抗癌肽的纳米颗粒及其用途
发明领域
1.本发明涉及抗癌肽(acp)的纳米颗粒，其可以用于治疗癌症。
2.发明背景
3.肿瘤在细胞水平是异质性的，由一系列不同亚型的癌细胞组成。在这些亚型中，癌症干细胞(csc)越来越被认为是使用目前抗癌药物的传统药物治疗的主要困难。乳腺癌是世界范围第二常见的癌症，并且主要发生于女性中。几项研究表明，乳腺癌症干细胞可能会发展出对常规抗癌药物的耐药性，从而存活、自我更新、分化和复发
1-6
。csc容易进化出对抗癌药物的耐药性，并且实体瘤的化疗治疗通常会导致患者中耐药性csc的比例显著增加。这可能导致复发和转移的形成。此外，同一患者体内的乳腺肿瘤可能不同，并且常规抗癌药物可能会失败。
7-9
用较高剂量治疗很困难，因为常用的抗癌药物(诸如多柔比星)通常对健康组织具有较高的毒性，对诸如肝、肾和心脏的器官造成急性损伤。
10-12
因此，对于开发出对癌细胞具有改进的选择性、在足以杀伤实体瘤中所有主体癌症(bulk cancer)和csc的剂量不伤害健康组织的新的抗癌药物存在迫切、未满足的需要。
4.膜裂解肽是化疗药物的有前景的抗癌治疗替代物，化疗药物通常对非癌细胞具有细胞毒性，并倾向于通过应激引起的诱变而引起耐药性
1-6
。尽管对膜裂解肽用于抗微生物应用的治疗效用进行了持续的研究工作
13-15
，但其成功作为抗癌治疗剂的递送方法仍需改进。这里，本技术的发明人展示了有效的、选择性的抗癌肽在纳米颗粒中的有效包封，其具有高耐受性并导致有效的肿瘤生长抑制或根除。已表明纳米颗粒显著改进了货物肽(cargo peptide)的抗癌活性，同时降低了货物肽的毒性。这不同于小分子纳米颗粒，诸如fda批准的用于多柔比星的载体虽然减少了副作用，但并未改进化疗货物(多柔比星)的整体抗癌功效。本技术的发明人的工作展示了一种新的膜裂解肽递送系统，在抗癌竞赛中开辟了一条新的通道。
5.发明概述
6.在本发明的第一方面，提供了一种纳米颗粒，所述纳米颗粒包含一种或更多种肽，所述肽具有包含基序gllxllxlllxaag的序列，其中每个x独立地选自精氨酸(r)、组氨酸(h)、赖氨酸(k)、天冬氨酸(d)或谷氨酸(e)。
7.本技术的发明人令人惊讶地发现，符合所要求保护的式的肽家族对癌细胞具有改进的选择性，在足以杀伤实体瘤中所有主体癌症和csc的剂量不伤害健康组织。与许多常规抗癌药物不同，这里开发的形成孔的膜活性肽靶向并破坏质膜以杀伤癌细胞。这消除了必须将药物转运到细胞质中的复杂性，并因此与传统化疗剂相比，该肽具有改进的肿瘤渗透。本技术所要求保护的肽通过以下来发挥作用：选择性靶向癌细胞的质膜并在其中形成孔，从而通过使癌细胞的电化学梯度短路来杀伤癌细胞。不希望受理论束缚，认为肽直接靶向癌细胞膜的脂质组成和化学微环境。因此，这些肽引起耐药性的可能性要小得多(类似于细胞难以对去污剂产生耐药性)，因为肿瘤细胞难以改变其脂质组成。
16-18
8.几种公开的肽针对主体癌症和csc具有纳摩尔活性，与目前批准的抗癌药物诸如盐霉素相当。此外，在目前最好的体外乳腺癌模型之一(通过使细胞生长成球形团块来模拟
实际实体瘤的乳腺球(mammosphere)模型)中，本文公开的几种肽表现出针对癌细胞的优异活性，同时对正常健康细胞保持减少的毒性。
9.这些肽以l氨基酸形式和d氨基酸形式两者均有效(后者具有体内抗蛋白酶降解的稳定性的主要优势)，以非常低的微摩尔浓度并且在一些情况下以纳摩尔浓度选择性地消除二维生长的癌细胞，以及三维(球状)癌细胞培养物。需要3倍至》200倍高的浓度才能伤害非癌性人类乳腺和肾细胞。
10.这些肽便宜且合成简单，易于修饰和高通量筛选，并提供了特异性靶向癌细胞的化学和结构库(repertoire)。
11.本技术所要求保护的肽是从头设计的，并且通过与现有肽数据库的比较证实没有已知的天然类似物。这种类型的短的柔性肽将具有低免疫原性，并因此适用于药物应用。
12.如本文所述，术语“肽”是指任何包含通过肽键或修饰的肽键(即肽等排物)彼此连接的氨基酸的肽。肽通常包含天然存在的氨基酸，但也可以包括通过天然加工(诸如翻译后加工)或化学修饰技术修饰的氨基酸序列，这在本领域是熟知的。这样的修饰在基础教科书中有很好的描述。修饰可以发生在肽中任何位置，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基末端或羧基末端。应当理解，相同类型的修饰可以以相同或不同的程度存在于给定的肽的若干位点处。此外，给定的肽可以包含许多类型的修饰。
13.优选地，肽是分离的肽。术语“分离的”意指将肽从其原始环境中取出。例如，存在于活体动物中的肽不是分离的，但与自然系统中的一些或所有共存物质分开的相同的肽或这样的肽的片段是分离的。这样的肽可以是载体的一部分和/或这样的肽可以是组合物的一部分，并且仍然是分离的，因为这样的载体或组合物不是其天然环境的一部分。
14.将一种或更多种肽装载到纳米颗粒上或装载到纳米颗粒中。优选地，纳米颗粒包含多于一种肽。已经发现，使用纳米颗粒递送肽产生了令人惊讶的好结果。认为由纳米颗粒提供的局部递送允许肽更有效地在癌细胞的细胞膜中形成孔，并从而引起对癌细胞更有效的杀伤。
15.术语纳米颗粒是指直径为约1nm至约200nm的颗粒。优选地纳米颗粒的直径为约5nm至约100nm，约10nm至约50nm，并且甚至更优选地约20nm。
16.肽向纳米颗粒中的装载可以通过吸附或包封来进行。这样的技术是本领域技术人员熟知的。
17.优选地纳米颗粒是可生物降解的。优选地纳米颗粒是聚合物。可以形成一些所公开的纳米颗粒的合适聚合物可以包括但不限于可生物降解的α-羟基聚酯和生物相容性聚醚。在一些方面，示例性聚酯包括例如pla、plga、peg、peo、peg化聚合物以及丙交酯和乙交酯的共聚物(例如peg化pla、peg化pga、peg化plga)及其衍生物。在其他方面，合适的聚合物包括例如聚酸酐、聚(原酸酯)、peg化聚(原酸酯)、聚(己内酯)、peg化聚(己内酯)、聚赖氨酸、peg化聚赖氨酸、聚(乙烯亚胺)、peg化聚(乙烯亚胺)、聚(l-丙交酯-共-l-赖氨酸)、聚(丝氨酸酯)、聚(4-羟基-l-脯氨酸酯)、聚[a-(4-氨基丁基)-l-乙醇酸]及其组合和衍生物。在特别优选的实施方案中，纳米颗粒包含聚乙二醇甲醚聚丙交酯-共-乙交酯(peg-plga)。
[0018]
在其他方面，聚合物基质可以包含一种或更多种丙烯酸聚合物。示例性丙烯酸聚合物包括例如丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙酯、甲基丙烯酸氰乙酯、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、甲基
