一种来源于分枝杆菌的r-转氨酶及其合成方法
技术领域
1.本发明涉及生物催化领域，具体为一种来源于分枝杆菌的r-转氨酶及其合成方法。
背景技术：
2.非天然氨基酸和手性胺是许多药物的中间体，例如：多巴、心得安、青霉胺等药物。这些关键中间体的合成通常都是通过化学合成的方法，但合成过程中涉及高温高压，添加贵金属催化等缺陷，且合成后的化合物的光学纯度不够满足药物生产，还需进行手性拆分等步骤，耗费时间。生物催化的不对称合成是以微生物和酶作为催化剂、立体选择性控制合成手性化合物的方法。用酶作为催化剂是人们所熟悉的，它的高反应活性和高度的立体选择性一直是人们梦寐以求的目标。有机合成和精细化工行业越来越多地利用生物催化转化天然或非天然的底物，获得有用的中间体或产物。目前常用生物催化的有机合成反应主要有水解反应—酯化反应、还原反应和氧化反应等。自90年代以来己成功地用合成内酞胺类抗生素母核、维生素c、l-肉毒碱等。
3.转氨酶是5-磷酸吡哆醛(plp)依赖酶，它广泛的存在于自然界中并在细胞的氮代谢过程中发挥着重要的氨基转移作用。转氨酶有许多的优点，比如高对映选择性和区域选择性、高的反应速率和稳定性等，正是因为这些优点，转氨酶成为工业上用于生产天然氨基酸、非天然氨基酸、手性胺、氨基醇和氨基糖等重要农药或者医药中间体的常用酶之一。然而，转氨酶在工业应用上也存在一些困难，如底物/产物抑制作用、底物适用范围较窄等。争对大部分的化合物需要在有机溶剂中进行反应，则添加的酶需要耐受有机溶剂。因此本发明公开一种来源于分枝杆菌的r-转氨酶及其合成方法，将该酶命名为mspat，是一种具有r型立体选择性的ⅳ型转氨酶。本发明获得了一种耐受有机溶剂的酶，区别于其他的生物催化剂，并进行了少量的突变体的活性研究，并且符合绿色化学生产理念，利于后续的改造及工业化应用。
技术实现要素：
4.本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供一种来源于分枝杆菌的r-转氨酶及其合成方法，以解决上述背景技术提出的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种来源于分枝杆菌的r-转氨酶及其合成方法，该酶命名为mspat，r-转氨酶的氨基酸序列包含选自如下序列之一的序列：
6.(1)：如seq no.2所示的氨基酸序列；
7.(2)：其氨基酸序列具有至少95％同一性且具有高度立体选择性的r构型催化活性的转氨酶活性的氨基酸序列；
8.(3)：在seq no.2中所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而又衍生而来且具有高度立体选择性-r构型催化活性的转氨酶活性的蛋白质；
9.其中，高度立体选择性；是指其中一个立体异构体的含是另一个的至少1.1倍。
10.作为本发明的一种优选技术方案，编码mspat，其核苷酸的序列包含选自如下序列之一的序列：
11.(1)：如seq no.1所示的核苷酸序列；
12.(2)：与seq no.1所示的核苷酸序列具有至少95％同一性且编码具有高度立体选择性r构型催化活性的转氨酶的核苷酸序列；
13.(3)：在高严谨条件下与seq no.1所示的核苷酸序列杂交且编码具有高度立体选择性r构型催化活性的转氨酶的核苷酸序列；
14.其中，高度立体选择性是指其中一个立体异构体的含量是另一个的至少1.1倍。
15.作为本发明的一种优选技术方案，重组载体中有效连接有上述任意一种核苷酸。
16.作为本发明的一种优选技术方案，所述重组载体为pet15b-mspat。
17.作为本发明的一种优选技术方案，所述重组载体转染或转化宿主细胞。
