聚糖和λ-角叉藻聚糖的制剂的感染抑制作用的体外数据，并且图12(c)示出了用各种生物聚合物混合物处理时，感染sars-cov-2的细胞的百分比：胞外多糖-硫酸葡聚糖(ds)、胞外多糖-葡聚糖(d)、胞外多糖-硫酸乙酰肝素(hs)；
[0064]
图13示出了胞外多糖、ι-角叉藻聚糖和λ-角叉藻聚糖的细胞结合结果；
[0065]
图14为示出了感染sars-cov-2的细胞百分比的图示，该百分比是用胞外多糖和胞外多糖-硫酸化聚合物复合物处理的函数；和
[0066]
图15示出了病毒转导作为不同处理组的函数(用于确定转染程度的典型图像)。
具体实施方式
[0067]
图1a-图1c示出了根据本发明的制剂2如何在鼻腔中抑制sars-cov-2的建议机制。图1a示出了一层鼻喷制剂2中的鼻粘膜上皮细胞100。鼻粘膜上皮细胞100包括纤毛细胞4、杯状细胞6、无纤毛细胞8和基底细胞10。杯状细胞6产生粘液层12，随着时间的推移，粘液层12被纤毛细胞4清除，以沿引流d的方向排入喉咙。纤毛细胞4和杯状细胞6含有大量的ace2受体，因此特别容易被sars-cov-2感染。
[0068]
将根据本发明一个实施方式的制剂喷洒到鼻腔中，形成制剂层2，该制剂层2粘附到粘液层12并提供对抗病毒的物理屏障，病毒颗粒14被捕获在制剂层2内并防止它们感染纤毛细胞4和杯状细胞6。制剂层2可以与粘液层12一起被自然清除以排出，或者通过擤鼻子排出，从而从鼻腔安全地去除被捕获的病毒颗粒14。
[0069]
如图1b所示，制剂2中包括的聚合物16可以在细胞界面上产生空间屏障，从而阻止病毒颗粒14进入细胞4、6。如图1c所示，聚合物16也可以在病毒颗粒14的界面周围产生空间屏障，从而防止病毒进入细胞4、6。另外，本发明制剂中的聚合物包括硫酸化多糖，其已被证明具有抗病毒活性，因此可以使截留在制剂中的病毒颗粒失活。
[0070]
图2示出了喷入使用者鼻腔20的鼻喷制剂的示意图。在使用中，喷洒装置的喷嘴22被插入鼻孔并致动，例如通过挤压喷洒装置的主体或通过操作喷洒装置中的泵。制剂从喷嘴22喷到鼻腔20中，并覆盖鼻腔20后部的鼻粘膜上皮细胞24。
[0071]
由于通过鼻孔进入的困难，以及鼻粘膜上皮细胞相对较大的表面积和复杂的拓扑结构(包括倾斜表面和平顶(ceiling))，在整个鼻粘膜上皮细胞上提供预防性涂层是一个重大挑战。因此，本发明的制剂被设计为在倾斜表面上提供良好的可喷洒性和保持性。
[0072]
在可喷制剂中，制剂以连续的流或“射流”26从喷嘴22沿着喷雾的中心轴线喷出，因此仅在集中的位置覆盖鼻粘膜上皮细胞24。在根据本发明的可喷制剂中，该制剂形成液滴的“卷流”28，该液滴远离喷雾的中心轴线扩散并覆盖较大面积的鼻粘膜上皮细胞24。
[0073]
初步筛选
[0074]
为了使所示的捕获机制在实践中发挥作用，重要的是使制剂在应用表面上保持一段合理的时间，并且不会在其自身质量的作用下从表面流出。优选地，制剂应在表面上保持尽可能长的时间，以最大限度地延长对空气传播病毒的预防效果。
[0075]
同样重要的是，该制剂是可喷的，以便在尽可能多的表面区域上提供足够、均匀的覆盖。
[0076]
因此，本发明的发明人开始筛选多种不同的生物聚合物的保持性和可喷洒性特征。
[0077]
通过将50ml pbs与950ml去离子水混合来制备5％v/v的磷酸盐缓冲盐水(pbs)储备溶液。然后通过将1g下列生物聚合物之一与100ml等分的储备溶液混合来制备1％w/v浓度的胶体生物聚合物溶液：
[0078]
(a)藻酸盐；
[0079]
(b)果胶；
[0080]
(c)ι-角叉藻聚糖；
[0081]
(d)κ-角叉藻聚糖；
[0082]
(e)胞外多糖
[0083]
(f)葡聚糖。
[0084]