丙烯酸烷基酰胺共聚物、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸聚丙烯酰胺)共聚物、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚物、聚氰基丙烯酸酯及其组合。基质可以包含右旋糖酐、酰化右旋糖酐、壳聚糖(例如，乙酰化至不同水平)、聚乙烯醇(例如，水解至不同程度)和/或海藻酸盐，例如与二价阳离子复合的海藻酸盐，诸如海藻酸钙复合物。
[0019]
本文公开的纳米颗粒可以包含一种、两种、三种或更多种生物相容性和/或可生物降解的聚合物。例如，设想的纳米颗粒可以包含约10至约99重量百分比的一种或更多种嵌段共聚物，所述嵌段共聚物包含可生物降解的聚合物和聚乙二醇，以及约0至约50重量百分比的可生物降解的均聚物。示例性纳米颗粒可以包含约40至约90重量百分比的聚(乳)酸-聚乙二醇共聚物或约40至约80重量百分比的聚(乳)酸-聚乙二醇共聚物。这样的聚(乳)酸-嵌段-聚乙二醇共聚物可以包含具有约5kda至100kda的数均分子量的聚(乳酸)和具有约2kda至约10kda(例如，约4kda至约6kda)的数均分子量的聚乙二醇。例如，所公开的治疗性纳米颗粒可以包含约70至约99重量百分比的pla-peg和约1至约25重量百分比的活性剂(即，所公开的肽)，或约30至约50重量百分比的pla-peg、约30至约50重量百分比的pla或plga、以及约5至约25重量百分比的活性剂。这样的pla((聚)乳酸)可以具有约5kda至约10kda的数均分子量。这样的plga(聚乳酸-共-乙醇酸)可以具有约8kda至约12kda的数均分子量。应当理解，所公开的pla-peg共聚物可以在pla嵌段和peg嵌段之间包含化学接头、低聚物或聚合物链，例如，可以包括pla-接头-peg。
[0020]
最优选地，本发明的纳米颗粒包含约99重量百分比的聚(乙二醇)甲醚-嵌段-聚(丙交酯-共-乙交酯)(peg-plga；peg平均mn 5,000，plga mn7,000)和1重量百分比的活性成分(即acp)。
[0021]
可选地，可以具有缓释性质的所公开的纳米颗粒可以包含约42至约45重量百分比的pla-peg(其中例如pla约16kda，并且peg约5kda)，(例如43.25％的pla-peg)，约42至45重量百分比的pla(例如约75kda)(例如43.25％的pla/75kda)和约1至15重量百分比的活性剂。例如，所公开的纳米颗粒可以任选地包含约1至约50重量百分比的聚(乳)酸或聚(乳)酸-共-聚(乙醇)酸(其不包含peg，例如pla的均聚物)，或者可以任选地包含约1至约50重量百分比，或约10至约50重量百分比或约30至约50重量百分比的聚(乳)酸或聚(乳)酸-共-聚(乙醇)酸。在实施方案中，所公开的纳米颗粒可以包含两种聚合物，例如pla-peg和pla，其重量比为约30:60至约60:30，例如，约40:60、约60:40或约50:50。
[0022]
这样的基本上均聚的聚(乳酸)或聚(乳酸)-共-聚(乙醇酸)可以具有约2kda至约130kda(例如，约20kda至约30kda，或约100kda至约130kda)的重均分子量。这样的均聚pla可以具有约5kda至约90kda，或约5kda至约12kda，约15kda至约30kda或约60kda至约90kda的数均分子量。示例性均聚pla可以具有约8kda的数均分子量或约12kda的重均分子量。
[0023]
在某些方面，所公开的纳米颗粒可以在纳米颗粒表面上用特定密度的靶向部分优化，使得例如有效量的靶向部分与用于递送肽的纳米颗粒缔合。例如，用靶向部分官能化的可生物降解和/或生物相容的聚合物基质的部分可以小于总量的80％。根据另一实施方案，用靶向部分官能化的可生物降解和/或生物相容性聚合物基质的部分小于总量的约50％。在一些实施方案中，靶向部分的密度增加可以增加靶结合(细胞结合/靶摄取)。
[0024]
示例性靶向部分包括例如蛋白质、肽、抗体、抗体片段、糖、碳水化合物、聚糖、细胞因子、趋化因子、核苷酸、凝集素、脂质、受体、类固醇、神经递质及其组合。标志物的选择可
no:25和/或seq id no:26的序列。本技术的发明人发现这些序列对癌细胞具有特别的选择性。
[0033]
在一种实施方案中，纳米颗粒包含肽，其中该肽序列由基序gllxllxlllxaag组成。
[0034]
肽可以以d型或l型存在。在一种实施方案中，纳米颗粒包含l型肽。本技术的发明人令人惊讶地发现，这里呈现的肽在l型时对癌细胞更具选择性。
[0035]
在一种实施方案中，纳米颗粒包含形成α螺旋装配的肽。优选地肽在癌细胞膜中形成孔。据信，肽直接靶向癌细胞膜的脂质组成和化学微环境，并在其中形成孔，通过使癌细胞的电化学梯度短路来杀伤癌细胞。
[0036]
肽序列或基序的n-末端和c-末端可以是本领域技术人员已知的任何末端，并且可以包括例如nh2、nh
3
、cooh和coo-。
[0037]
本发明的第二方面涉及药学上可接受的组合物，其包含上述纳米颗粒和一种或更多种药学上可接受的赋形剂，用于治疗癌症。
[0038]
本发明的第三方面涉及药学上可接受的组合物，其包含上述纳米颗粒和一种或更多种药学上可接受的赋形剂，用于制备用于治疗癌症的药物。
[0039]
药物组合物可以包含多于一种上文公开的纳米颗粒。
[0040]
本发明的药学上可接受的组合物可以用于治疗任何类型的癌症，诸如皮肤癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、膀胱癌、淋巴瘤、肾癌、胰腺癌或子宫内膜癌。然而，在本发明的特定实施方案中，癌症是乳腺癌。
[0041]
包含纳米颗粒的药物组合物可以在人类医学和兽医医学中用于人类使用或动物使用，并且通常将包含一种或更多种合适的赋形剂。用于治疗用途的可接受的赋形剂在药学领域中是熟知的，并且在例如remington的pharmaceutical sciences,mack publishing co.(a.r.gennaro编著.1985)中描述。药物赋形剂的选择可以根据预期施用途径和标准药学实践来选择。药物组合物可以包含以下剂作为赋形剂或除了赋形剂之外包含以下剂：任何合适的粘合剂、润滑剂、助悬剂、包衣剂或增溶剂。
[0042]
防腐剂、稳定剂和染料可以提供于药物组合物中。防腐剂的实例包括苯甲酸钠、抗坏血酸和对羟基苯甲酸的酯。也可以使用抗氧化剂和助悬剂。
[0043]
药物组合物还可以包含耐受促进性佐剂(tolerance-promoting adjuvants)和/或耐受促进性细胞。耐受促进性佐剂包括il-10、重组霍乱毒素b亚基(rctb)、toll样受体2的配体，以及调节免疫应答的生物制品和单克隆抗体，诸如抗cd3和共刺激阻断剂，它们可以与肽共施用。耐受促进性细胞包括未成熟的树突状细胞和用维生素d3(1α,25-二羟基维生素d3)或其类似物处理的树突状细胞。