18.一种来源于分枝杆菌的r-转氨酶的合成方法，该方法包括如下步骤：使酮类化合物、r型转氨酶或其修饰物、功能等同物、功能片段或变体，磷酸吡哆醛和氨基供体在反应体系中反应，由此使酮类化合物转化为对应的手性胺。
19.作为本发明的一种优选技术方案，所述酮类化合物为其中r1和r2各自独立地为c1-c8烷基；具体酮类化合物如下：
20.[0021][0022]
作为本发明的一种优选技术方案，所述氨基供体为r-苯乙胺等，具体化合物如下：
[0023][0024]
与现有技术相比，本发明具有的有益效果如下：
[0025]
本发明通过利用具有高度立体选择性的r-转氨酶或其修饰物、功能等同物、功能片段或变体，可以高效地合成手性纯度较高的r构型的手性胺，适合用于手性胺的工业化生产；r-转氨酶是比s-转氨酶更稀有的一类ω-转氨酶，在手性胺和非天然氨基酸的生物制造中具有特殊意义；本发明公布的新r-转氨酶具有严格的(r)立体选择性，并且具有宽广的底物谱，在手性胺和非天然氨基酸的绿色生产中显示出工业应用前景，本发明通过基因工程技术扩增得到分枝杆菌的r-转氨酶的基因，并通过基因工程技术得到表达r-转氨酶蛋白的e.coli de3-pet15b-mspat重组菌株，诱导表达得到r-转氨酶mspat,制备方法简单，容易操作，mspat能够在短时间内耐受60℃高温，具有热稳定型酶的潜力，且在4种有机溶剂反应体系下表现出较高的活力，本发明基于高度立体选择性的pamat,同时以酮类化合物、氨基化合物和磷酸吡哆醛为原料制备获得手性胺或者非天然氨基酸，反应条件温和，符合绿色化学的理念，为研究改造和工业应用提供重要基础，利于工业规模化推广，大大提高了经济价值和社会价值。
附图说明
[0026]
图1为本发明的r-转氨酶的质粒构建图谱；
[0027]
图2为本发明的r-转氨酶的重组表达蛋白sds-page图；
[0028]
图3为本发明的r-转氨酶的酶学性质表征；
[0029]
图4为本发明的r-转氨酶催化产物高效液相图谱；
[0030]
图4.1.1为苯乙酮标准峰；图4.1.2为转胺反应生成的峰；图4.2.1为d-丙氨酸标准峰；图4.2.2为苯乙胺与丙酮酸反应生成的峰；
[0031]
图5为本发明的r-转氨酶产物的高效液相图谱；
[0032]
图5.1为d-丙氨酸标准品；图5.2为l-丙氨酸标准品；图5.3为苯乙胺与丙酮酸反应液衍生后的峰图；
[0033]
图6为本发明的r-转氨酶的有机溶剂耐受实验检测结果；
[0034]
图7为本发明的r-转氨酶实例2中r型转氨酶产物的高效液相图谱；
[0035]
图7.1r-苯乙胺与s-苯乙胺标准品；图7.2 2-氨基庚烷与苯乙酮反应生成峰；
[0036]
图8为本发明的r-转氨酶实例3中r型转氨酶产物的高效液相图谱；
[0037]
图8.1为苯乙酮标准峰；图8.2为转胺反应生成的峰；图8.3为r-苯乙胺与s-苯乙胺标准品；
[0038]
图9为本发明的r-转氨酶实例4中r-转氨酶突变体活性检测结果图。
具体实施方式
[0039]
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易被本领域人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
[0040]
为了满足制备手性化合物的需求，如图所示，本发明公开了一种来源于分枝杆菌的r-转氨酶及其合成方法，改酶命名为mspat，上述转氨酶是本发明采用分子生物学技术获得的，在不改变氨基酸序列的前提下，对来源于分枝杆菌的转氨酶基因的核苷酸序列进行优化后获得，所述的mspat基因核苷酸序列如下所示，氨基酸序列如下所示。
[0041]
实施例1：制备r-转氨酶：
