一种乌奴龙胆植株组培快繁的计算方法与流程-j9九游会真人

文档序号:35755731发布日期:2023-10-16 20:55阅读:9来源:国知局


1.本发明涉及组培快繁技术领域,具体为一种乌奴龙胆植株组培快繁的计算方法。


背景技术:

[0002][0003]
乌奴龙胆主产于中国西藏和青海西南部,生于高山砾石带、高山草甸和沙石山坡、海拔3900~5700m等地,在尼泊尔、锡金、不丹也有分布,以我国西藏地区所产的质量较优,高4~6cm,具发达的匍匐茎,须根多数,略肉质,淡黄色,枝多数,稀疏丛生,直立,极低矮,节间短缩,花果期8~10月。
[0004]
据调查,乌奴龙胆野生资源趋于濒危状态,远不能满足藏药生产对乌奴龙胆的需求,因此建立乌奴龙胆的快繁体系十分必要,关于乌奴龙胆的研究报道很少,主要集中于研究其化学成分,在组培扩繁方面未见报道,因此不具备适应的组培扩繁方法,具有较大的野生资源保护压力。


技术实现要素:

[0005]
针对现有技术的不足,本发明提供了一种乌奴龙胆植株组培快繁的计算方法,具备提高乌奴龙胆组培过程中,不定芽增殖倍数和生根率等优点,解决了有较大的野生资源保护压力的问题。
[0006]
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:一种乌奴龙胆植株组培快繁的计算方法,包括以下步骤:
[0007]
s1:合适外植体筛选;
[0008]
s2:hgcl2溶液最佳消毒时间筛选;
[0009]
s3:最佳不定芽诱导分化培养基筛选;
[0010]
s4:最佳生根培养基筛选。
[0011]
进一步,所述和消毒时间筛选的过程中,具体步骤如下:
[0012]
1)切取健壮且无病虫害的乌奴龙胆植株带节茎段(0.5~1cm)和叶片块(0.5~1cm2)作为外植体,用自来水把外植体表面污渍冲洗干净;
[0013]
2)然后用肥皂水清洗外植体3~5min,再用自来水反复将肥皂水残液冲洗干净,置于超净工作台上;
[0014]
3)接着用75%酒精清洗外植体15s,再用无菌水振荡清洗3次,每次不低于1min,最后将外植体放入hgcl2溶液中分别消毒2、4、6、8、10min,再用无菌水振荡清洗3次,每次不低于1min。
[0015]
进一步,所述外植体和消毒时间筛选的过程中,外植体消毒完成后用无菌滤纸吸干表面水分,去除接触hgcl2溶液的伤口部分,接入初始培养基,两种外植体每个处理接种10瓶,每瓶1个外植体,3次重复,培养30d后统计并计算未污染率和成活率。
[0016]
进一步,所述步骤s3中筛选具体步骤如下:
[0017]
1)选用成功消毒后的外植体作为实验材料,接入8种“不定芽诱导分化培养基”,每个处理接种10瓶,每瓶1个外植体,3次重复;
[0018]
2)培养30d后统计并计算愈伤组织出愈情况、芽的增殖倍数、芽的平均长度、未白化率和未玻璃化率。
[0019]
进一步,所述步骤s4生根培养基筛选的过程中,具体步骤如下:
[0020]
1)经过诱导分化形成的丛生芽,待其发育成2~3cm丛生苗,具有2~3片叶片时,转接入8种“生根培养基”,每个处理接种10瓶,每瓶1株苗,3次重复;
[0021]
2)培养60d后统计并计算平均生根数、平均根长度、平均根健康率和平均生根率。
[0022]
进一步,所述实验结果数据结合3次重复实验各指标的平均值,采用模糊隶属函数法对不同消毒时间、不同不定芽诱导分化培养基、不同生根培养基的效果进行综合评价,先计算出某一指标的隶属函数值,然后再计算出每个处理的平均隶属函数值,其计算方程为:
[0023]uij
=(x
ij-x
jmin
)/(x
jmax-x
jmin
),
[0024][0025]
公式中,u
ij
为i处理j指标的隶属函数值,x
ij
为i处理j指标的值,x
jmax
为所有处理中此指标的最大值,x
jmin
为所有处理中此指标的最小值,ui为i处理各指标的平均隶属函数值,n为指标数。
[0026]
进一步,所述不同乌奴龙胆外植体及不同消毒时间的消毒效果计算的过程中,须计算3次重复实验各处理组外植体的平均未污染率和平均成活率,具体计算方法如下:
