一种穿心莲内酯改构化合物g3和制备方法及其用途
技术领域
1.本发明涉及药物化学技术领域，具体涉及一种穿心莲内酯改构化合物g3和制备方法及其用途。
背景技术：
2.穿心莲，又名春莲秋柳、一见喜、榄核莲、苦胆草、金香草、金耳钩、印度草、苦草等，爵床亚科，穿心莲属。一年生草本植物，长4-8厘米，宽1-2.5厘米。穿心莲是一种药食同源的植物，其味苦、行寒，归心、肺、大肠、膀胱经，具有清热解毒、 凉血、消肿之功效。其嫩芽部分，适宜夏季食用，有消暑、败火之用，还可抗病毒、预防痢疾、感冒等。《中国药典》记录穿心莲能清热解毒，凉血，消肿。用于感冒发热，咽喉肿痛，口舌生疮，顿咳劳嗽，泄泻痢疾，热淋涩痛，痈肿疮疡，毒蛇咬伤。
3.目前，穿心莲已制备成多种制剂，如穿琥宁针、炎琥宁针、莲必治针等，已被卫生部及国家中医药管理局列为急诊科必备药品之一，在临床应用广泛。穿心莲内酯或其改构化合物的抗肿瘤活性一直受到关注，但尚未有本发明的穿心莲内酯改构化合物及其相关功能的文献报道。
技术实现要素：
4.因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种穿心莲内酯改构化合物g3和制备方法及其用途，所述穿心莲内酯改构化合物g3可以用于制备治疗癌症的药物。
5.为此，本发明提供了如下的技术方案：一种穿心莲内酯改构化合物g3，其结构式如下：。
6.一种所述的穿心莲内酯改构化合物g3的制备方法，包括如下步骤：s1、在弱碱性反应体系内，穿心莲内酯与叔丁基二甲基氯硅烷混合发生亲核取代反应，得到穿心莲内酯改构化合物e1；s2、将穿心莲内酯改构化合物e1和过量的丙酸酐混合，加热至120~180℃，发生酰基碳上的亲核取代反应，对穿心莲内酯改构化合物e1的3号和14号位的羟基修饰成丙酰基，得到穿心莲内酯改构化合物g3；其合成路线如下：
。
7.可选的，如下式，穿心莲内酯19号位的伯醇羟基用叔丁基二甲基硅（tbs）保护，3号和14号位的仲醇羟基均用丙酰基保护，得到穿心莲内酯改构化合物g3。
8.。
9.可选的，在s1步骤中，穿心莲内酯与叔丁基二甲基氯硅烷的摩尔比为0.2:1~0.3:6；和/或在s1步骤中，所述亲核取代反应的条件为室温下搅拌反应1~24小时；和/或在s1步骤中，还包括将得到的穿心莲内酯改构化合物e1进行萃取、洗涤、干燥、过滤、减压浓缩和/或纯化的步骤。
10.可选的，在s2步骤中，所述穿心莲内酯改构化合物e1和丙酸酐的质量体积比≤93:4，比例关系为mg/ml；和/或在s2步骤中，所述亲核取代反应时间为1~4小时；和/或在s2步骤中，还包括将得到的穿心莲内酯改构化合物g3进行萃灭、萃取、洗涤、干燥、过滤、减压浓缩和/或纯化的步骤。
11.可选的，在步骤s1中，所述纯化的步骤为将穿心莲内酯改构化合物e1粗品通过硅胶柱色谱分离，洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯按照体积比为（40~60）：（0.5~2）
→
（1~20）：（0.5~2）进行梯度洗脱，优选的为50:1
→
10：1进行梯度洗脱；和/或在步骤s2中，所述纯化的步骤为将穿心莲内酯改构化合物g3粗品通过硅胶柱色谱分离，洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯按照体积比为（40~60）：（0.5~2）
→
（1~20）：（0.5~2）进行梯度洗脱，优选的为50:1
→
10：1进行梯度洗脱。
12.一种所述的穿心莲内酯改构化合物g3的制备方法制备得到的穿心莲内酯改构化合物g3。
13.一种所述的穿心莲内酯改构化合物g3或其衍生物具有制备治疗癌症的药物中的用途。
14.可选的，所述癌症包括胃癌、肾癌或黑色素瘤。
15.可选的，所述胃癌的细胞选自胃癌mkn45细胞；和/或所述肾癌的细胞选自肾癌786 o细胞；和/或
所述黑色素瘤的细胞选自黑色素瘤a375细胞。
16.可选的，所述穿心莲内酯改构化合物g3的衍生物包括其顺反异构体、其非对映异构体、其几何异构体、其外消旋体、其溶剂合物、其药学上可接受的盐或其前体药物。
17.一种用于治疗癌症的药物组合物，含有治疗有效量的所述的穿心莲内酯改构化合物g3或其衍生物。
18.可选的，还包括药学上可接受的载体，包括水、油、蔬菜、矿物质、膏基、洗剂基质或软膏基质。