将几滴黑色墨水添加到等分的胶体生物聚合物溶液中，并混合以均匀分散着色剂。然后将1ml的有色溶液样品装入设置为1巴的喷枪(750μm孔径)中，并喷在以45
°
角支撑在气刷前面的醋酸酯片上。在取样之间使用乙醇和水连续清洁喷枪。
[0085]
喷雾筛选的结果如图3所示。含有海藻酸盐、果胶或葡聚糖(a、b和f)的制剂似乎是可喷射的，而不是形成卷流，并在其自身质量下从醋酸酯片流出。另一方面，含有胞外多糖或角叉藻聚糖(c、d和e)的制剂在醋酸酯片上表现出良好的可喷洒性和保持性，在喷雾部位形成相对均匀的覆盖。因此选择了凝胶兰和角叉藻聚糖进行进一步研究。
[0086]
流变学
[0087]
使用装有锥板(4
°
，40mm直径)几何结构(cone-and-plate geometry)的旋转流变仪(kinexus ultra，netzsch geratebeu gmbh，de)测量含有上述初始筛选中使用的生物聚合物的制剂，以及包括胞外多糖、ι-角叉藻聚糖、λ-角叉藻聚糖和其混合物的各种不同组合的制剂的粘度曲线。测试在25℃下，并在压力控制下进行。通过在2分钟的斜率时间内将剪切应力从最大值100降低到0.001pa(取决于测试材料以防止在较低粘度下从间隙排出)来分析动态粘度。kinexus软件用于使用幂律和cross模型表征流量剖面。
[0088]
结果如图4-图5和表1所示。图4(a)-图4(e)示出了包括以下聚合物的配方的粘度数据：
[0089]
(a)在初始筛选中使用的生物聚合物的范围(1％w/v)；
[0090]
(b)ι-角叉藻聚糖(0.2％w/v至1.0％w/v)；
[0091]
(c)ι-角叉藻聚糖和胞外多糖的50:50混合物(0.2％w/v至1.0％w/v)；
[0092]
(d)胞外多糖(0.2％w/v至1.0％w/v)；和
[0093]
(e)λ-角叉藻聚糖(0.2％w/v至1.0％w/v)。
[0094]
图5(a)-图5(c)示出了胞外多糖和λ-角叉藻聚糖在以下条件下的不同比例的粘度数据：(a)0.2％w/v，(b)0.4％w/v，和(c)1.0％w/v。
[0095]
表1
[0096]
[0097]
1％w/v胞外多糖/λ-角叉藻聚糖体系的流动行为显示，随着两种聚合物的比例从一个极端转移到另一个极端(100％胞外多糖至100％λ-角叉藻聚糖)，从指示胞外多糖的材料特性转变为λ-角叉藻聚糖的材料特性(在低应力下粘度保持稳定)。当体系从高胶凝比转变为低胶凝比时，观察到总粘度的损失，稠度系数(k)从3.54降低到0.03证实了这一点。这与速率指数(n)的增加有关，其中更多的胞外多糖导致更高的剪切稀化程度：100％胞外多糖为0.40，而100％λ-角叉藻聚糖为0.82。由cross模型表征的所有混合物导致聚合物总含量降低到0.4％(w/v)，这与为分离的聚合物提供的数据一致。将聚合物浓度进一步降低到0.2％(w/v)，得到的分布与胞外多糖与λ-角叉藻聚糖之无关，样品(在误差范围内)彼此无法区分。
[0098]
粘度数据也被用来更好地了解喷雾在鼻腔内的潜在停留。方程3用于预测在重力作用下施加在斜坡上的材料上的应力。
[0099]
σ
max
＝ρ.g.h.(sinθ)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
[3]
[0100]
式中，ρ为鼻喷剂的密度(kg.m-3
)，g为重力(9.807m.s-2
)，h为喷涂层的厚度(m)，θ为倾角。基于以45
°
喷涂层的最大厚度为500μm(方程4)施加聚合物悬浮液的值，产生7mpa的理论应力。
[0101]
σ
max
＝1.01x9.807x1x10-3
(sin 45)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