[0027]
平均未污染率=(未出现污染现象的瓶数/接种瓶数
×
100%)/3,
[0028]
平均成活率=(成活数/接种数
×
100%)/3。
[0029]
进一步,选用成功消毒后的带节茎段作为实验材料,进行不定芽诱导增殖实验须计算3次重复实验各处理组的平均芽增殖倍数、平均芽长度、平均未白化率和平均未玻璃化率,具体公式如下:
[0030]
平均芽增殖倍数=(总分化芽数/接种数)/3,
[0031]
平均芽长度=(所有芽长度之和/总分化芽数)/3,
[0032]
平均未白化率=(未出现白化现象的瓶数/接种瓶数)/3,
[0033]
平均未玻璃化率=(未出现玻璃苗现象的瓶数/接种瓶数)/3。
[0034]
进一步,不同生根培养基对乌奴龙胆生根影响计算的过程中,须计算3次重复实验各处理组的平均生根数、平均根长度、平均根健康率和平均生根率,具体公式如下:
[0035]
平均生根数=(总生根数/接种瓶数)/3,
[0036]
平均根长度=(所有根长度之和/总生根数)/3,
[0037]
平均根健康率=(健康颜色根数/总生根数)/3,
[0038]
平均生根率=(生根瓶数/接种瓶数)/3。
[0039]
进一步,所述培养基培养条件分白天、夜晚两个时段,白天温度22
±
2℃,光照强度1000-1500lx,夜晚温度8
±
2℃,无光照,外植体消毒实验培养30d,不定芽诱导分化实验培养30d,生根培养实验培养60d。
[0040]
与现有技术相比,本技术的技术方案具备以下有益效果:
[0041]
该乌奴龙胆植株组培快繁的计算方法,利用植物组织培养技术,有效提高了组培
过程中,不定芽增殖倍数和生根率,建立了乌奴龙胆的组培快繁体系,有效提高了乌奴龙胆组培过程中,不定芽增殖倍数和生根率,采用乌奴龙胆植株进行组培快繁实验,重点探讨不同外植体不同hgcl2溶液消毒时间的消毒效果、不同不定芽诱导分化培养基的诱导效果以及不同生根培养基的生根效果,总结出了一套适合乌奴龙胆的组培方式,建立了其组培快繁体系,达到了充实市场需求和减缓野生资源保护压力的目的。
附图说明
[0042]
图1为本发明结构示意图;
[0043]
图2为本发明结构示意图。
具体实施方式
[0044]
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
[0045]
请参阅图1-2,本实施例中的一种乌奴龙胆植株组培快繁的计算方法,包括以下步骤:
[0046]
s1:合适外植体筛选;
[0047]
s2:hgcl2溶液最佳消毒时间筛选;
[0048]
s3:最佳不定芽诱导分化培养基筛选;
[0049]
s4;最佳生根培养基筛选。
[0050]
需要说明的是,初始培养基用于外植体消毒实验,配方为:ms 0.1g/l肌醇 30g/l蔗糖 5g/l琼脂粉(ph5.6)。
[0051]
其中,所述和消毒时间筛选的过程中,具体步骤如下:
[0052]
1)切取健壮且无病虫害的乌奴龙胆植株带节茎段(0.5~1cm)和叶片块(0.5~1cm2)作为外植体,用自来水把外植体表面污渍冲洗干净;
[0053]
2)然后用肥皂水清洗外植体3~5min,再用自来水反复将肥皂水残液冲洗干净,置于超净工作台上;
[0054]
3)接着用75%酒精清洗外植体15s,再用无菌水振荡清洗3次,每次不低于1min,最后将外植体放入hgcl2溶液中分别消毒2、4、6、8、10min,再用无菌水振荡清洗3次,每次不低于1min。
[0055]
其中,所述外植体和消毒时间筛选的过程中,外植体消毒完成后用无菌滤纸吸干表面水分,去除接触hgcl2溶液的伤口部分,接入初始培养基,两种外植体每个处理接种10瓶,每瓶1个外植体,3次重复,培养30d后统计并计算未污染率和成活率。
[0056]
其中,所述步骤s3中筛选具体步骤如下:
[0057]
1)选用成功消毒后的外植体作为实验材料,接入8种“不定芽诱导分化培养基”,每个处理接种10瓶,每瓶1个外植体,3次重复;