[0044]
当癌症被“治疗”时，这意味着癌症的一种或更多种临床表现得到改善。这并不意味着癌症的症状被完全治愈，因此它们不再存在于患者中，尽管在一些方法中，可能是这种情况。“治疗”导致癌症的一种或更多种症状比治疗前不那么严重。例如，肿瘤可以尺寸减小或完全根除。
[0045]
在本发明的一种实施方案中，组合物用于与化疗剂组合使用。本技术的发明人发现，由于本技术所要求保护的肽的形成孔的性质，这使得标准化疗剂更容易进入靶癌细胞。化疗剂可以选自环磷酰胺、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、长春瑞滨、多柔比星、多西他赛、博莱霉素、长春花碱、达卡巴嗪、莫司汀、长春新碱、丙卡巴嗪、泼尼松龙、依托泊苷、顺铂、表柔比
星、氨甲蝶呤、卡培他滨、长春瑞滨、亚叶酸、奥沙利铂及其混合物。优选地化疗剂是多柔比星。在图10中提供了将本技术的肽与化疗剂缀合的方法的一种实例。
[0046]
根据所选择的递送系统，药物组合物可能有不同的组成/配制要求。举例来说，本发明的药物组合物可以配制成肠胃外递送，其中组合物被配制成可注射形式，用于通过例如静脉内、皮内、肌肉内、皮下或腹膜内途径递送。对于肠胃外施用，组合物可能最好以无菌水性溶液的形式使用，该水性溶液可以含有其他物质，例如足够的盐或单糖以使溶液与血液等渗。皮内施用途径包括任何皮肤进入手段，例如，使用基于微针的注射和输注系统(或精确靶向皮内间隙的其他工具)、将流体或粉末无针或无针弹道注射到皮内间隙中、mantoux型皮内注射、通过微装置的增强离子电渗，以及将流体、固体或其他给药形式直接沉积到皮肤中，包括使用贴剂将组合物沉积到皮肤上。组合物也可以配制成通过口服或表面(topical)途径施用，包括经鼻、口服或表皮施用。优选地组合物被配制成通过静脉内途径递送。
[0047]
施用的药物组合物的量或剂量应当足以有效靶向体内癌细胞。剂量将由特定制剂的功效和受试者中肿瘤的位置以及待治疗受试者的体重决定。
[0048]
药物组合物的剂量也将由可能伴随特定制剂施用的任何不良副作用的存在、性质和程度来决定。通常，医师将考虑各种因素(诸如年龄、体重、一般健康状况、饮食、性别、待施用的化合物/制剂、施用途径和所治疗状况的严重程度)来决定用于治疗每个个体受试者的肽的剂量。适当的剂量可以由本领域技术人员确定。通过非限制性实施例的方式，本发明的抗癌肽的总剂量可以是约0.001mg/kg被治疗受试者的体重至约1000mg/kg被治疗受试者的体重、约0.01mg/kg体重至约100mg/kg体重、约0.1mg/kg体重至约10mg/kg体重和约0.5mg/kg体重至约5mg/kg体重。在另一实施方案中，肽的总剂量可以是约1nm至约10,000nm，优选地约10nm至约5,000nm，更优选地约100nm至约500nm的浓度。
[0049]
在优选的实施方案中，包含本发明的纳米颗粒的组合物每月至少一次施用，优选地每1周至4周一次施用，施用四次。
[0050]
本发明的第四方面涉及治疗癌症的方法，其中将本发明的药学上可接受的组合物施用至患有癌症的患者。在一种实施方案中，癌症是乳腺癌。
[0051]
本发明的第五方面涉及用于治疗癌症的药盒，其包含本发明的药学上可接受的组合物。在优选的实施方案中，药盒用于治疗乳腺癌。药盒还可以包含化疗剂。
[0052]
技术人员将理解，本发明的所有方面，无论它们涉及例如药学上可接受的组合物、肽、其用途还是治疗方法，都同样适用于本发明的所有其他方面。特别地，例如，药学上可接受的组合物的方面，可以比本发明的其他方面(例如肽本身)更详细地描述。然而，技术人员将理解，对于本发明的特定方面提供了更详细的信息，该信息通常同样适用于本发明的其他方面。
[0053]
发明详述
[0054]
现在将参考附图仅以实例的方式详细描述本发明，在附图中：
[0055]
图1示出了组合的富含亮氨酸的肽文库的设计以及与其他形成孔且靶向癌症的膜活性肽的比较。a)示出了组合肽文库序列以及其在推定的膜活性构象的螺旋轮上的映射。b)将文库肽与其他形成孔且靶向癌症的膜活性肽的等电点和疏水性进行比较。抗菌肽数据库(antimicrobial peptide database，apd)中含有26个氨基酸的肽、蜂毒肽及其类似物
(功能获得类似物和功能丧失类似物)、ph依赖性蜂毒肽和癌症靶向性低ph插入肽(phlip)。
[0056]
图2示出了目前鉴定的序列的文库的体外细胞毒性筛选结果，该文库由36种组合的针对不同的人类细胞系的肽(seq id no:1至seq id no:36)组成，所述细胞系源自癌性人类组织和健康的人类组织两者。还示出了所选择的d-型肽、以及临床上使用的抗癌药物盐霉素和多柔比星的体外细胞毒性筛选结果。评价了对不同的人类细胞系的细胞毒性，并使用对以下的半最大抑制浓度(ic
50
)来定量：a)hmler对比mcf-10a，b)hmler-shecad对比mcf-10a，c)hmler对比hmler-shecad，d)hmler对比hek293t，e)hmler-shecad对比hek293t，以及f)u2os对比hek293t。
[0057]
图3示出了两种临床上使用的抗癌药物(多柔比星和盐霉素)与两种所选择的d-型抗癌肽(d-型dek和d-型eek)和36种富含亮氨酸的抗癌肽针对不同的人类细胞系(例如hmler(三角形)、hmler-shecad(菱形)、mcf-10a(实线)、u2os(方形)和hek293t(虚线))的体外细胞毒性剂量响应的比较。
[0058]
图4示出了多柔比星(实心方形)、盐霉素(实心三角形)和基于富含亮氨酸的抗癌肽l-型eee(方形)、l-型dek(圆圈)、l-型eek(灰色圆圈)和d-型eek(黑色圆圈)的肿瘤球(tumoursphere)(hmler-shecad细胞)体外细胞毒性和剂量响应。a)测量细胞存活力以定量抗癌药物针对肿瘤细胞(hmler-shecad)乳腺球的效力。b)用所选择的抗癌化合物处理后的乳腺球群体。虚线表示预期的未经任何处理的阴性对照。c)测量的每种抗癌药物的ic
50
(灰色条)和ic
90
(黑色条)以及在具体浓度的乳腺球的光学显微镜图像。比例尺为100μm。
[0059]
图5示出了多柔比星(实心方形)、盐霉素(实心三角形)和基于富含亮氨酸的抗癌肽l-型eee(方形)、l-型dek(圆圈)、l-型eek(灰色圆圈)和d-型eek(黑色圆圈)的乳腺球(mca-10a细胞)体外细胞毒性和剂量响应。测量细胞存活力以量化抗癌药物针对健康人类乳腺内皮细胞(mca-10a)乳腺球的效力。b)用所选择的抗癌化合物处理后的乳腺球群体。虚线表示未经任何处理的阴性对照。c)测量的每种抗癌药物的ic
50
(实条)和ic
90