[4]
[0102]
简单的力平衡表明，重力作用下的应力不足以在任何含有动态屈服应力的体系中诱导流动。事实上，即使在cross模型描述的体系中，由于重力引起的外部应力也不足以将体系从零剪切平台区移动到减薄区。
[0103]
可喷洒性
[0104]
对胞外多糖和λ-角叉藻聚糖的喷雾行为进行了评估。将试验制剂与黑色染料(0.1％v/v)混合，并充分摇动以提供均匀的混合物。然后使用典型的手持式喷雾器(adelphi，uk)将彩色制剂垂直向上喷到水平纸基材上。将喷涂的基材在空气中干燥，并以600dpi(灰度)进行扫描。使用图像包(imagej)对图像文件进行处理，其中最初将图像文件裁切为以喷雾图案为中心的2000
×
2000像素框。将标准阈值应用于所有图像，并将比例校正为2000像素等于100％。进行液滴分析，并将总覆盖率确定为整个图像的百分比。将分布记录为x/y坐标，并相对于中心液滴绘制。
[0105]
结果如图6-9和表2所示。
[0106]
表2
[0107][0108]
在总聚合物浓度为1％w/v时，胞外多糖和藻酸盐显示出良好的可喷洒性(覆盖率》13％，分布半径》1.8cm且喷雾角》10
°
)，而ι-角叉藻聚糖、λ-角叉藻聚糖和黄原胶则不可喷。通常，发现降低总聚合物浓度可以提高可喷洒性，0.4％的制剂比1.0％的制剂可喷洒性高
得多，0.2％的制剂比0.4％的制剂可喷洒性略高。还发现添加胞外多糖或藻酸盐可以提高ι-角叉藻聚糖和λ-角叉藻聚糖的可喷洒性。
[0109]
图6(a)-图6(b)示出了包括：(a)100％胞外多糖和(b)100％λ-角叉藻聚糖的制剂的喷雾分布。图7(a)-图7(b)示出了包括：(a)100％ι-角叉藻聚糖，和(b)ι-角叉藻聚糖和胞外多糖的50:50混合物的制剂的喷雾分布。
[0110]
胞外多糖展现出其固有的可喷洒性，在所研究的所有浓度范围内形成了典型的“卷流”。相对而言，λ-角叉藻聚糖体系在较低浓度下形成卷流，但在较高浓度下表现出越来越大程度的“喷射”。ι-角叉藻聚糖体系在比λ-角叉藻聚糖更高的浓度下形成卷流，但在较高浓度下再次证明了喷射程度的增加。包括ι-角叉藻聚糖和胞外多糖的混合物的体系在较高浓度下比单独的ι-角叉藻聚糖表现出增加的卷流形成和更低的喷射程度。
[0111]
图8中示出了以(a)0.2％(w/v)、(b)0.4％(w/v)和(c)1％(w/v)总聚合物条件下胞外多糖和λ-角叉藻聚糖混合物的液滴分布。随着聚合物总含量的增加，分布变得更窄，在中心聚集体周围形成的卫星液滴更少。
[0112]
绘制了覆盖率和总聚合物浓度之间的一般负相关关系，大致拟合线性趋势(胞外多糖和λ-角叉藻聚糖的r2＝0.72和0.62)，如图9(b)所示。总体来说，观察到所有胞外多糖浓度都比单独使用λ-角叉藻聚糖产生更高的覆盖率，显示出28.5-20.7％的最大和最小覆盖率，而λ-角叉藻聚糖体系(分别为0.2％和1.0％(w/v)聚合物)的覆盖率为15.9-6.1％。
[0113]
能够在图8中清楚地看到聚合物总含量和聚合物之比在复合材料体系的可喷洒性中所起的作用。在所有情况下，无论总聚合物浓度如何，都观察到随着胞外多糖与λ-角叉藻聚糖的比例降低，向较小分布的转变。当改变总聚合物含量时，这些变化变得更加明显，其中100％胞外多糖与100％λ-角叉藻聚糖之间的变化幅度遵循总聚合物含量1.0％》0.4％》0.2％(w/v)的趋势。
[0114]
这些观察结果反映在图9(b)所示的总覆盖率数据中。用胞外多糖代替总λ-角叉藻聚糖的25％，使得0.2％和0.4％(w/v)体系的覆盖率分别增加4.9％和4.4％，1％总聚合物含量的喷雾覆盖率初始损失(-3.5％)。将胞外多糖：λ-角叉藻聚糖之比提高到75:25，使0.2％、0.4％和1.0％(w/v)体系的覆盖率分别提高了9.0％、14.1％和2.9％。