[0058]
2)培养30d后统计并计算愈伤组织出愈情况、芽的增殖倍数、芽的平均长度、未白化率和未玻璃化率。
[0059]
不定芽诱导分化培养基选用ms作为基础培养基,附加0.1g/l肌醇、30g/l蔗糖和5g/l琼脂粉,再添加不同浓度的6-ba和iaa,共设7个处理组和1个对照组,配方设计见表1:
[0060]
表1不定芽诱导分化培养基配方
[0061][0062]
其中,所述步骤s4生根培养基筛选的过程中,具体步骤如下:
[0063]
1)经过诱导分化形成的丛生芽,待其发育成2~3cm丛生苗,具有2~3片叶片时,转接入8种“生根培养基”,每个处理接种10瓶,每瓶1株苗,3次重复。
[0064]
2)培养60d后统计并计算平均生根数、平均根长度、平均根健康率和平均生根率。
[0065]
生根培养基选用1/2ms培养基作为基础培养基,附加0.1g/l肌醇、30g/l蔗糖和5g/l琼脂粉,再添加不同浓度的naa和iba,共设7个处理组和1个对照组,配方设计见表2:
[0066]
表2生根培养基配方
[0067]
[0068]
其中,所述实验结果数据结合3次重复实验各指标的平均值,采用模糊隶属函数法对不同消毒时间、不同不定芽诱导分化培养基、不同生根培养基的效果进行综合评价,先计算出某一指标的隶属函数值,然后再计算出每个处理的平均隶属函数值,其计算方程为:
[0069]uij
=(x
ij-x
jmin
)/(x
jmax-x
jmin
),
[0070][0071]
公式中,u
ij
为i处理j指标的隶属函数值,x
ij
为i处理j指标的值,x
jmax
为所有处理中此指标的最大值,x
jmin
为所有处理中此指标的最小值,ui为i处理各指标的平均隶属函数值,n为指标数。
[0072]
其中,所述不同乌奴龙胆外植体及不同消毒时间的消毒效果计算的过程中,须计算3次重复实验各处理组外植体的平均未污染率和平均成活率,具体计算方法如下:
[0073]
平均未污染率=(未出现污染现象的瓶数/接种瓶数
×
100%)/3,
[0074]
平均成活率=(成活数/接种数
×
100%)/3。
[0075]
表3不同消毒时间外植体的消毒结果
[0076][0077]
由表3可知,平均未污染率与hgcl2溶液消毒时间呈正相关;带节茎段作为外植体的平均成活率与hgcl2溶液消毒时间呈负相关;叶片块作为外植体,所有处理的平均成活率都为0.00%。由此可见,消毒时间越长,污染数越少,但毒害也越大;乌奴龙胆叶片块不适合用作外植体消毒实验的材料。单因素方差分析和多重比较表明,带节茎段不同处理组间的平均未污染率(p=0.000<0.05)和平均成活率(p=0.000<0.05)呈现显著差异;叶片块不同处理组间的平均未污染率(p=0.000<0.05)呈现显著差异。
[0078]
注:不同小写字母表示不同处理间存在显著差异(p<0.05),下同。
[0079]
表4不同消毒时间带节茎段消毒结果指标隶属函数值
[0080]
处理时间(min)ui平均未污染率ui平均成活率ui20.001.000.5040.240.810.5260.680.690.6980.840.270.55101.000.000.50
[0081]
基于hgcl2溶液不同消毒时间带节茎段的平均未污染率和平均成活率,计算平均隶属函数值,对不同消毒时间的消毒效果进行综合评价,见表4,可知u
6min
>u
8min
>u
4min
>u
10min
=u
2min
,结果表明,综合各因素,带节茎段作为外植体的最佳消毒时间为6min。
[0082]
其中,选用成功消毒后的带节茎段作为实验材料,进行不定芽诱导增殖实验须计算3次重复实验各处理组的平均芽增殖倍数、平均芽长度、平均未白化率和平均未玻璃化率,具体公式如下:
[0083]
平均芽增殖倍数=(总分化芽数/接种数)/3,
[0084]
平均芽长度=(所有芽长度之和/总分化芽数)/3,
[0085]
平均未白化率=(未出现白化现象的瓶数/接种瓶数)/3,
[0086]
平均未玻璃化率=(未出现玻璃苗现象的瓶数/接种瓶数)/3。