(条)以及在具体浓度的乳腺球的光学显微镜图像。比例尺为100μm。
[0060]
图6示出了多柔比星、盐霉素、l-型eek和d-型eek针对不同的人类细胞系的体外细胞毒性和剂量响应：hmler(圆圈)、hmler-shecad(灰色实心圆圈)、u2os(方形)、mcf-10a(黑色实心圆圈)和hek293t(三角形)。阴影区域表示对癌细胞系具有细胞选择性且对正常细胞系(mcf-10a和hek293t)影响较小的理想的化合物浓度。
[0061]
图7示出了色氨酸荧光结合测定的结果。其示出了50％的肽与单一脂质种类popc脂质体(圆圈)或混合脂质种类popc:popg(比例3:1，方形)脂质体结合时的脂质浓度。简言之，在磷酸盐缓冲盐水(1
×
，ph 7.4)中将50μm肽与滴定的浓度为0μm、12.5μm、25μm、50μm、100μm、250μm、500μm、1000μm、2500μm和5000μm的popc囊泡(黑色)或3popc/1popg囊泡(灰色)一起固定和孵育。使用色氨酸荧光结合测定来确定导致50％肽结合的脂质浓度，并且值显示为脂质/肽。该数据表明，本发明的肽可以区分中性囊泡(popc)和带电荷的囊泡(popc/popg)，后者用作癌细胞的模型(warburg效应)。
[0062]
图8示出了导致ants/dpx染料从脂质体中渗漏50％的肽浓度。简言之，在每种a)盐酸调节的磷酸盐缓冲盐水(1
×
，ph 4.8)和b)磷酸盐缓冲盐水(1
×
，ph 7.4)中将0.5mm popc囊泡(灰色)或popc:popg囊泡(比例3:1，黑色)与浓度为0μm、0.02μm、0.04μm、0.08μm、0.16μm、0.32μm、0.64μm、1.25μm、2.5μm、5μm、10μm和20μm的肽一起孵育。肽引起的染料渗漏
的强度被报告为脂质/肽数值(高数值表示肽在破坏脂质膜方面更有效)。
[0063]
图9示出了富含亮氨酸的acp的作用机制。a)l-型eek(黑色三角形)和d-型eek(灰色三角形)针对人类红细胞的溶血活性。b)肽引起的高亲和力核酸染色剂(sytox green)以滴定的肽浓度进入hela细胞系：l-型eek(黑色三角形)、d-型eek(灰色三角形)和作为阳性对照的蜂毒肽(方形)。c)在存在l-型eek(黑色圆圈)和d-型eek(灰色圆圈)并与necrostatin(坏死性凋亡抑制剂(inhibitor of necroptosis))和zvad-fmk(凋亡抑制剂)一起共孵育的情况下hmler-shecad(人类乳腺内皮癌症干细胞)的细胞存活力。d)用多柔比星(圆圈)，和多柔比星联合5μm胱天蛋白酶抑制剂z-vad-fmk(方形)，以及多柔比星与20μm necrostatin-1(三角形)处理的hmler-shecad细胞的存活力。
[0064]
图10示出了用于将本技术的acp与基于铜的小分子抗癌药物缀合的合成策略。
[0065]
图11示出了eek纳米颗粒(np)的开发。a l-eek np和np制备的示意性图示。b l-eek np的透射电子显微术图像。比例尺为200nm(黑色)，并且插图中的比例尺为20nm(白色)。c l-eek np(n＝3)和没有l-eek货物的对照np的动态光散射表征。d游离的l-型eek、l-eek np和对照np的比较溶血活性。e通过cck-8测定评估用l-eek、l-eek np和对照np针对乳腺癌细胞系(mcf-7、mda-mb-231、mda-mb-453和zr-75-1)进行处理的细胞存活力。l-eek和l-eek np针对乳腺癌细胞的ic
50
值分别为绿色和红色。f mda-mb-231三阴性乳腺癌小鼠模型的示意图与对照纳米颗粒和eek肽纳米颗粒处理时间表。g用l-型eek np处理有效抑制癌症生长。在皮下接种mda-mb-231(4
×
106个细胞)后第11天建立可察觉的肿瘤后，在14天的处理期内，用10mg/kg/剂量的eek-np或等剂量的对照np处理小鼠。监测肿瘤体积。***p《0.005(n＝4)。h在l-eek np和对照np处理开始后第33天mda-mb-231肿瘤的图像。i在120天的观察期内，肿瘤接种后小鼠存活的kaplan-meier曲线。小鼠存活定义为肿瘤尺寸小于1000mm3(n＝4，*p《0.05)。
[0066]
图12示出了l-eek np的物理化学性质。a对照np的tem图像。比例尺＝200nm，并且插图中的比例尺＝20nm。b l-eek在hplc下的色谱图。c l-eek在l-eek np中的包封效率。d在37℃、在ph 7.4和ph 5.0，l-eek从纳米颗粒的释放。e乳腺癌细胞系中游离的alexa647标记的l-eek和纳米颗粒包封的alexa647标记的l-eek的细胞摄取。
[0067]
图13示出了l-eek np处理的抗癌功效。a和c用对照纳米颗粒处理的小鼠(n＝4)的个体mda-mb-231肿瘤生长曲线和体重曲线。b和d用l-eek纳米颗粒处理的小鼠(n＝4)的个体mda-mb-231肿瘤生长曲线和体重曲线。
[0068]
图14示出了原子细节acp膜孔结构和膜穿孔机制。分子动力学模拟揭示了以下的全部原子细节：a，自发acp膜吸附。b，插入，和c，孔形成(所示为大的、不均匀的、完全充满水的eek孔)。d、e结合的肽形成2-16个肽的瞬时孔的系综(ensemble)(上图)，将水(中图)和离子(下图)两者传递穿过膜。
[0069]
图15是肽eek-纳米载体与癌细胞膜结合的分子模拟。acp，诸如肽eek，在纳米载体内自由移动，并通过直接分配进入靶膜。聚合物纳米载体的流体性质对于该过程至关重要。直径为20nm的纳米载体的尺寸确保acp被局部递送到靶膜的～10nm直径的小区域上，提供了改进膜穿孔的高的局部acp浓度。
[0070]
实施例1
[0071]
材料和方法
[0072]
肽合成和纯化
[0073]
肽被固相合成并纯化至98％的纯度。通过hplc和esi质谱确认肽的纯度和身份。n-末端是游离胺基团，并且c-末端是游离羧基基团或酰胺化的。
[0074]
脂质体产生
[0075]
脂质1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(popc)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸-(1
’‑
外消旋-甘油)(popg)购自avanti polar lipids，并溶解在氯仿中。通过使用购自avanti polar lipids的挤出仪和过滤器通过100nm孔过滤器挤出产生大的单层囊泡(large,unilamellar vesicles,luv)。
[0076]
细胞系和细胞培养条件
[0077]