[0042]
(1)来源于分枝杆菌的r-转氨酶mspat载体的构建；
[0043]
本发明r-转氨酶mspat的基因序列来源于genebank数据库wp_067809071.1，在不改变氨基酸序列的前提下，首先将分枝杆菌来源的转氨酶基因密码子进行优化，利用限制性内切酶xhoi
‑‑
bamhi连接至pet15b载体上，质粒图谱如图1所示。
[0044]
(2)r-转氨酶蛋白的表达和纯化；
[0045]
将上述步骤中的得到的pet-15b-mspat采用热激法转入至大肠杆菌表达菌株bl21(de3)中，接种bl21-pet15b-mspat于于液体lb培养基中，37℃过夜培养，获得的菌株按照1：100的比例接种于含有氨苄抗性的培养基中扩大培养，37℃，220r/min。至od
600
为0.6时，添加终浓度为0.5mmol/l的iptg，16℃诱导表达，16h后离心收集菌体，菌体经过高压破碎和ni亲和层析法得到r-转氨酶蛋白，经过sds-page电泳对其大小进行验证，如图2所示，得到的转氨酶的蛋白分子量在40kd左右，与理论分子量37kd一致，说明成功得到重组的r-转氨酶蛋白。下一步将对r-转氨酶酶学性质进行表征。
[0046]
图2显示的是重组表达r-转氨酶的ni亲和层析的sds-page图，图中所示条带从左
至右依次是诱导前、诱导后、破碎后上清液、镍基至结合流穿液、maker、20mm咪唑洗脱、250mm咪唑洗脱、500mm咪唑洗脱。
[0047]
r-转氨酶的酶学性质表征；
[0048]
酶活定义为：r-转氨酶在一定的温度和条件下，每分钟催化生成1umol产物所消耗的酶量定义为1u。
[0049]
反应简式：r-苯乙胺 丙酮酸苯乙酮 d-丙氨酸，由于产物苯乙酮在245nm处有较大吸收峰，所以利用紫外分光光度计检测苯乙酮在245nm处的读值来判断苯乙酮的生成量。建立在245nm处，苯乙酮紫外吸收峰标曲，标准曲线如图所示；
[0050]
r-转氨酶最适ph值的测定：配制5组转氨反应液：20mmol/l苯乙胺、20mmol/l丙酮酸、2mmol/l磷酸吡哆醛(plp)、缓冲液，通过控制磷酸氢二钠与磷酸二氢钾的比列将反应液的ph调至5、5.5、6、7、8、9。取10μl的酶液加入490μl的转氨反应液，40℃孵育30min。反应结束后添加盐酸终止反应，稀释100倍，在a245下测试其读值，计算不同ph条件下的比活力。结果如图3.1所示，r-转氨酶最适ph为7.0。
[0051]
r-转氨酶最适温度的测定：配制ph7.0转氨反应液：20mmol/l苯乙胺、20mmol/l丙酮酸、2mmol/l磷酸吡哆醛(plp)、缓冲液。加入10μl的转胺酶液。在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃等不同温度条件下，反应30min。反应结束后添加盐酸终止反应，稀释100倍测其a245读值，计算不同温度条件下的比活力。结果如图3.2所示，r-转氨酶最适温度为55℃。但酶的热稳定性实验表明，蛋白在55℃下不稳定，活性随时间迅速降低，蛋白在40℃下2h内可以保持90％的活性，之后实验将40℃设为最佳反应温度。
[0052]
r-转氨酶金属离子的测定：配制ph7.0转氨反应液：20mmol/l苯乙胺、20mmol/l丙酮酸、2mmol/l磷酸吡哆醛(plp)、缓冲液，添加10mm的金属离子(nacl、kcl、mgcl2、znso4、mncl2、cucl2、cocl2、niso4、fecl3)，加入10μl的转胺酶液。40℃反应30min。反应结束后添加盐酸终止反应，稀释100倍测其a245读值，计算不同金属离子条件下的比活力，结果如图3.3所示。