[0087]
表5不同诱导分化培养基对不定芽诱导增殖的景影响
[0088][0089]
由表5可知,6-ba对芽有明显的增殖效果,并且2.0mg/l6-ba的效果要强于1.0mg/l6-ba;iaa对芽的增长有明显的效果,并且2.0mg/liaa的效果要强于1.0mg/liaa;随着添加
的激素总浓度的提高,出现白化现象和玻璃苗的情况有不同程度的增多。单因素方差分析和多重比较表明,不同处理组间的平均芽增殖倍数(p=0.000<0.05)、平均芽长度(p=0.000<0.05)和平均未玻璃化率(p=0.028<0.05)呈现显著差异,平均未白化率(p=0.057<0.05)差异不显著。
[0090]
实验过程中,各处理组均未发现愈伤组织的形成。
[0091]
表6不同不定芽诱导分化培养基处理结果指标隶属函数值
[0092][0093]
基于各处理组的平均芽增殖倍数、平均芽长度和平均未玻璃化率,计算平均隶属函数值,对不同不定芽诱导分化培养基的效果进行综合评价,见表6,由于各处理组间的平均未白化率差异不显著,所以该指标不加入计算分析,结果表明,u
p7
>u
p6
>u
p5
>u
p1
>u
p2
>u
p3
>u
p0
>u
p4
,综合各因素,p7处理组(ms 0.1g/l肌醇 30g/l蔗糖 5g/l琼脂粉 2.0mg/l6-ba 1.0mg/liaa)为最佳不定芽诱导分化培养基。
[0094]
其中,不同生根培养基对乌奴龙胆生根影响计算的过程中,须计算3次重复实验各处理组的平均生根数、平均根长度、平均根健康率和平均生根率,具体公式如下:
[0095]
平均生根数=(总生根数/接种瓶数)/3,
[0096]
平均根长度=(所有根长度之和/总生根数)/3,
[0097]
平均根健康率=(健康颜色根数/总生根数)/3,
[0098]
平均生根率=(生根瓶数/接种瓶数)/3。
[0099]
表7不同生根培养基对乌奴龙胆生根的影响
[0100][0101]
由表7可知,除ck外,其他各处理组的平均生根率均为100%;naa和iba都对乌奴龙胆生根有明显的促进作用,且naa效果更佳;0.5mg/lnaa促进生根作用要强于0.3mg/lnaa;iba对根的增长有明显促进作用,且0.5mg/liba效果要强于0.3mg/liba;随着添加的激素总浓度的提高,根的颜色出现不健康的情况有不同程度的增多,单因素方差分析和多重比较表明,不同处理组间的平均生根数(p=0.000<0.05)、平均根长度(p=0.000<0.05)和平均根健康率(p=0.000<0.05)呈现显著差异。
[0102]
表8不同生根培养基处理结果指标隶属函数值
[0103]
处理组ui平均生根数ui平均根长度ui平均根健康率uit00.000.000.080.03t10.750.440.000.40t21.000.470.740.74t30.500.680.150.44t40.470.930.580.66t50.780.851.000.88t60.731.000.500.74t70.960.760.320.68
[0104]
基于各处理组的平均生根数、平均根长度和平均根健康率,计算平均隶属函数值,对不同生根培养基的生根效果进行综合评价,见表8,可知u
t5
>u
t6
=u
t2
>u
t7
>u
t4
>u
t3
>u
t1
>u
t0
,综合各因素,t5处理组(1/2ms 0.1g/l肌醇 30g/l蔗糖 5g/l琼脂粉 0.3mg/lnaa
0.3mg/liba)为最佳生根培养基,
[0105]
其中,所述培养基培养条件分白天、夜晚两个时段,白天温度22
±
2℃,光照强度1000-1500lx,夜晚温度8
±
2℃,无光照,外植体消毒实验培养30d,不定芽诱导分化实验培养30d,生根培养实验培养60d。
[0106]
图2中,注:a.带节茎段消毒,b.不定芽诱导培养白化现象,c.不定芽诱导培养玻璃苗,d.生根培养,e.扩繁情况。
[0107]
