1.本发明涉及蔷薇的繁殖技术，具体涉及一种单叶蔷薇异位快速繁殖保存的方法。
背景技术：
2.单叶蔷薇(rosa persica)是蔷薇科蔷薇属单叶蔷薇亚属下的唯一种，分布于中亚的干旱及半干旱地区。在我国，仅在新疆的部分地区有分布，因此对干旱胁迫具有优秀的耐受性(冯久莹,蔡蕾,贺海洋,沈树祥,张树玲,孟永禄,戴凡炜,许正,高俊平.新疆14种野生蔷薇属植物生境调查[j].林业科学,2014,50(11):44-51.)；并且其花瓣为基部带紫色斑点的黄色花瓣，具有优秀且独特的观赏价值(惠俊爱,张霞,王绍明.新疆野生单叶蔷薇生物学特性分析[j].山东林业科技,2013,43(04):61-63.)。
[0003]
单叶蔷薇在自然条件下可以结种，但由于环境限制，未见其正常萌发生长为实生苗，因此其在自然界中主要依靠地下茎进行无性繁殖。单叶蔷薇利用地上茎、芽或吸根繁殖未见成功(h.he,y.ueda,t.kurosawa,s.ogawa,e.nishino,b.wang and k.liao，morphological character and germination in achenes of rosa persica michx,以色列国际园艺大会发表,2000,1-6)。现有技术中，利用野外挖取的单叶蔷薇健壮地下茎作为外植体进行扦插实验，试验了不同激素配比及基质种类的组合，证明影响单叶蔷薇扦插成活的主要因素是基质种类，最佳扦插基质为锯末，扦插成活率最高为90％，进行了发芽实验，种子发芽率约为45％，使用0.5mg/l的6-ba浸泡处理种子后，发芽率为80％(朱金启.单叶蔷薇生殖生物学及其繁殖方法研究[d].新疆农业大学,2003.)。但是，挖取单叶蔷薇的地下茎会对野生种群造成破坏，且离体的地下茎无法长距离运输；而种子繁殖受种子成熟度及种子数量的限制，又有繁殖效率低的缺陷。因此目前，单叶蔷薇种质资源的保存方式以采挖野生植株建立资源圃为主要途径，亟需一种不受地域限制同时可以大量繁殖单叶蔷薇种苗的方法。
[0004]
组织培养技术被广泛应用于植物的繁殖与保存，该技术也在现代月季的快繁中广泛应用。但是，单叶蔷薇作为一种特殊的野生种质资源，其研究尚不深入，没有其快繁技术的相关报道。同时，由于其单独位于单叶蔷薇亚属，与其他蔷薇属植物亲缘关系较远，其他蔷薇属植物的快繁体系并不完全适用于该植物。因此，开发单叶蔷薇的组织培养异位快速繁殖体系，对单叶蔷薇的迁地保护及优异种质资源的利用具有重要意义。
技术实现要素：
[0005]
发明目的：针对上述现有技术，本发明提供一种单叶蔷薇异位快速繁殖保存的方法。
[0006]
本发明还提供一种单叶蔷薇异位快速繁殖保存的方法在单叶蔷薇异位快速繁殖保存中的应用。
[0007]
技术方案：本发明所述的一种单叶蔷薇异位快速繁殖保存的方法，包括以下步骤：
[0008]
(1)采集当年成熟的单叶蔷薇果实，剥取其中的种子，晾干、消化、浸泡、消毒、冲洗
后备用；
[0009]
(2)将步骤(1)得到的单叶蔷薇种子接种在初代培养基上，种子萌发形成小苗备用；
[0010]
(3)将步骤(2)得到的小苗切分成茎段，接种到增殖培养基上增殖培养；
[0011]
(4)将步骤(3)得到的单叶蔷薇丛生芽接种在壮苗培养基上壮苗培养，后进行生根培养；
[0012]
(5)将步骤(4)得到的无菌苗洗去根部培养基后，种植在蛭石中进行练苗，待小苗长出新叶片则练苗完成；
[0013]
(6)将步骤(5)得到的小苗定植在营养钵中，进行正常养护。
[0014]
其中，步骤(1)中所述晾干消化是：将剥取的种子置于通风阴凉处晾干，避免太阳暴晒，使用浓硫酸浸泡单叶蔷薇种子并搅拌20-30min，使其种子外表皮厚度降低，种子消化后用水冲洗，洗净种子表面硫酸，消化工作在通风橱中进行。
[0015]
进一步地，所述步骤(1)-步骤(6)中培养环境均为在24
±
1℃，光照250μmol
·
m-2
·
s-1
，光照周期为16h/d光照、8h/d黑暗下培养10-30天。
[0016]
进一步地，步骤(1)中所述浸泡消毒是指：将种子用无菌水浸泡24h，使种皮充分吸胀，用体积分数为75％的乙醇溶液将浸泡后的种子消毒1-2min，接着用有效氯浓度为1％的次氯酸钠溶液消毒15-20min，之后用无菌水冲洗3次，消毒操作在超净工作台中进行。
[0017]