hmler(人类乳腺内皮癌细胞)、hmler-shecad(人类乳腺内皮癌症干细胞)和mcf-10a(健康人类乳腺内皮)细胞维持在含有以下补充剂和生长因子的乳腺上皮细胞生长培养基(megm)中：牛垂体提取物(bpe)、氢化可的松、人类表皮生长因子(hegf)、胰岛素和庆大霉素/两性霉素-b。hek293t(人类胚胎肾细胞)和u2os(智人(homo sapiens)骨骨肉瘤)细胞维持在含有10％终浓度的胎牛血清的dulbecco改良eagle培养基(dmem)中。细胞在含有5％co2的加湿气氛中于310k在t75烧瓶中生长。
[0078]
细胞毒性测定
[0079]
使用比色mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物)测定来确定抗癌肽和常规抗癌药物的毒性。在96孔微板的每个孔中接种5
×
103个细胞。将细胞孵育过夜。添加浓度升高的化合物(0μm、0.1μm、0.2μm、0.4μm、0.8μm、1.6μm、3.1μm、6.3μm、12.5μm、25μm、50μm和100μm)，并以总体积200μl孵育72hr。将化合物的储备溶液制备为在dmso中的5mm溶液，并使用培养基稀释或在纯水中稀释。每个孔中dmso的最终浓度为0.5％或0％，并且该量存在于未处理的对照中。72hr后，向每个孔中添加20μl的在pbs中的4mg/ml的mtt溶液，并将板孵育另外4hr。抽吸megm/mtt混合物，并添加100μl的dmso以溶解产生的紫色甲臜晶体。在550nm波长处读取每个孔中溶液的吸光度。将吸光度值针对含dmso或不含dmso的对照孔归一化，并绘制为测试化合物的浓度对比％细胞存活力的图。ic
50
值从所得剂量依赖性曲线插值获得。报告的ic
50
值是两个独立实验的平均值，每个实验由每个浓度水平的六个重复组成(总计n＝12)。36种基于富含亮氨酸的肽的ic
50
值是两个独立实验的平均值(总计n＝2)。
[0080]
肿瘤球形成和存活力测定
[0081]
将hmler-shecad细胞(5
×
103个)铺在超低附着性96孔板(corning)中，并在补充有b27(invitrogen)、20ng/ml egf和4μg/ml肝素(sigma)的megm中孵育5天。在不存在和存在抗癌肽、多柔比星和盐霉素的情况下进行研究。对用抗癌肽、多柔比星和盐霉素处理的乳腺球计数，并使用基于倒置的试剂tox8(sigma)成像。孵育16hr后，在590nm(λ
ex
＝560nm)处读取溶液的荧光。存活的乳腺球使氧化的tox8的量减少，并同时使荧光tox8中间体的量增加，从而指示由测试化合物导致的乳腺球细胞毒性的程度。将荧光值针对含dmso或不含dmso的对照归一化，并绘制为测试化合物的浓度对比％乳腺球存活力的图。ic
50
值从所得剂量依赖性曲线插值获得。报告的ic
50
值是两个独立实验的平均值，每个实验由每个浓度水平的两个重复组成(总计n＝4)。
[0082]
色氨酸荧光结合测定
[0083]
在10mm磷酸盐缓冲液(ph 7.0)中制备肽(50μm)和popc/popg luv(600μm)。孵育溶液并在60分钟后测量。将激发固定在280nm处(狭缝9nm)，并且收集从300nm至450nm处(狭缝9nm)的发射。使用来自biotek的synergy h1 hybrid multi-mode reader(图3a)和cytation
tm 5cell imaging multi-mode reader(图2)记录光谱，并对3次扫描取平均值。
[0084]
脂质体渗漏测定
[0085]
将5mm ants(8-氨基萘-1,3,6-三磺酸二钠盐)和12.5mm dpx(对二甲苯-双-吡啶鎓溴化物)捕集在0.1μm直径的含有脂质的挤出囊泡中。使用采用sephadex g-100(ge healthcare life sciences inc)的凝胶过滤色谱从含有捕集的内容物的luv中去除外部游离的ants/dpx。将luv稀释至0.5mm，并通过添加肽的等分试样用于测量渗漏活性。孵育3h后测量渗漏。10％triton用作阳性对照来测量囊泡的最大渗漏。使用biotek synergy h1 hybrid multi-mode reader，用350nm和510nm处的激发波长和发射波长记录ants/dpx的荧光发射光谱。
[0086]
溶血测定
[0087]
将肽从100μm浓度开始系列稀释于pbs中。每个孔中肽的最终体积为50μl。向每个孔中添加50μl的在pbs中的2
×
108个细胞/ml的rbc。1％triton用作阳性裂解对照。将混合物在37℃孵育1小时，之后将其以1000
×
g离心5分钟。离心后，将10μl上清液转移到新鲜的96孔板中的90μl di h2o中。在410nm处记录所释放的血红蛋白的吸光度，并基于100％裂解对照和0％裂解对照计算溶血分数。
[0088]
测量针对hela细胞的细胞毒性的sytox green测定
[0089]
使hela细胞在t-75烧瓶中的完全dmem(10％fbs)中生长至汇合。在细胞毒性实验的前一天，对细胞进行胰蛋白酶消化，从烧瓶中取出，并以1300rpm沉淀。弃去胰蛋白酶和用过的培养基，并将细胞重悬于完全dmem中。使用细胞计数仪获得细胞计数。然后将细胞以10,000个细胞/孔的密度接种在96孔组织培养板中。次日，在不同的96孔板中，在完全dmem(含有10％fbs)和0.1％sytox green中将肽系列稀释，从100μm浓度开始(第1次)，67μm(第2次)，之后进行2:3系列稀释。每个孔中肽的最终体积为100μl。为了进行细胞毒性测定，从孔中取出培养基，并用肽/dmem/sytox green溶液替换。无肽和20μm melp5分别用作阴性对照和阳性对照。用504nm的激发波长和523nm的发射波长每5分钟一次读取板的荧光，持续1小时。基于由于细胞的壁不稳定而进入细胞的sytox green，基于100％裂解对照和0％裂解对照计算细胞毒性。
[0090]
肽纳米颗粒的制备和表征
[0091]
在典型的制备中，将0.1ml的在甲醇中的5mg/ml l-eek肽与1ml的在乙腈中的25mg/ml peg-plga混合。然后将混合物添加到15ml的25mm tris缓冲液(ph 8.0)中，并在50ml玻璃烧杯中用磁力搅拌棒以400rpm搅拌溶液15min。然后通过氮气轰击15min并将样品溶液置于真空中1hr，将甲醇和乙腈从溶液中完全蒸发。然后通过醋酸纤维素注射过滤器(孔径0.45μm，sartorius)过滤纳米颗粒溶液。用30kda离心过滤管(ultra-15离心过滤装置)洗涤经过滤的l-eek纳米颗粒，并浓缩至1ml的最终体积。收集的纳米颗粒是为实验新鲜制备的。
[0092]
透射电子显微术(tem).