[0053]
r-转氨酶动力学曲线的绘制：固定供体苯乙胺的浓度为120mmol/l，2mmol/l磷酸吡哆醛(plp)，受体丙酮酸浓度设置2.5mmol/l、5mmol/l、10mmol/l、20mmol/l、40mmol/l、60mmol/l、80mmol/l、100mmol/l、120mmol/l、用koh调节ph至7.0。各取490μl的转氨反应液，加入10μl的酶液。在40℃条件下，反应30min。结果如图3.4所示；
[0054]
固定受体丙酮酸的浓度为120mmol/l，2mmol/l磷酸吡哆醛(plp)，供体苯乙胺浓度设置2.5mmol/l、5mmol/l、10mmol/l、20mmol/l、40mmol/l、60mmol/l、80mmol/l、100mmol/l、120mmol/l、用koh调节ph至7.0。各取490μl的转氨反应液，加入10μl的酶液。在40℃条件下，反应30min。将反应后的混合物按照上述的方法来测定产物苯乙酮的生成量，计算不同底物浓度条件下的相对活性，利用graphpad中michaeli-menten算法自动拟合动力学曲线。结果如图3.5所示；
[0055]
r-转氨酶底物谱的测定：
[0056]
受体谱的测定；
[0057]
反应简式：r-苯乙胺 氨基受体氨基受体加氨后的化合物 苯乙酮；
[0058]
反应体系：转氨反应液的体积为490μl，包括2mmol/l的磷酸吡哆醛(plp)，氨基供体(r)-苯乙胺浓度为20mmol/l，氨基受体(氨基酸前体酮、芳香酮、脂肪酮等)浓度为
20mmol/l，ph值为7，在40℃条件下避光反应30min。添加的转氨酶的酶量为10μl(1mg/ml)。
[0059]
测定方法：以苯乙胺为氨基供体，选择不同的氨基受体进行实验，由于受体酮，或者醛类在酶标仪下有较大误差，所以在对氨基受体进行实验时选择高效液相色谱对理论产物苯乙酮进行分析实验室的高效液相色谱仪的型号是日本岛津lc-20，选用的色谱柱为zorbax sb-c18反相色谱柱。流动相a：纯水。流动相b：纯乙腈，流动相a液和b液的比例为60：40，流速为1ml/min，检测波长为254nm，柱温为30℃。
[0060]
活力计算：取反应后溶液在高效液相色谱下进行苯乙酮的生成量来计算各底物的相对活力。
[0061]
参与测定的氨基受体主要有：正丙醛、正丁醛、正戊醛、正己醛、1-辛醛、
[0062]
2-戊酮、2-己酮、2-庚酮、2-辛酮、3-戊酮、3-己酮、环己酮、丙酮酸、苯乙醛、4甲基苯乙酮、苄基丙酮、1-苯基-2-丁酮、苯丁酮、1-萘乙酮；
[0063]
为了确定生成物为苯乙酮，对苯乙酮标准品和反应后溶液进行hplc检测，图4.1.1为苯乙酮标准品，图4.1.2为反应液的峰，可以看出反应液与标准品的峰一致，因此判断生成物为苯乙酮。
[0064]
供体谱的测定；
[0065]
反应简式：氨基供体 丙酮酸氨基供体脱氨后的羰基化合物 d-丙氨酸；
[0066]
反应体系：转氨反应液的体积为490μl，包括2mmol/l的磷酸吡哆醛(plp)，氨基供体浓度为20mmol/l(光学纯d-或l-氨基酸、手性胺以及非手性胺)，氨基受体丙酮酸浓度为20mmol/l，ph值为7，在40℃条件下避光反应30min。添加的转氨酶的酶量为10μl。
[0067]