[0115]
体外分析
[0116]
进行了一项研究，以确定在48小时的测试期内细胞对喷雾制剂的依从性。结果如图10(a)所示。发现细胞耐受性取决于聚合物浓度，这表明在1:2的稀释度下，胞外多糖和λ-角叉藻聚糖的活细胞数量都减少了2倍。剂量反应是线性的(胞外多糖和λ-角叉藻聚糖的r2分别为0.96和0.97)，随着体系变得越来越稀，细胞死亡减少。
[0117]
使用sars-cov-2检测法对冠状病毒的衰退(contraction)和/或传播的预防进行了评估。将vero细胞接种在培养基中，然后在第二天感染sars-cov-2。使用两种治疗方案施加制剂：在感染细胞之前用制剂处理病毒(称为处理的病毒vt)，或在引入病毒之前用制剂处理细胞(称为处理的细胞ct)。24小时或48小时后通过细胞固定终止感染，并通过使用cx5高内涵显微镜的算法估计感染细胞的数量。
[0118]
图10(b)和图10(c)分别示出了在处理病毒和处理细胞方案的情形下，单聚合物体系对最终感染的影响。观察到，在胞外多糖制剂的情况下，无论处理方案如何，所有稀释液都会在24小时后导致感染。48小时后感染水平加剧，所有稀释液均大于1:3，导致感染水平
高于对照。λ-角叉藻聚糖体系在24小时或48小时的任一时间点均未显示出高于未感染对照的感染迹象，而与处理方案无关。
[0119]
还使用相同的方案在48小时内研究了以75:25或25:75的比例含有1％总聚合物(胞外多糖:ι-角叉藻聚糖)的复合体系。结果如图10(d)和图10(e)所示。在处理细胞方案的情形下，与未经处理的对照组相比，比例为75:25的复合物在稀释至1:10000时显示出显著的感染抑制作用(最小p＜0.05)(图9(d))。相比之下，比例为25:75的复合物，包括更高比例的ι-角叉藻聚糖，对感染的抑制不一致，稀释度为1:30、1:1000、1:3000和1:10000，所有这些都导致感染水平等于或大于未经处理的对照(图9(e))。
[0120]
两种处理方案的比较突出了抑制感染能力的差异。对于25:75的复合物，与先处理病毒相比，先处理细胞在1:3至1:300(1:30除外)的较低稀释因子下更有效。然而，在更大稀释因子(》1:30)的情形下，先处理病毒变得更有效。对于75:25的复合物，先处理病毒在所有稀释液中都更有效地抑制感染，但在1:100和1:300的稀释液中，先处理细胞更有效。这可以在hoechst染色的图像中更清楚地看到(图11)，其中与细胞处理组相比，病毒处理组的感染细胞(浅色)的程度通常较低。
[0121]
为了确定聚合物主链上的硫酸化程度是否对抑制感染很重要，使用sars-cov-2测定法，在处理病毒和处理细胞方案下，对κ-角叉藻聚糖、ι-和λ-角叉藻聚糖进行了48小时的研究(见图12(a)和图12(b))。
[0122]
观察到，在所有先处理细胞的情况下，与未经处理的对照组相比，感染显著减少(p＜0.001)。这对于病毒处理方案来说是不可能的，因为更高的稀释因子(1:1000和1:3000)在统计上不会影响ι-角叉藻聚糖和λ-角叉藻聚糖制剂的感染程度。另外，聚合物的硫酸化程度与其抑制感染的能力之间没有相关性。
[0123]
在一项相关实验中，测试了各种聚合物混合物：胞外多糖-硫酸葡聚糖(ds)、胞外多糖-葡聚糖(d)、胞外多糖-硫酸乙酰肝素(hs)。如图12(c)所示，与不含硫酸化多糖的处理相比，添加硫酸基团降低了感染水平(图12(c)中的虚线示出了仅胞外多糖体系的感染水平)。
[0124]
细胞结合研究
[0125]