进一步地，步骤(2)中所述初代培养基为ms培养基 蔗糖30g/l 琼脂7.5g/l，ph 5.8-6.0。
[0018]
进一步地，步骤(3)中所述增殖培养基为ms培养基 6-ba0.5-1.0mg/l naa 0.01-0.1mg/l 蔗糖30g/l 琼脂7.5g/l，ph 5.8-6.0。
[0019]
作为优选，步骤(3)中所述增殖培养基为ms培养基 6-ba 1.0mg/l naa 0.1mg/l 蔗糖30g/l 琼脂7.5g/l，ph 5.8-6.0。
[0020]
进一步地，步骤(3)中所述壮苗培养基为ms培养基 6-ba0.5-1.0mg/l naa 0.01-0.1mg/l 蔗糖30g/l 琼脂7.5g/l，ph 5.8-6.0。
[0021]
作为优选，步骤(3)中所述壮苗培养基为ms培养基 6-ba 0.5mg/l naa 0.01mg/l 蔗糖30g/l 琼脂7.5g/l，ph 5.8-6.0。
[0022]
进一步地，步骤(4)中所述生根培养基为1/2ms培养基 蔗糖30g/l 琼脂7.5g/l，ph 5.8-6.0。
[0023]
进一步地，步骤(6)营养钵为泥炭土和珍珠岩的混合物质，混合比例为1-1.5：1。
[0024]
本发明所述的单叶蔷薇异位快速繁殖保存的方法在单叶蔷薇异位快速繁殖保存中的应用。
[0025]
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：
[0026]
(1)本发明首创了单叶蔷薇的组织培养快速异位繁殖技术，与原有单叶蔷薇分株、籽播的繁殖方法相比，大幅提高了单叶蔷薇的繁殖效率并缩短了繁殖周期。
[0027]
(2)由于单叶蔷薇枝条扦插难以成活，且枝条及地下茎等营养繁殖器官长距离运输难以保持活性，因此其不适合作为异地保存的外植体。一般使用种子进行异地保存，同时，由种子萌发的单叶蔷薇幼苗的刺很细密，难以消毒，以实生苗枝条作为外植体污染率很高，分化率很低。因此，与其他蔷薇属植物一般采用枝条作为外植体相比，本发明采用单叶
蔷薇的种子作为外植体，解决了单叶蔷薇外植体污染率高的问题。同时，与种植实生苗相比，组培苗生长更加旺盛、分枝更多。
[0028]
(3)本发明可以实现单叶蔷薇的异地保存，打破了由于单叶蔷薇繁殖方式的限制，导致一直无法在新疆之外的地区保存的问题。而本发明通过在新疆采取单叶蔷薇种子，可以在全国各地进行组织培养快速繁殖，突破了种质资源利用的地区限制，能更好的发挥其在育种上的作用。
附图说明
[0029]
图1为单叶蔷薇经过种子消化后的不同播种方式，其中a为无菌播种，b为土壤播种；
[0030]
图2为不同浓度的6-ba与naa继代培养时y1、y2单叶蔷薇增殖情况，其中a、b、c分别为表型、增殖系数和平均株高；
[0031]
图3为单叶蔷薇生根培养；
[0032]
图4为单叶蔷薇定植成苗，a为单叶蔷薇组培苗，b为单叶蔷薇实生苗。
具体实施方式
[0033]
实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0034]
实施例1
[0035]
不同播种方式对单叶蔷薇种子萌发的影响：
[0036]
(1)于当年9月份在单叶蔷薇原产地采取成熟的单叶蔷薇果实，种子采集地为新疆312国道昌吉辖区，果实经晾干后可以长时间储存或远距离运输。剥开果皮取出种子，经过水选去除漂浮在水面上的干瘪种子。将种子在阴凉通风处晾干备用。
[0037]
(2)单叶蔷薇的种皮的机械阻力可能是影响其发芽的主要障碍，因此使用质量分数为98％的浓硫酸消化种子，以消除种皮的机械阻力。具体消化方法为：将剥取的种子置于通风阴凉处晾干，避免太阳暴晒，取100粒干燥的种子，置于20ml浓硫酸中，持续搅拌20-30min，，使其种子外表皮厚度降低，之后用大量清水冲洗，洗净种子表面的浓硫酸。
[0038]
分别将消化过及未消化的种子在清水中浸泡24h，使种子表皮充分吸胀。
[0039]
(3)土壤播种：将种皮吸胀后的消化及未消化的种子分别播种在泥炭土：珍珠岩＝1:1的基质中，每10天浇透水，环境温度为24
±
1℃，光照250μmol
·
m-2
·
s-1
，光照周期为16h/d光照。统计其发芽高峰时间、发芽率及最终存活率。
[0040]