测定方法：取反应后吸取反应液300μl进行衍生实验。分别配置硼酸、磷酸衍生缓冲溶液，以及1％的dnfb缓冲液。使用0.05mol/l硼砂溶液与0.2mol/l硼酸溶液按照体积比4:1混合后，ph调整至9.0得到硼酸衍生缓冲溶液。称取1.7g磷酸二氢钾，300ml超纯水溶解，移取0.1mol/l氢氧化钠溶液72.75ml，加水定容得500ml，ph调整至7.0得到磷酸平衡缓冲液。称取1g dnfb至乙腈中，定容至100ml。衍生步骤首先取样品300ul，ph9.0硼酸衍生缓冲液300ul，1％dnfb衍生液300ul，混匀密封，避光60℃水浴反应60min，待降至室温之后，用ph7.0磷酸平衡缓冲液定容至3ml，静置15min后吸取衍生后液体进行液相分析。
[0068]
选择不同的氨基供体对转氨酶进行测定，建立产物丙氨酸的分析方法。本发明针对理论反应产物d-丙氨酸，以其为检测对象建立了高效液相色谱法，进行生成量精准分析。实验室的高效液相色谱仪的型号是日本岛津lc-20，选用的色谱柱为zorbax sb-c18反相色谱柱。流动相a：50mmol/l乙酸钠，1％的n,n-二甲基甲酰胺(v)，调整ph至6.8，超纯水定容到1l，抽滤、超声后待用。流动相b：乙腈与超纯水的体积比为1:1，500ml纯乙腈加入500ml超纯水，有机滤膜抽滤、超声后待用。流动相a液与b液比例为60:40，流速为1ml/min，检测波长为360nm，柱温为室温。
[0069]
活力计算：将反应后的反应液按照上述方法来测定产物d-丙氨酸的生成量来计算各底物的相对活力。
[0070]
参与测定的氨基供体主要有：异丙胺、正丙胺、仲丁胺、正丁胺、2-氨基戊烷、3-氨基戊烷、环己胺、4-氨基辛烷、异庚胺。
[0071]
为了确定生成物为丙氨酸，将对丙氨酸标准品和反应液进行hplc检测，图4.2.1为衍生后丙氨酸标准品的峰，图4.2.2为反应液衍生后产物峰，其保留时间和标准品一致，因
此推断其产物为丙氨酸。
[0072]
ee值的测定：
[0073]
为了确定生成的产物丙氨酸是d型还是l型，需要对转胺反应液进行手性检测。经过转氨反应后的混合液进行衍生，将衍生后混合液进行高效液相色谱法进行检测。
[0074]
反应体系：使用hplc对产物d型以及l型氨基酸进行分析，在40℃、ph7.0的条件下反应30min，反应混合物的总体积为500ul，其中含有20mm苯乙胺、20m丙酮酸和2mmplp用于标准测定。所用衍生剂为邻苯二甲醛(opa)和n-乙酰-l-半胱氨酸(nac)。
[0075]
衍生方法：硼酸缓冲液的配置包括：10mm硼酸、10mm氢氧化钠、水，比例为50：45：5，配置成ph9.3的硼酸缓冲液。衍生剂配置包括：53mg opa溶于50ml甲醇，0.003mm nac溶于硼酸缓冲液，12ml opa甲醇溶液、10ml nac硼酸溶液，添加3ml硼酸缓冲液至25ml，得到opa/nac衍生液。
[0076]
衍生条件：0.1ml氨基酸水溶液或待测液与5ml衍生试混合均匀10min，抽滤，进样量20ul，进行色谱柱分析。
[0077]
分析条件：色谱柱为zorbax sb-c18反相色谱柱，流动相a为ph＝5.5的醋酸钠缓冲液，流动相b为甲醇，流动相a液和b液的比例为70：30，流速为0.5ml/min，柱温为30℃，检测波长334nm，检测时间为35min。
[0078]
衍生结果如图5所示，图5.1中箭头所指的是d-丙氨酸标准品衍生物的峰，图5.2为l-丙氨酸标准品衍生后的峰图，图5.3为反应液衍生后的峰图，其保留时间和d-丙氨酸标准品一致，且没有检测到l-丙氨酸标准品的峰，因此判断其手性＞99％。
[0079]
转氨酶有机溶剂耐受性的测定：配制ph7.0转氨反应液：20mmol/l苯乙胺、20mmol/l丙酮酸、2mmol/l磷酸吡哆醛(plp)、缓冲液，添加10％有机溶剂例如1,4二氧六环、乙腈、丙酮、dmso、dmf、四氯化碳、甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、异丙醇，加入10μl的转胺酶液，40℃反应30min。