[0093]
将一滴(10μl)l-eek纳米颗粒溶液(0.5mg/ml)沉积到辉光放电网格上。用1wt.％
乙酸铀酰进行负染色，用于在室温对l-eek纳米颗粒进行结构检查。使用fei 120kv sphera显微镜(fei tecnai f20)观察负染色的样品。
[0094]
对纳米颗粒中l-eek的定量.
[0095]
通过高效液相色谱(hplc)对纳米颗粒中的l-eek肽进行定量。hplc分析在agilent technologies series 1100仪器(waldbronn,germany)中进行。分析柱为具有5μm粒径的ascentis express c18反相柱(supelco,bellefonte,pa,usa)(25cm
×
4.6mm)。在定量期间，柱温保持在25℃。流动相由a相(在乙腈中的0.1％tfa)和b相(在蒸馏水中的0.1％tfa)组成。开始对样品进行线性梯度洗脱，在25min内为40％至80％的a相，从25min至30min为80％至100％的a相，并保持恒定10min。然后，在5分钟内将洗脱液逆转至初始组成，并保持恒定5min。l-eek的检测波长设定为220nm，并且流量为0.7ml/min。
[0096]
测量l-eek从纳米颗粒的释放速率.
[0097]
使用透析管用20k mwco slide-a-lyzer mini透析装置(rockford,il,usa)在pbs(ph7.4)和0.15m乙酸盐缓冲溶液(ph5.0)中研究l-eek从纳米颗粒的释放。磷酸盐缓冲液和乙酸盐缓冲液含有0.3％(v/v)乙酸和1.3％(w/v)乙酸钠。在37℃在温和搅拌下将样品放置到透析管中。在预定时间点(1hr、4hr、8hr、12hr、24hr、48hr、72hr和96hr)，收集纳米颗粒样品并使用hplc分析l-eek含量。
[0098]
溶血(新鲜的鼠红细胞).
[0099]
从balb/c裸鼠中提取新鲜的鼠红细胞，并在pbs中彻底洗涤，直到上清液澄清。将l-eek和l-eek np从200μm浓度开始系列稀释于pbs中。对照np的系列稀释基于与eek np相比的聚合物的量。每个孔中肽的最终体积为50μl。向每个孔中添加50μl的在pbs中的2
×
108个细胞/ml的rbc。1％triton用作阳性裂解对照。将混合物在37℃孵育1hr，之后将其以1000
×
g离心5分钟。离心后，将10μl上清液转移到新鲜的96孔板中的90μl蒸馏水中。在410nm处记录所释放的血红蛋白的吸光度，并基于100％裂解对照和0％裂解对照计算溶血分数。
[0100]
细胞存活力和细胞毒性测定.
[0101]
比色细胞计数试剂盒-8(cck-8)测定用于确定抗癌肽和常规抗癌药物的细胞增殖中的细胞存活力和细胞毒性。简言之，在96孔微板的每个孔中接种1
×
104个细胞。将游离肽或含有不同浓度肽(0μm、0.1μm、0.2μm、0.4μm、0.8μm、1.6μm、3.1μm、6.3μm、12.5μm、25μm、50μm和100μm)的纳米颗粒添加到细胞，并在含有5％co2的加湿气氛中于37℃孵育72hr。然后向板的每个孔中添加10μl的cck-8溶液，并再孵育4hr。在460nm处测量每个孔中溶液的吸光度。ic
50
值从所得剂量依赖性曲线中插值获得。报告的ic
50
值是两个独立实验的平均值，每个实验由每个浓度水平的六个重复组成(总计n＝3)。
[0102]
通过共聚焦显微术检查乳腺癌细胞系的l-eek纳米颗粒细胞摄取.
[0103]
通过将l-eek与alexa fluor 647nhs酯以10比1的摩尔比在甲醇中孵育72hr来制备荧光团缀合的l-eek。缀合后，将0.1ml的在甲醇中的5mg/ml染料标记的l-eek肽与1ml的在乙腈中的25mg/ml peg-plga混合。然后将混合物添加到15ml的25mm tris缓冲液(ph8.0)中，并在50ml玻璃烧杯中用磁力搅拌棒以400rpm搅拌溶液15min。然后通过氮气轰击15min并将样品溶液置于真空中1hr，将甲醇和乙腈从溶液中完全蒸发。然后通过醋酸纤维素注射过滤器(孔径0.45μm，sartorius)过滤纳米颗粒溶液。用100kda离心过滤管(ultra-15离心过滤装置)洗涤经过滤的l-eek纳米颗粒，并浓缩至1ml的最终体积。收集的纳
米颗粒是为实验新鲜制备的。为了观察细胞与l-eek纳米颗粒之间的细胞摄取，将悬浮于pbs中的荧光l-eek纳米颗粒与4种乳腺癌细胞系(6
×
104个细胞/孔)一起孵育。在共聚焦皿(盖玻片底皿，spl 200350)中孵育2hr后，用pbs洗涤细胞三次，以去除未结合的游离肽和肽纳米颗粒。将所得细胞用10μg/ml dapi染色，用4％多聚甲醛固定，并使用共聚焦荧光显微镜(带有airyscan的蔡司lsm 880)进行检查。
[0104]
l-型eek肽纳米颗粒对抗小鼠中三阴性mda-mb-231肿瘤生长的评价.