19.可选的，所述膏基、洗剂基质或软膏基质包括悬浮剂、增粘剂和/或透皮促进剂。
20.定义和说明除非另有说明，本发明所用的下列术语和短语旨在具有下列含义。一个特定的术语或短语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照普通的含义去理解。当本发明中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。
21.本发明的穿心莲内酯改构化合物g3可以以非溶剂化形式或者溶剂化形式存在，包括水合物形式。一般而言，溶剂化形式与非溶剂化的形式相当，都包含在本发明的范围之内。
22.本发明的穿心莲内酯改构化合物g3可以具有不对称碳原子(光学中心)或双键。外消旋体、非对映异构体、几何异构体和单个的异构体都包括在本发明的范围之内。
23.穿心莲内酯改构化合物g3的药学上可接受的载体是指能够递送本发明有效量活性物质、不干扰活性物质的生物活性并且对宿主或者患者无毒副作用的任何制剂或载体介质代表性的载体包括水、油、蔬菜和矿物质、膏基、洗剂基质、软膏基质等。这些基质包括悬浮剂、增粘剂、透皮促进剂等。
24.本发明技术方案，具有如下优点：1.本发明提供的一种穿心莲内酯改构化合物g3，所述穿心莲内酯改构化合物g3或其衍生物可以用于制备治疗癌症的药物，经本发明研究验证 ，与未改构的穿心莲内酯（andrographolide, ag）抗肿瘤效果进行了对比，穿心莲内酯改构化合物g3或其衍生物具有更显著的抗肿瘤效果。
25.2.本发明提供的一种穿心莲内酯改构化合物g3的制备方法，包括如下步骤：s1、在弱碱性反应体系内，穿心莲内酯与叔丁基二甲基氯硅烷混合发生亲核取代反应，得到穿心莲内酯改构化合物e1；s2、将穿心莲内酯改构化合物e1和过量的丙酸酐混合，加热至120~180℃，发生酰基碳上的亲核取代反应，对穿心莲内酯改构化合物e1的3号和14号位的羟基修饰成丙酰基，得到穿心莲内酯改构化合物g3；上述制备方法简单快捷，所需加入的反应底物种类较少，利于后续纯化步骤，采用丙酸酐可以作为反应物也可作为反应试剂，无毒副作用。
26.3.本发明提供的穿心莲内酯改构化合物g3或其衍生物在制备治疗癌症的药物中的用途，所述癌症包括胃癌、肾癌或黑色素瘤，经过本发明验证，与未改构的穿心莲内酯抗肿瘤效果进行了对比，穿心莲内酯改构化合物g3或其衍生物对于胃癌、肾癌或黑色素瘤的抑制作用更显著。
附图说明
27.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
28.图1为实施1得到的穿心莲内酯改构化合物g3的hrms图；图2为实施1得到的穿心莲内酯改构化合物g3的1h nmr图；图3为实施1得到的穿心莲内酯改构化合物g3的
13
c nmr图；图4为实施1得到的穿心莲内酯改构化合物g3的hplc图；图5为给药24小时不同浓度穿心莲内酯改构化合物g3对胃癌mkn45细胞的增殖抑制率；图6为给药48小时不同浓度穿心莲内酯改构化合物g3对胃癌mkn45细胞的增殖抑制率；图7为给药72小时不同浓度穿心莲内酯改构化合物g3对胃癌mkn45细胞的增殖抑制率；图8为穿心莲内酯改构化合物g3对胃癌mkn45细胞作用的时效关系；图9为穿心莲内酯改构化合物g3给药24小时胃癌mkn45细胞达到半数抑制的化合物浓度；图10为穿心莲内酯改构化合物g3给药48小时胃癌mkn45细胞达到半数抑制的化合物浓度；图11为穿心莲内酯改构化合物g3给药72小时胃癌mkn45细胞达到半数抑制的化合物浓度；图12为给药24小时不同浓度穿心莲内酯改构化合物g3对肾癌786o细胞的增殖抑制率；图13为给药48小时不同浓度穿心莲内酯改构化合物g3对肾癌786o细胞的增殖抑制率；图14为给药72小时不同浓度穿心莲内酯改构化合物g3对肾癌786o细胞的增殖抑制率；图15为穿心莲内酯改构化合物g3对肾癌786o细胞作用的时效关系；图16为穿心莲内酯改构化合物g3给药24小时肾癌786o细胞达到半数抑制的化合物浓度；图17为穿心莲内酯改构化合物g3给药48小时肾癌786o细胞达到半数抑制的化合物浓度；图18为穿心莲内酯改构化合物g3给药72小时肾癌786o细胞达到半数抑制的化合物浓度；图19为给药24小时不同浓度穿心莲内酯改构化合物g3对黑色素瘤a375细胞的增殖抑制率；图20为给药48小时不同浓度穿心莲内酯改构化合物g3对黑色素瘤a375细胞的增殖抑制率；