(4)无菌播种：在超净工作台中，将种皮吸胀后的消化及未消化的种子分别浸泡在体积分数为75％的乙醇溶液中1-2min，之后浸泡在有效氯浓度1％的次氯酸钠溶液中消毒15-20min，消毒完成后用无菌水冲洗3次，去除种子表面的消毒剂，接种在初代培养基上，放置在环境温度24
±
1℃，光照250μmol
·
m-2
·
s-1
，光照周期为16h/d光照、8h/d黑暗下培养30天，其中，所述初代培养基配方为：ms培养基 蔗糖30g/l 琼脂7.5g/l，ph＝5.8-6.0。统计其发芽高峰时间、发芽率及最终存活率。
[0041]
(5)发芽实验显示，经浓硫酸消化后，无论在土壤播种还是无菌播种条件下发芽率都显著提高，且发芽高峰时间显著提前。表明种皮的机械阻力是抑制种子发芽的重要因素。
单叶蔷薇种子发芽后，有一定比例的幼苗发育失败；实验结果显示消化后的单叶蔷薇种子经无菌播种后其最终成活率最高。图1a为种子消化后单叶蔷薇无菌播种苗，图1b为种子消化后土壤播种苗，由表1可知，消化后的种子经过无菌播种发芽率和成活率显著高于未消化播种。
[0042]
(6)同时，如果使用单叶蔷薇实生苗枝条作为外植体，需要至少培养两个月；并且其枝条表面密布小刺，消毒困难，污染率接近100％。综上所述，种子经浓硫酸消化后无菌播种为获取单叶蔷薇无菌外植体的最佳方案。
[0043]
表1：单叶蔷薇种子发芽实验统计表
[0044][0045]
实施例2
[0046]
不同浓度6-ba、naa对单叶蔷薇增殖的影响。
[0047]
(1)将实施例1中初代培养的单叶蔷薇无菌苗培养20-30天，生长至约10片真叶，可以作为增殖培养的外植体。
[0048]
(2)将步骤(1)中的实生苗切除叶片，并切割为包含两个侧芽的茎段，接种在增殖培养基上。增殖培养基为在ms基础盐培养基上附加不同浓度的6-ba与naa(如表2所示)，蔗糖含量均为30g/l，琼脂含量均为7.5g/l，ph为5.8-6.0，培养环境条件与实施例1初代培养条件相同，培养30天后对单叶蔷薇无菌苗增殖系数、平均株高和外植体状态进行统计。
[0049]
表2：增殖培养实验统计表
[0050][0051]
(3)如表2所示，在未添加naa的培养基(y0)中，外植体的分化率非常低，同时不定芽长势弱；最适的6-ba浓度为0.5-1mg/l，naa浓度为0.01-0.1mg/l，此种培养基(y1，y2)下增殖系数和平均株高综合处于最理想状态，产生适量的愈伤组织，能保持旺盛的分化。而随着6-ba和naa的浓度继续升高，产生过量的愈伤组织，反而造成增殖系数增加不明显，同时产生的不定芽出现玻璃化现象，无法进行壮苗生根。因此，y1、y2为最适的增殖培养基。如图2所示为单叶蔷薇在y1、y2培养基上的表型及增殖系数、平均株高的统计数据，以及组培苗在两种培养基上的生长特性不同，可以使用y2培养基进行增殖培养，之后用y1培养基进行初步的壮苗培养，培养条件和环境保持不变，更有利于之后的生根培养。
[0052]
实施例3：
[0053]
不同浓度naa对单叶蔷薇生根的影响
[0054]
表3为在1/2ms基础盐培养基附加30g/l蔗糖，琼脂7.5g/l，ph5.8-6.0的基础上附加不同浓度的naa，培养条件与实施例1初代培养相同，培养30天后对单叶蔷薇不定芽生根的影响。在不加naa时，无菌苗具有最长的平均根长和最高的平均株高。而附加naa后，虽然平均根数增加，但平均根长和株高均显著下降。因此，g0为最适的生根培养基。
[0055]
表3：生根培养实验统计表
[0056][0057]
实施例4：
[0058]
单叶蔷薇练苗及移栽
[0059]
在g0培养基上生根培养20-30天后，单叶蔷薇组培苗生根，株高进一步增加，并且叶片更加平展，如图3所示，此时即可进行练苗移栽。
[0060]
将生根的无菌苗用清水洗去根部培养基后，种植在颗粒度为2-4mm的蛭石中，使用含有1/2ms基础盐培养基的自来水浇透栽培基质，之后盖上透明塑料盖保湿，并打开透气孔，置于日光温室中培养，维持温室气温在24
±
1℃，培养10-20天，进行练苗，待小苗长出新叶片则练苗成功。练苗后将单叶蔷薇小苗定植在泥炭土：珍珠岩为1：1的营养钵中，进行正常养护，如图4所示，生根后的单叶蔷薇组培苗经练苗移栽即可实现单叶蔷薇的异位繁殖保存，组培苗定植或实施例1所述种子消化后土壤播种的实生苗萌发60天后，观察两种苗的生长状况，a为单叶蔷薇组培苗、b为单叶蔷薇实生苗，结果表明单叶蔷薇组培苗生长更加旺盛、分枝更多。