受化学脱叶剂诱导的棉花启动子pghper21及其制备方法和应用
技术领域
1.本技术涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种受化学脱叶剂诱导的棉花启动子pghper21及其制备方法和应用。
背景技术：
2.棉花作为世界性重要经济作物之一，是重要战略物资。新疆是世界上最重要的棉花产区之一。为了解决棉花采摘劳动力的不足、采摘效率低下以及种植成本上升等诸多产业问题，采用机械化收获，而棉花化学脱叶剂技术正是为了促进叶片脱落用以提高机械化收获的便捷性，提高棉籽品质。
3.而在机采过程中，品种对脱叶剂的敏感程度是决定机采棉后续加工品质的关键因素。脱叶剂敏感品种喷施脱叶剂后，叶柄处迅速形成离层促进青叶脱落；而不敏感品种喷施脱叶剂后叶柄离层不形成或缓慢形成，叶片干枯但不脱落，机采棉含杂率较高；而目前生产上推广的多数品种，在吐絮期喷施脱叶剂之后，棉叶不脱落而干枯，且极易破碎，多数叶片黏附在棉絮或挂在棉株上而不易掉在地上，机采时破碎的棉叶极易混入棉花当中，难以清理干净导致“质降价低”的问题，这严重制约了新疆机采棉的发展。而棉花化学脱叶效果好坏与叶柄离层形成相关，因此加速棉花叶柄离层脱落细胞形成，离区断裂至关重要，通过组织特异性表达启动子诱导相关基因在特定组织部位表达成为关键。
4.植物中的启动子按照基因表达方式大致分为三种类型：组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子。目前棉花中广泛使用的是由在双子叶植物中表达效率相对较高的烟草花椰菜病毒(camv)35s启动子，作为组成型启动子在植物的各个组织器官高量表达。然而由于某些基因在组成型启动子驱动下会导致某些性状发生改变，影响植株的正常生长发育，因此诱导型启动子和特异性启动子则成了改良作物品质的最佳选择。
5.然而，迄今为止还未见有关响应棉花脱叶剂的组织特异性表达的诱导型启动子的研究报道。
技术实现要素：
6.本技术发明人创造性地公开了一种受化学脱叶剂诱导的棉花启动子pghper21及其制备方法和应用，通过将该启动子加入到棉花中，使得转基因材料能够提高棉花对脱叶剂的敏感性，加速脱落细胞形成，促进叶柄离层断裂，加速叶片脱落，为pghper21在助力机采棉育种方面提供了重要启动子资源。
7.为此，本技术实施例至少公开了以下技术方案：
8.第一方面，本技术实施例公开了一种受化学脱叶剂诱导的棉花启动子pghper21，其中，所述启动子pghper21具有如seq id no.1所示的核苷酸序列。
9.第二方面，本技术实施例公开了一种包含如第一方面所述的棉花启动子pghper21的核苷酸序列的表达盒。
10.第三方面，本技术实施例公开了一种包含如第一方面所述的棉花启动子pghper21的核苷酸序列的重组载体。
11.第四方面，本技术实施例公开了一种包含如第三方面所述的重组载体的转基因细胞系。
12.第五方面，本技术实施例公开了一种包含如第三方面所述的重组载体的重组微生物。
13.第六方面，本技术实施例公开了一种用于扩增如第一方面所述的棉花启动子pghper21的引物对，所述引物对包括：如seq id no.2所述的正向引物和如seq id no.3所述的反向引物。
14.第七方面，本技术实施例公开了一种如第一方面所述的棉花启动子pghper21的制备方法，包括如下步骤：以棉花全基因组dna为模板，利用引物对进行pcr扩增，
15.所述引物对包括：如seq id no.2所述的正向引物和如seq id no.3所述的反向引物。
16.第八方面，本技术实施例公开了一种如第一方面所述的棉花启动子pghper21及如第四方面所述的转基因细胞系在培育能增强脱叶剂响应的棉花中的应用。
17.与现有技术相比，本技术至少具有以下有益效果之一：
18.本技术通过qrt-pcr筛选并进一步确认了基因的组织表达模式，发现基因ghper21在不同组织中表达模式的差异，并对其启动子进行顺式作用元件分析，提供了一种启动子pghper21，可以用于机采棉研究，为促进棉花响应脱叶剂叶柄离层断裂相关基因转基因工作及育种工作提供重要启动子资源。