[0080]
转氨酶在10％的有机溶剂体系中，对于绝大部分的有机溶剂都表现出良好的活性。
[0081]
本发明能够以r-胺为氨基供体，采用对手性羰基化合物加氨的不对称合成法，生成手性胺和非天然氨基酸。r-转氨酶mspat具有催化活力的氨基供体有d-氨基酸和r-胺，其中催化活性较好的有d-丙氨酸、r-苯乙胺、2-氨基戊烷、2-氨基己胺、2-氨基庚胺，丙酮酸，戊醛、己醛、对甲基苯乙酮等。
[0082]
从以上的描述中，可以看出本发明上述的实例实现了如下技术效果：本发明公开的新型转氨酶催化了氨基供体中的氨基转移给前手性酮或醛类，从而产生相应r构型的手性胺，利用本发明的新型转氨酶进行合成胺的制备，不仅可以对更多的底物进行转化，而得到r构型手性胺的纯度高，稳定在99％以上。所述合成方法采用的原料易得，方法简单，化学反应条件温和，收率和对映体的纯度均很高，整个生产过程中，操作简单，是可行的、污染较低的合成工艺，为制备手性胺提供了一种新的途径和方法。
[0083]
具体mspat活性测定参见以下表1-表2
[0084]
表1为mspat对氨基受体的活性测定
[0085]
[0086][0087]
表2为mspat对氨基受体的活性测定
[0088]
[0089][0090]
实施例2：mspat催化供体2-氨基庚烷与受体苯乙酮生成苯乙胺和庚酮：
[0091]
反应转化效率检测：将反应后的反应液中，苯乙酮减少量来计算转化效率。
[0092]
反应简式：2-氨基庚烷 苯乙酮
→
庚酮 苯乙胺；
[0093]
反应体系：反应混合物的总体积为10ml，其中含有80mmol/l 2-氨基庚烷、40mmol/l苯乙酮、2mmol/l plp、50mm pb缓冲液，在40℃和ph7.0的条件下反应24h。
[0094]
转化率检测方法：反应结束后增加盐酸终止反应，稀释100倍利用紫外分光光度计检测苯乙酮在245nm处的读值来判断苯乙酮的减少量。
[0095]
反应前苯乙酮的浓度为40mm，反应24h后，未加m16at的反应液检测苯乙酮剩余浓度为17mm，加入m16at的反应液检测苯乙酮的浓度为10mm，由此计算出反应的转化效率为17.5％。
[0096]
ee值的测定：
[0097]
为了确定生成的产物苯乙胺是r型还是s型的，需要对转胺反应液进行衍生，衍生后混合液进行高效液相色谱法进行检测。
[0098]
反应体系：使用hplc对产物r型以及s型苯乙胺进行分析，在40℃和ph7.0的条件下反应24h，反应混合物的总体积为10ml，其中含有80mmol/l 1-氨基庚烷、40mmol/l苯乙酮、2mmol/l plp用于标准测定；
[0099]
衍生方法：取酶液置于分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取三次(3*10ml)，取有机相，无水硫酸钠干燥除水，旋干，残余物用二氯甲烷溶解，1.5eq的苯甲酰氯放置在样品瓶中并用二氯甲烷稀释，反应液搅拌下缓慢加入酰氯(0℃)，加三乙胺10eq，反应1h，反应液旋干柱层析(pe:ea＝10:1)得白色固体。得到产物(1-苯乙基)乙酰胺进行高效液相。
[0100]
分析条件：分离条件：chiralcel od-h 0.46cm*25cm,hexane-iso propanol,85/15。
[0101]
衍生结果如图7所示，图7.1中10.387min箭头所指的是r-丙氨酸标准品衍生物的峰，图7.1中10.387min箭头所指的是r-苯乙胺标准品衍生物的峰，图7.1中13.844min箭头所指的是s-苯乙胺标准品衍生物的峰，图7.2为反应液衍生后的峰图，其保留时间和r-苯乙胺标准品基本一致，且没有检测到s-苯乙胺标准品的峰，因此判断其手性＞99％。