评估了胞外多糖和角叉藻聚糖与人体细胞结合的能力。vero细胞在t75烧瓶中扩增，用pbs(5ml)洗涤，并用tryple(2.5ml)去除。然后将细胞重新悬浮在完全培养基中，并接种到孔板中(10,000个细胞/孔)。在处理之前的24小时内，使细胞贴壁。然后用pbs洗涤细胞三次，并去除最后的洗涤液。将聚合物制剂以1:3或1:5的倍数稀释，并放置在细胞上(200μl)；对照组用等体积的pbs处理。在用pbs洗涤(三次)之前，将细胞孵育30分钟。随后用阿尔新蓝(0.1％)对细胞进行30分钟的染色，然后在pbs中进行最终洗涤以去除残留染色。然后加入pbs(200μl)，并使用cytation 5m自动微板成像仪使用聚焦在每个孔中心的
×
4光学透镜在明视场中对孔进行成像。孔被分成6
×
4的矩阵，并回顾性地(retrospectively)拼接在一起。然后使用软件包(imagej)将图像裁切为孔直径，并对颜色阈值进行标准化，然后分析平均强度。
[0126]
结果如图13所示，其中用以下物质处理孔：
[0127]
(i)胞外多糖；
[0128]
(ii)ι-角叉藻聚糖；
[0129]
(iii)λ-角叉藻聚糖；
[0130]
(iv)仅细胞和染色(对照)；
[0131]
(v)仅细胞(对照)。
[0132]
强度数据显示，与仅细胞组相比，用1:3稀释的两种角叉藻聚糖处理的细胞之间存在显著差异(p＜0.001)。另外，与仅染色细胞组相比，显著性仍然存在(p《0.01)。胞外多糖与细胞没有显示出显著的结合。
[0133]
角叉藻聚糖之间的分析表明，与λ-角叉藻聚糖相比，ι-角叉藻聚糖具有更高的平均强度(分别为56.2％和44.4％)。然而，与ι-角叉藻聚糖相比，λ-角叉藻聚糖样品似乎显示出更高的最大强度区域。
[0134]
病毒转染研究
[0135]
测试了4种类别(胞外多糖、胞外多糖-葡聚糖、胞外多糖-硫酸葡聚糖和胞外多糖-λ角叉藻聚糖)以及含有等体积的培养基而不是凝胶制剂的对照。
[0136]
将传代4次的人原代成骨细胞在达尔伯克改良伊格尔培养基(thermo fisher scientific，美国)中培养，该培养基含有10％的fcs和1％的青霉素-链霉素(sigma-aldrich，德国)。根据标准程序使用胰蛋白酶-edta(lonza，美国)收获它们，并以15,000个细胞/孔(直径34.8mm)的密度接种到6孔培养皿中，每种类型一式三份。
[0137]
使细胞在24小时内贴壁。在此期间后，抽吸培养基并加入800μl培养基，然后加入200μl每种制剂(胞外多糖、胞外多糖-葡聚糖、胞外多糖-硫酸葡聚糖和胞外多糖-λ-角叉藻聚糖)。
[0138]
对照组接受200μl培养基代替凝胶物质。
[0139]
与少量液体残留物接触后，凝胶形成盘状颗粒，悬浮在细胞表面。在每个孔中加入1ml感染培养基，其中含有分散的病毒颗粒，因此病毒载量为3.75μl，即在每个孔内分布有25个病毒颗粒/细胞(ppc)。将细胞孵育18小时，然后抽吸出培养基和颗粒。加入2ml新鲜培养基，并以2滴/ml的比例与含有hoechst 33342(invitrogen，life technologies，oregon，美国)的核染色剂nucblue活细胞染色剂一起孵育，孵育20-25分钟然后并成像。
[0140]
使用olympus fluoview fv1000共焦激光扫描显微镜(olympus，tokyo，日本)对细胞(如图15所示)进行成像。从405/543nm波长的激发获得的图像在单独的通道中收集，并使用fluoview fv10-asw软件4.2版(olympus，tokyo，日本)进行组合。在相同的条件和激光参数下对细胞进行成像。
[0141]
结果如图14所示，该图显示，在存在硫酸化多糖(角叉藻聚糖和硫酸葡聚糖)的情况下，与仅使用胞外多糖相比，病毒转染细胞的能力受到抑制。