图21为给药72小时不同浓度穿心莲内酯改构化合物g3对黑色素瘤a375细胞的增殖抑制率；图22为穿心莲内酯改构化合物g3对黑色素瘤a375细胞作用的时效关系；图23为穿心莲内酯改构化合物g3给药24小时黑色素瘤a375细胞达到半数抑制的化合物浓度；图24为穿心莲内酯改构化合物g3给药48小时黑色素瘤a375细胞达到半数抑制的化合物浓度；图25为穿心莲内酯改构化合物g3给药72小时黑色素瘤a375细胞达到半数抑制的化合物浓度；图26为给药24小时不同浓度ag对胃癌mkn45细胞的增殖抑制率；图27为给药48小时不同浓度ag对胃癌mkn45细胞的增殖抑制率；图28为给药72小时不同浓度ag对胃癌mkn45细胞的增殖抑制率；图29为ag给药24小时胃癌mkn45细胞达到半数抑制的化合物浓度；图30为ag给药48小时胃癌mkn45细胞达到半数抑制的化合物浓度；图31为ag给药72小时胃癌mkn45细胞达到半数抑制的化合物浓度；图32为给药24小时不同浓度ag对肾癌786o细胞的增殖抑制率；图33为给药48小时不同浓度ag对肾癌786o细胞的增殖抑制率；图34为给药72小时不同浓度ag对肾癌786o细胞的增殖抑制率；图35为ag给药24小时肾癌786o细胞达到半数抑制的化合物浓度；图36为ag给药48小时肾癌786o细胞达到半数抑制的化合物浓度；图37为ag给药72小时肾癌786o细胞达到半数抑制的化合物浓度；图38为给药24小时不同浓度ag对黑色素瘤a375细胞的增殖抑制率；图39为给药48小时不同浓度ag对黑色素瘤a375细胞的增殖抑制率；图40为给药72小时不同浓度ag对黑色素瘤a375细胞的增殖抑制率；图41为ag给药24小时黑色素瘤a375细胞达到半数抑制的化合物浓度；图42为ag给药48小时黑色素瘤a375细胞达到半数抑制的化合物浓度；图43为ag给药72小时黑色素瘤a375细胞达到半数抑制的化合物浓度；上述的关于半数抑制的化合物浓度的附图中的横坐标log的底数是10。
具体实施方式
29.提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
30.实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
31.实施例1本实施例提供了穿心莲内酯改构化合物g3，中文名称为(1r,2r,4as,5r)-1-{[(叔
38.38, 37.47, 28.12, 27.58, 25.49, 25.39, 24.50, 23.36, 18.36, 14.46, 9.42, 9.20,
ꢀ‑
5.50,
ꢀ‑
5.61。如图3所示。
[0038]
将起始原料穿心莲内酯进行hplc测试，色谱条件为：流动相为甲醇-水（95:5，v/v）；洗脱程序为等度洗脱；色谱柱为rpc18柱；检测波长为230 nm；柱温为室温（27℃）；检测结果如下表，穿心莲内酯纯度为98.8%。
[0039]
表1将得到的穿心莲内酯改构化合物e1进行hplc检测，色谱条件为：流动相为甲醇-水（90:10，v/v）；洗脱程序为等度洗脱；色谱柱为rpc18柱；检测波长为230 nm；柱温为室温（27℃）；检测结果如下表，穿心莲内酯改构化合物e1纯度为98.1%。
[0040]
表2将得到的穿心莲内酯改构化合物g3进行hplc检测，色谱条件为：流动相为甲醇-水（90:10，v/v）；洗脱程序为等度洗脱；色谱柱为rpc18柱；检测波长为230 nm；柱温为室温（27℃）；检测结果如下表以及图4，穿心莲内酯改构化合物g3纯度为95.1%。
[0041]
表3实施例2本实施例提供了穿心莲内酯改构化合物g3的制备方法，包括如下步骤：（1）、向反应瓶中加入穿心莲内酯（0.3mmol）和吡啶（3ml），再加入叔丁基二甲基硅酰氯(tbdmscl)（6mmol），室温（20℃）下磁力搅拌反应24 h。向反应混合物中加入乙酸乙酯（etoac，30 ml）稀释，然后加入水（40 ml）淬灭反应，并用etoac萃取（80 ml
×