[0102]
实施例3：mspat催化供体r-苯乙胺与s-苯乙胺与受体丙酮酸生成苯乙酮和丙氨酸：
[0103]
反应转化效率检测：将反应后的反应液中，苯乙酮生成量来计算转化效率。
[0104]
反应简式：r/s苯乙胺 丙酮酸
→
苯乙酮 丙氨酸；
[0105]
反应体系：反应混合物的总体积为10ml，其中含有20mmol/l r-苯乙胺、20mmol/l s-苯乙胺、90mmol/l丙酮酸、2mmol/l plp、50mm pb缓冲液，在40℃和ph7.0的条件下反应24h。
[0106]
转化率检测方法：反应结束后，选择高效液相色谱对理论产物苯乙酮进行分析实验室的高效液相色谱仪，型号是日本岛津lc-20，选用的色谱柱为zorbax sb-c18反相色谱柱。流动相a：纯水。流动相b：纯乙腈，流动相a液和b液的比例为60：40，流速为1ml/min，检测波长为254nm，柱温为30℃。
[0107]
为了确定生成物为苯乙酮，对苯乙酮标准品和反应后溶液进行hplc检测，图4.1.1为苯乙酮标准品，图4.1.2为反应液的峰，可以看出反应液与标准品的峰一致，因此判断生成物为苯乙酮。计算苯乙胺转化效率50％。
[0108]
ee值的测定：
[0109]
为了确定产物r型和s型苯乙胺，是否反应完全，经过转氨反应后的混合液进行衍生，将衍生后混合液进行高效液相色谱法进行检测。
[0110]
反应体系：使用hplc对底物苯乙胺进行分析，在40c和ph7.0的条件下反应30min，反应混合物的总体积为500ul，其中含有20mm苯乙胺、20mm丙酮酸和2mm plp用于标准测定。
[0111]
衍生结果如图8所示，图7.1中10.387min箭头所指的是r-苯乙胺标准品衍生物的峰，图7.1中13.844min箭头所指的是s-苯乙胺标准品衍生物的峰，图8.3为反应液衍生后的峰图，其保留时间和s-苯乙胺标准品基本一致，且没有检测到r-苯乙胺标准品的峰,明r型苯乙胺已经与丙酮酸反应完全，因此判断其手性＞99％。
[0112]
实施例4：突变体活性检测；
[0113]
本发明旨在提供一种转氨酶突变体，以验证转氨酶序列同一性。
[0114]
为了实现上述目的，根据本发明的第一实例，选择转氨酶突变体残基位点。转氨酶突变体是由seq no.1所示的氨基酸序列发生突变所得，残基位点的选择包括6个氨基酸残基69、99、187、253、263、292，实验证明突变体与发明的第一个发明的酶具有相似的蛋白转胺活性。因此判定氨基酸序列具有98％以上同源性。
[0115]
质粒构建；
[0116]
引物采用全质粒pcr，用dpnl酶消化原始质粒，转入e.coil r-ipl中，成功转化，即可得到突变质粒的克隆。然后通过超声破碎细胞的方法获得粗酶，用r-转氨酶蛋白的表达和纯化的方法进行镍柱纯化，将纯化过的酶进行活性检测。
[0117]
突变体的活性检测；
[0118]
反应简式：r-苯乙胺 丙酮酸
→
苯乙酮 d-丙氨酸，将20mmol/l苯乙胺、20mmol/l丙酮酸、2mmol/l磷酸吡哆醛(plp)、缓冲液混合在40℃下反应30min，由于产物苯乙酮在245nm处有较大吸收峰，所以利用紫外分光光度计检测苯乙酮在245nm处的读值来判断苯乙酮的生成量。
[0119]
检测结果：如图9所示，结果显示突变体与发明的第一个发明的酶，具有相似的蛋白转胺活性。因此可以证明氨基酸序列具有95％以上同源性。
[0120]
以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。