[0105]
balb/c裸鼠在右侧肋腹皮下接种mda-mb-231肿瘤细胞(每只小鼠4
×
106个细胞)。在肿瘤接种后11天，将小鼠随机分为两组。通过静脉内注射施用，用对照纳米颗粒(不含l-eek肽)和含有10mg/kg l-eek肽的肽纳米颗粒处理小鼠。在处理时段期间，每周三次测量肿瘤体积和体重。存活终点设定为当肿瘤体积达到1000mm3时。通过对数秩(mantel-cox)检验比较各组的存活曲线。
[0106]
分子动力学模拟和分析
[0107]
使用gromacs 2018.3(www.gromacs.org)、hippo beta(http://www.biowerkzeug.com)和vmd(http://www.ks.uiuc.edu/research/vmd/)进行无偏全原子md模拟并进行分析。
[0108]
使用hippo beta生成延伸的肽结构。这些初始结构通过200个monte carlo步骤弛豫，并且水使用广义born溶剂进行隐式处理。弛豫后，使用charmm-gui(http://www.charmm-gui.org/)将肽置于包含具有100mm k离子和cl离子的模型膜的原子细节肽/脂质/水体系中。将蛋白质折叠模拟平衡10ns，并对肽施加位置限制。对于孔形成的模拟，允许单个肽折叠到双层上，持续～600ns。在获得稳定的表面状态后，随后将体系在x和y(但不是z)方向上复用(multiplied)4
×
4，产生具有16个肽的体系。当从膜两侧的肽开始时，初始结构在上小叶中有一个肽，并且在下小叶中有一个肽。然后通过复用3
×
3构建大体系，以获得18-肽模拟盒。使用gromacs 2018.3，结合tip3p水模型，使用charmm36力场进行md模拟。使用pme计算静电相互作用，并且对于范德华相互作用使用的截止值。集成时间步长为2fs，并且相邻列表每5个步长更新一次。所有模拟均在npt系综中进行，没有任何限制或偏置电位。使用速度重标定温度耦合(velocity rescale temperature coupling)将水和蛋白质各自单独耦合到时间常数τ
t
＝0.5ps的热浴。使用弱半各向同性压力耦合维持1巴的气压，其中可压缩性κz＝κ
xy
＝4.6
·
10-5
巴-1
，并且时间常数τ
p
＝1ps。
[0109]
寡聚体群体分析
[0110]
为了揭示模拟期间最密集(populated)的孔装配，为每个轨迹帧(trajectory frame)构建了所有寡聚体的完整列表。n级寡聚体被认为是相互接触的n个肽的任何组，相互接触定义为重原子(n、c、o)最小距离该定义经常高估寡聚体状态，因为许多瞬时表面结合(s-态)的肽仅松散地附接到构成寡聚体芯的跨膜插入肽。这些s-态肽经常改变位置或漂移到孔的稳定部分上或从孔的稳定部分漂移走。为了将分析集中于真正的更长寿命的tm孔，引入了肽倾斜角τ为75
°
的截止标准。任何τ≥75
°
的肽均被认为是s-态，并从寡聚体分析中去除。该策略通过关注真正的更长寿命的孔结构，大大减少了寡聚体聚类(oligomeric clustering)算法中的噪声。然后构建寡聚体n的占据百分比乘以寡聚体n的肽数目n的群体图。这些揭示了在模拟时间期间有多少肽质量集中在哪种寡聚体状态。
[0111]
排列组合聚类分析
[0112]
使用聚类算法对同一级n的所有寡聚体进行构象聚类，其中主链rmsd相似性截止标准为由于每种寡聚体可以由不同的肽构成(或者由相同的肽但以不同的顺序构成)，因此聚类将一种寡聚体与所有n！排列组合的肽排列的其他寡聚体进行比较。排列组合使用heap算法生成。构象相似性的最终rmsd值被认为是从n！排列组合比较获得的最低rmsd值。聚类结果通常是平坦的，表明结构是高度短暂且动态的。
[0113]
跨膜通量
[0114]
通过膜孔的水和离子的通量通过确定通过整个双层片的总瞬时通量来计算。两个与膜法线正交的平面被认为是在和所有穿过这两个平面的变迁事件(transition event)都被计算在内。然后通过将变迁计数除以膜片的面积和每个轨迹帧的经过时间来获得通量。随后通过对1000个帧取平均值来使曲线平滑。
[0115]
实施例2
[0116]
肽原理
[0117]
下表1包含落入本公开内容的范围内的36种肽。
[0118]
表1：
[0119]
[0120][0121]
n-末端是游离的，c-末端：w-nh2。示出了等电点的计算预测、估计的界
[0122]
面结合自由能和疏水矩。
[0123]
界面结合自由能是肽与膜结合的可能性的量度，并且疏水矩是疏水残基以其螺旋、膜插入构象分布在肽表面周围的均匀性的量度。
[0124]
在c-末端引入另外的色氨酸以便定量肽浓度。带电荷的羧基c-末端(-co
2-)还被修饰成中性酰胺基团(-nh2)，以进一步促进膜渗透。肽被设计成使得带电荷的残基位于螺旋结构的同一极性面上。因此，电荷分布可以影响肽的疏水矩、pka、与癌细胞膜的结合强度，并最终影响在癌细胞膜内肽装配的结构(图1a)。许多具有靶向癌症的生物医学应用的ph依赖性肽具有～4.0的pka。这可能源于癌细胞的微环境稍微更酸性，这是由于warburg效应。因此认为癌细胞膜可以使本发明的带负电的氨基酸质子化，并导致ph触发的膜活性(图1b和表1)。
19-22
[0125]
所有36种富含亮氨酸的肽序列被合成为l-型。δg
界面
代表水和膜界面之间肽分配的结合自由能。使用mpex软件采用wimley-white疏水性量表估计δg
界面
和疏水矩。结合自由
能是肽与膜结合时释放的能量。在0时，肽50％在水中，50％在膜上，在负值时肽优先插入，在正值时肽优先水相。疏水矩是疏水残基如何围绕螺旋轮间隔的量度；疏水矩较大时，疏水残基都在一侧，疏水矩较小时，疏水残基均匀间隔。大的疏水矩更有利于表面结合(即疏水面浸入双层中，并且亲水性面指向水)。
[0126]
实施例3
[0127]
细胞毒性和功效
[0128]
针对几种不同的人类细胞系对肽进行筛选，并确定肽的细胞毒性。使用的细胞系包括mcf-10a(人类乳腺上皮细胞)、hmler(人类乳腺癌主体细胞)、hmler-shecad(人类乳腺癌症干细胞)、hek293t(人类胚胎肾细胞)和u2os(人类骨骨肉瘤)。发现这些肽与常规癌症药物一样有效，可以以低微摩尔浓度消除癌细胞，并且许多肽对癌细胞系具有高选择性(图2和表1)。尽管多柔比星和盐霉素两者对癌性hmler的选择性也高于健康mcf-10a细胞，但它们两者对hek293t细胞的毒性都显著更大。此外，这两种药物在清除生长为三维乳腺球的癌细胞方面效率低得多，目前三维乳腺球被认为是实体瘤的准确得多的体外模型。多柔比星和盐霉素针对二维hmler-shecad的半最大抑制浓度(ic
50
)分别为2.5
±
0.3nm和370
±
0.5nm，然而在乳腺球(一种与体内条件相关性大得多的更实际的三维细胞培养物模型)方面，这些值分别降至43
±
6μm和22
±
5μm，多柔比星的活性降低了1700倍，并且盐霉素的活性降低了63倍。参见下表2和图3。相比之下，所选择的序列eek(gllellelllkaagw)及其d-型肽针对二维以及三维乳腺球肿瘤模型两者均有效，针对hmler、hmler-shecad和u2os细胞的二维培养物具有纳摩尔至低微摩尔活性，并且针对乳腺球具有7μm-13μm活性。参见图4至图6。
[0129]
所有数据点以一式两份进行。所选择的d-型肽、常规抗癌药物、eek肽和25b2肽重复6次。n-末端是游离的，c-末端：-wnh2。
[0130]
表2：
[0131]
[0132][0133]
实施例4色氨酸结合测定和脂质体渗漏测定
[0134]