3）。合并的有机相依次用盐水（100 ml）洗涤、无水na2so4干燥，过滤，有机滤液经减压浓缩的粗品再通过硅胶柱色谱（pe：ea=40:0.5
→
1：0.5，v/v）梯度洗脱分离得到白色固体（化合物e1）。
[0042]
（2）、向反应瓶中加入化合物e1和丙酸酐（化合物e1和丙酸酐的质量体积比为93:5，比例关系为mg/ml），加热至180℃，并继续在180℃下反应4 h。冷却至室温后，向反应混合物中加入etoac（100 ml）稀释，然后加入饱和nahco3溶液（100 ml）进行淬灭，水洗，再用etoac提取（100 ml
×
3）。合并的有机相依次用盐水（100 ml）洗涤、无水na2so4干燥，过滤，有
机滤液经减压浓缩的粗品通过硅胶柱色谱（pe：ea=40:0.5
→
1：0.5，v/v）梯度洗脱分离得到白色固体（穿心莲内酯改构化合物g3）。
[0043]
实施例3本实施例提供了穿心莲内酯改构化合物g3的制备方法，包括如下步骤：（1）、向反应瓶中加入穿心莲内酯（0.2mmol）和吡啶（3ml），再加入叔丁基二甲基硅酰氯(tbdmscl)（1mmol），室温（20℃）下磁力搅拌反应1h。向反应混合物中加入乙酸乙酯（etoac，30 ml）稀释，然后加入水（40 ml）淬灭反应，并用etoac萃取（80 ml
×
3）。合并的有机相依次用盐水（100 ml）洗涤、无水na2so4干燥，过滤，有机滤液经减压浓缩的粗品再通过硅胶柱色谱（pe：ea=60:2
→
20：2，v/v）梯度洗脱分离得到白色固体（化合物e1）。
[0044]
（2）、向反应瓶中加入化合物e1和丙酸酐（化合物e1和丙酸酐的质量体积比为90:4，比例关系为mg/ml），加热至120℃，并继续在120℃下反应1 h。冷却至室温后，向反应混合物中加入etoac（100 ml）稀释，然后加入饱和nahco3溶液（100 ml）进行淬灭，水洗，再用etoac提取（100 ml
×
3）。合并的有机相依次用盐水（100 ml）洗涤、无水na2so4干燥，过滤，有机滤液经减压浓缩的粗品通过硅胶柱色谱（pe：ea=60:2
→
20：2，v/v）梯度洗脱分离得到白色固体（穿心莲内酯改构化合物g3）。
[0045]
实施例4穿心莲内酯改构化合物g3抑制人胃癌的作用1、实验材料细胞来源与培养：人胃癌细胞系mkn45购于协和医学院细胞资源中心（其为细胞系资源的国家基础设施，nsti的总部），细胞采用含10%胎牛血清、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的1640培养基，培养于37℃、5%co2培养箱中。
[0046]
测试样品：实施例1制备的穿心莲内酯改构化合物g3、市售的穿心莲内酯（ag）以及市售的抗胃癌阳性药物环磷酰胺。
[0047]
2、实验方法采用cck8实验方法检测穿心莲内酯改构化合物g3对胃癌细胞活力的影响。具体操作如下：mkn45细胞以5000个细胞/孔的密度接种于96孔板中培养；细胞分组如下：穿心莲内酯改构化合物g3不同终浓度梯度给药组（0.1μm，1μm，10μm，20μm，30μm，40μm，50μm）；ag不同终浓度梯度给药组（1μm，5μm，10μm，25μm，50μm，100μm，200μm）；抗胃癌阳性药物环磷酰胺组（终浓度3.583mm）；对照组为不加药的1640培养基组；另设不加细胞不加药物的空白组。
[0048]
细胞铺板24小时后加药干预，给药后分别于24、48及72小时后，加入cck8试剂（购自日本同仁）检测肿瘤细胞存活率，计算ic
50
。
[0049]
结果如图5-图11、图26-图31所示，穿心莲内酯改构化合物g3可显著抑制胃癌mkn45细胞增殖，ic
50
(24h)为23.55μm，ic
50
(48h)为3.383μm，ic
50
(72h)为15.74μm，而ag的ic
50
(24h)为47.16μm，ic
50
(48h)为15.52μm，ic
50
(72h)为12.52μm，由此可以看到，穿心莲内酯改构化合物g3的ic
50
(24h)、ic
50
(48h)均显著低于ag的ic
50
(24h)、ic
50
(48h)，说明穿心莲内酯改构化合物g3相对ag抑制胃癌mkn45细胞增殖作用更显著，同时也说明穿心莲内酯改构化合物g3抑制胃癌mkn45细胞增殖作用更快。