本研究切取乌奴龙胆的带节茎段和叶片块作为外植体,采用hgcl2溶液设计出不同时间梯度,进行消毒实验;之后设计出7种不定芽诱导分化培养基和7种生根培养基对乌奴龙胆进行诱导生芽和生根实验,实验结果表明,带节茎段适合作为乌奴龙胆组培实验中的外植体,叶片块不适合作为外植体;hgcl2溶液最佳消毒时间为6min;最佳不定芽诱导分化培养基为:p7处理组(ms 0.1g/l肌醇 30g/l蔗糖 5g/l琼脂粉 2.0mg/l6-ba 1.0mg/liaa);最佳生根培养基为:t5处理组(1/2ms 0.1g/l肌醇 30g/l蔗糖 5g/l琼脂粉 0.3mg/lnaa 0.3mg/liba)。
[0108]
乌奴龙胆的生根能力较强,在所有的生根培养基中生根率均达到了100%,且在实验过程中还发现在生根培养基(ck)和不定芽诱导分化培养基中亦有部分丛生苗生长出根,但是在添加不同浓度的naa和iba后,乌奴龙胆的生根数量和根长度有显著差异,其中naa能明显促进乌奴龙胆生根,iba能明显促进乌奴龙胆根的增长,与此同时,随着添加的激素总浓度升高,乌奴龙胆根的颜色出现不健康的情况也有不同程度的增多,在不定芽诱导增殖实验中同样有类似现象产生。
[0109]
根据植物细胞的全能性,理论上任何完整的植物细胞都有形成新的完整植株的潜力,但是在实践中发现,不同器官的发育能力各不相同,在龙胆属植物的组织培养中,钟世浚利用红花龙胆带节茎段成功得到了丛生苗,本研究中,乌奴龙胆叶片块进行消毒处理后全部褐化死亡,不适合作为乌奴龙胆组培外植体,这与钟世浚的实验结果相似,查阅更多文献后发现,目前对龙胆属植物的组培研究中,很少出现采用叶片外植体获得丛生苗的,这也许与龙胆属植物叶片中含有较多黄酮类物质而容易氧化导致褐化有关。
[0110]
植物组织培养是离体的组织,器官,经细胞脱分化形成愈伤组织,再分化形成芽、根,最终发育为完整植株的过程,本研究在进行不定芽诱导增殖实验过程中,各处理组均未发现愈伤组织的形成,但直接长出了不定芽,分析原因可能如下:1)培养基激素浓度配比或培养条件不适合乌奴龙胆带节茎段愈伤组织的形成;2)乌奴龙胆带节茎段不太容易形成愈伤组织,但是可以从节上长出腋芽(不定芽),从而跳过了形成愈伤组织这一过程。
[0111]
上述实施例的有益效果为:利用植物组织培养技术,有效提高了组培过程中,不定芽增殖倍数和生根率,建立了乌奴龙胆的组培快繁体系,有效提高了乌奴龙胆组培过程中,不定芽增殖倍数和生根率,采用乌奴龙胆植株进行组培快繁实验,重点探讨不同外植体不同hgcl2溶液消毒时间的消毒效果、不同不定芽诱导分化培养基的诱导效果以及不同生根培养基的生根效果,总结出了一套适合乌奴龙胆的组培方式,建立了其组培快繁体系,达到了充实市场需求和减缓野生资源保护压力的目的。
[0112]
需要说明的是,在本文中,诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来,而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且,术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖
非排他性的包含,从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素,而且还包括没有明确列出的其他要素,或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下,由语句“包括一个
……”
限定的要素,并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
[0113]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,对于本领域的普通技术人员而言,可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型。
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