本公开内容的肽大多是中性或阴离子的，并且在序列中不包含许多正电荷(表1)。本技术的发明人鉴定出六种序列(图2和表2)，它们对癌细胞系具有高度选择性，并且对mcf-10a的影响可忽略不计(ic
50
≥100μm)，并且对hek293t的细胞毒性相对较低：eee、kee、ehe、eeh、dek和eek。它们的净电荷在-2和0之间，并且pka为3.85-7.96，并且它们的序列包
含一个正电荷(带正电荷的n-末端)或两个正电荷(一个带正电荷的n-末端和一个在位置4或11的赖氨酸)。几项研究显示，癌细胞膜可能具有带负电荷的膜表面。
23,24
ishikawa等人发现乳腺癌细胞系mcf-7与hmler相似，在膜表面上含有少量带负电荷的唾液酸。
23
这表明，目前富含亮氨酸的肽的抗癌活性和细胞选择性不能仅由静电相互作用来解释，而是还可能涉及由于癌细胞微环境中的warburg效应引起的电荷分布。为了证实这一假设，本技术的发明人用两种不同的脂质模型囊泡(两性离子popc，和阴离子3popc/1popg混合物)进行了色氨酸结合测定(参见下表3和图7)，并分别在ph 7.4(生理条件)和ph 4.8(弱酸)进行了ants/dpx脂质体渗漏测定(参见下表4和图8)。
[0135]
表3示出了引起50％肽结合到脂质体上的脂质浓度。在磷酸盐缓冲盐水(1
×
，ph 7.4)中将50μm肽与滴定的浓度为0μm、12.5μm、25μm、50μm、100μm、250μm、500μm、1000μm、2500μm和5000μm的脂质(popc囊泡或3popc/1popg囊泡)一起固定和孵育。使用色氨酸荧光结合测定来确定导致50％肽结合的脂质浓度，并且值显示为每个肽的脂质。n-末端是游离的，c-末端：-w-nh2。
[0136]
表4示出了引起50％ants/dpx脂质体渗漏的肽浓度。分别在磷酸盐缓冲盐水(1
×
，ph 7.4)和盐酸调节的磷酸盐缓冲盐水(1
×
，ph 4.8)中将0.5mm popc和3popc/1popg囊泡与滴定的肽浓度(0μm、0.02μm、0.04μm、0.08μm、0.16μm、0.32μm、0.64μm、1.25μm、2.5μm、5μm、10μm和20μm)一起固定和孵育。这些值显示为每个肽的脂质。n-末端是游离的，c-末端：-w-nh2。
[0137]
表3：
[0138][0139]
表4：
[0140][0141]
结果显示，在中性ph，细胞选择性肽在两性离子囊泡和阴离子囊泡之间没有任何显著的结合选择性和肽引起的脂质体渗漏，但在ph 4.8，六种膜选择性肽中的四种(ehe、eeh、dek和eek)具有相对较高的从阴离子囊泡的脂质体渗漏活性。这表明这四种肽是依赖于脂质组成和ph条件两者的环境触发的膜活性肽；然而，其他两种膜选择性肽(eee和kee)的机制仍不清楚。
[0142]
实施例5
[0143]
富含亮氨酸的肽的作用机制
[0144]
图9示出，l-型eek在90μm浓度以下引起最小程度的裂解，远低于～10μm治疗浓度。d-型eek更具裂解性。高亲和力核酸染色剂sytox green进入hela细胞的浓度依赖性的比较表明，l-型和d-型eek的行为类似于强力的形成孔的肽蜂毒肽。这些结果共同显示了癌细胞质膜的选择性孔形成是作用机制。
[0145]
图9c示出，用l-型或d-型eek处理的hmler-shecad细胞的细胞存活力不能通过与坏死性凋亡抑制剂necrostatin共孵育来改进，也不能通过与凋亡抑制剂z-vad-fmk共孵育来改进，表明acp由于在质膜中的孔形成而触发坏死。相比之下，图9d示出，用多柔比星处理的hmler-shecad细胞的细胞存活力可以通过与z-vad-fmk或necrostatin共孵育来显著改进。
[0146]
总之，这些结果表明在癌细胞质膜中选择性的孔形成(导致坏死)是acp抗癌活性的主要机制。
[0147]
实施例6
[0148]
纳米颗粒产生
[0149]
为了实现静脉内抗癌肽(acp)递送并解决可能阻碍基于裂解肽的治疗剂的转化的溶解度问题、药代动力学问题和稳定性问题，使用上文(肽纳米颗粒的制备和表征)所述的优化的纳米沉淀方法，制备了直径为20nm的装载acp的聚乙二醇甲醚聚丙交酯-共-乙交酯(peg-plga)纳米颗粒(np)。这些超小的纳米颗粒在其增强渗透肿瘤的能力方面优于较大的载体。此外，我们推测20nm载体的极小尺寸将实现适用于膜裂解肽治疗剂的更快的释放谱，因为肽需要重获其分子自由以进行膜穿孔作用。基于l-eek在该肽家族中较高的癌症特异性选择性，选择l-eek作为用于np制备(l-eek-np)的活性acp。
[0150]
在纳米沉淀方案的优化(图1a)之后，容易地形成直径为21.7
±
1.4nm且具有-16.0
±
0.6mv的ζ电位的单峰np(图1b、图1c)。没有eek货物的对照np显示出相似的物理化学性质(图2a)，表明eek装载是通过包封在聚合物芯内而不是表面吸附来介导的。eek-np的hplc分析显示出eek的82.3
±
3.4％的高包封效率(图2b，图2c)，转化为每mg聚合物16.4μg的肽装载产率。l-eek-np肽释放动力学是高度ph敏感的，在ph 5.0，4hr内释放95.3％的肽，而在生理ph 7.4，48hr后保留肽含量的约50％(图2d)。
[0151]
肽纳米颗粒包含具有极小尺寸的酸不稳定的可生物降解的聚合物，表现出对包封的肽的膜裂解活性至关重要的高度ph敏感的释放谱。
[0152]
实施例7
[0153]
纳米颗粒抗癌功效
[0154]
对于对照np、l-eek肽和l-eek-np处理，通过cck-8测定评估的细胞存活力显示，np制剂使eek针对四种不同乳腺癌细胞系(mcf-7、mda-mb-231、mda-mb-453和zr-75-1)的抗癌功效增加了4倍(图1e)。在增强肽针对癌细胞的细胞毒性的同时，np还被显示减少肽与红细胞的相互作用(图1d)。
[0155]
实施例8
[0156]
纳米颗粒可以治疗小鼠模型中的转移性乳腺癌
[0157]
在侵袭性转移性mda-mb-231三阴性乳腺癌小鼠模型中评估了l-eek-np的治疗意
义(图1f)，三阴性乳腺癌以预后不良和治疗选择有限而闻名。在建立可察觉的肿瘤后，在两周的处理期内用对照np或l-eek-np处理小鼠。在处理期之后的肿瘤观察中，对照组中的小鼠表现出显著的肿瘤体积生长(图1g、图1i；图3a)。相比之下，接受eek-np处理的小鼠显示出显著抑制的肿瘤生长(图1g，图1i；图3b)，其中四只经处理的小鼠中的两只显示出肿瘤完全根除。值得注意的是，对照np处理和l-eek-np处理两者都显示出可忽略不计的体重减轻(图1h；图3c、图3d)，证明了抗癌肽纳米制剂的安全性。
[0158]
实施例9
[0159]
apc孔结构和功能
[0160]
膜穿孔肽通常形成用目前技术难以经实验确定的瞬时孔。为了揭示支撑膜穿孔的分子机制，我们使用无偏长时间尺度原子细节分子动力学模拟研究了eek的折叠分配和孔装配。acp快速吸附并折叠到膜界面上(图14a)。随后，在数十μs的时间尺度上，apc协同插入并跨脂质双层移位，占据两个膜界面(图14b)，并形成孔的系综(图14d)。结构分析揭示了高度异质性的孔架构，其中在膜中持续形成和解体的大多数孔架构由6个-10个肽构成(图14e)。孔传递水和离子两者(图14d)，并且渗漏由更大更稳定的孔主导，这些孔由10-12个肽组成，形成排列有极性和带电荷的侧链的大的水性通道(图14c)。
[0161]
序列描述
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