[0050]
实施例5穿心莲内酯改构化合物g3抑制人肾癌的作用1、实验材料细胞来源与培养：人肾癌细胞系786o购于协和医学院细胞资源中心（其为细胞系
资源的国家基础设施，nsti的总部），细胞采用含10%胎牛血清、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的1640培养基，培养于37℃、5%co2培养箱中。
[0051]
测试样品：实施例1制备的穿心莲内酯改构化合物g3、市售的穿心莲内酯（ag）以及市售的抗肾癌阳性药物氟尿嘧啶。
[0052]
2、实验方法采用cck8实验方法检测穿心莲内酯改构化合物g3对肾癌细胞活力的影响。具体操作如下：786o细胞以5000个细胞/孔的密度接种于96孔板中培养；细胞分组如下：穿心莲化合物g3不同终浓度梯度给药组（0.1μm，1μm，10μm，20μm，30μm，40μm，50μm）；ag不同终浓度梯度给药组（1μm，5μm，10μm，25μm，50μm，100μm，200μm）;抗肾癌阳性药物氟尿嘧啶组(终浓度38.4μm，终浓度192μm)；对照组为不加药的1640培养基组；另设不加细胞不加药物的空白组。
[0053]
细胞铺板24小时后加药干预，给药后分别于24、48及72小时后，加入cck8试剂（购自日本同仁）检测肿瘤细胞存活率，计算ic
50
。
[0054]
结果如图12-图18、图32-图37所示，穿心莲化合物g3可显著抑制肾癌786o细胞增殖，ic
50
(24h)为20.82μm，ic
50
(48h)为12.05μm，ic
50
(72h)为11.83μm，而ag的ic
50
(24h)为22.37μm，ic
50
(48h)为11.11μm，ic
50
(72h)为6.397μm，由此可以看到，穿心莲改构化合物g3的ic
50
(24h)显著低于ag的ic
50
(24h)，说明穿心莲内酯改构化合物g3抑制肾癌786o细胞增殖作用更快。
[0055]
实施例6穿心莲内酯改构化合物g3抑制人黑色素瘤的作用1、实验材料细胞来源与培养：人黑色素瘤a375购于协和医学院细胞资源中心（其为细胞系资源的国家基础设施，nsti的总部），细胞采用含10%胎牛血清、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的高糖dmem培养基，培养于37℃、5%co2培养箱中。
[0056]
测试样品：实施例1制备的穿心莲内酯改构化合物g3、市售的穿心莲内酯（ag）以及市售的抗黑色素瘤阳性药物紫杉醇。
[0057]
2、实验方法采用cck8实验方法检测穿心莲内酯改构化合物g3对黑色素瘤细胞活力的影响。具体操作如下：a375细胞以5000个细胞/孔的密度接种于96孔板中培养；细胞分组如下：穿心莲内酯改构化合物g3不同终浓度梯度给药组（0.1μm，1μm，10μm，20μm，30μm，40μm，50μm）；ag不同终浓度梯度给药组（1μm，5μm，10μm，25μm，50μm，100μm，200μm）；抗黑色素瘤阳性药物紫杉醇组(终浓度5μm，终浓度10μm)；对照组为不加药的1640培养基组；另设不加细胞不加药物的空白组。
[0058]
细胞铺板24小时后加药干预，给药后分别于24、48及72小时后，加入cck8试剂检测（购自日本同仁）检测肿瘤细胞存活率，计算ic
50
。
[0059]
结果如图19-图25、图38-图43所示，穿心莲内酯改构化合物g3可显著抑制黑色素瘤a375细胞增殖，发挥抗肿瘤作用，ic
50
(24h)为16.68μm，ic
50
(48h)为9.707μm，ic
50
(72h)为0.0047μm，而ag的ic
50
(24h)为18.6μm，ic
50
(48h)为14.11μm，ic
50
(72h)为12.06μm，由此可以看到，穿心莲改构化合物g3作用24、48、72小时的ic
50
均显著低于ag的，说明穿心莲内酯改构化合物g3相对ag抑制胃癌mkn45细胞增殖作用更显著，同时也说明穿心莲内酯改构化合物
g3抑制胃癌mkn45细胞增殖作用更快。
[0060]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。