19.本技术构建的pghper21::gus和pghper21::ghckx3载体并转化棉花，对pghper21::gus转基因材料进行gus活性检测发现pghper21受到脱叶剂诱导后在叶柄离层组织特异性表达，对pghper21::ghckx3转基因材料进行形态学和细胞学考察发现，该转基因材料能够提高棉花对脱叶剂的敏感性，加速脱落细胞形成，促进叶柄离层断裂，加速叶片脱落。
20.本技术的pghper21在助力机采棉育种方面提供了重要启动子资源，ghckx3为解决机采棉脱叶问题提供重要功能基因资源。
附图说明
21.图1为本技术实施例提供的pghper21的筛选和表达模式分析图；其中，a为在不同组织中所示基因的表达模式；b为ghper21分别在水处理和脱叶剂处理前以及脱叶剂处理后第1、3和5天在叶柄离层的表达模式。
22.图2为本技术实施例提供的pghper21::gus棉花转基因进程重要时间节点记录；其中，a是下胚轴转入分化培养基后的愈伤组织；b和c是愈伤组织的分化；d是获得的转基因植株。
23.图3为本技术实施例提供的各转基因植株pcr阳性检测结果图；其中，
24.a是pghper21::gus、pghper21::ckx3和35s::gus的转基因棉花分别取8个种系(编号为1-8)进行pcr阳性检测图，pghper21::gus检测结果中，条带1、2、3、4、5、7、8对应的单株结果为阳性，分别命名为pper-1、pper-2、pper-3、pper-4、pper-5、pper-7、pper-8；
25.b是pghper21::ckx3检测结果，条带1、2、3、4、5、6、7、8对应的单株结果为阳性，分别命名为poe-1、poe-2、poe-3、poe-4、poe-5、poe-6、poe-7、poe-8；
26.c是35s::gus检测结果中，条带中1、3、4、5、6、7、8对应的单株结果为阳性，分别命名为gus-1、gus-3、gus-4、gus-5、gus-6、gus-7、gus-8。
27.图4为本技术实施例提供的幼苗时期和5叶期转基因及对照材料在脱叶剂处理前后的gus染色结果图。
28.图5为本技术实施例提供的受化学脱叶剂诱导后不同时间点，pghper21::gus转基因材料叶片和叶柄离层的gus表达模式以及pghper21::ghckx3转基因材料叶柄离层的ghckx3表达模式图。
29.图6为本技术实施例提供的pghper21::ghckx3转基因材料在脱叶剂处理前后不同时间点的表型及叶柄离层区的组织学染色图。
30.图7为本技术实施例提供的pghper21::ghckx3转基因材料脱叶剂处理前后不同时间点叶柄断裂带的细胞学形态观察图。
具体实施方式
31.为了使本技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本技术，并不用于限定本技术。本技术中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
32.需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，也不对其后的技术特征起到实质的限定作用。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
33.为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本技术中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
34.为解决现有技术中，暂无响应棉花脱叶剂的组织特异性表达的诱导型启动子的研究报道的缺点，本技术实施例公开了一种受化学脱叶剂诱导的棉花启动子pghper21，其中，所述棉花启动子pghper21具有如seq id no.1所示的核苷酸序列。
35.本技术实施例还公开了一种包含如上所述的棉花启动子pghper21的核苷酸序列的表达盒。
36.本技术实施例还公开了一种包含如上所述的棉花启动子pghper21的核苷酸序列的重组载体。
37.本技术实施例还公开了一种包含如上所述的重组载体的转基因细胞系。
38.本技术实施例还公开了一种包含如上所述的重组载体的重组微生物。
39.本技术实施例还公开了一种用于扩增如上所述的棉花启动子pghper21的引物对，所述引物对包括：如seq id no.2所述的正向引物和如seq id no.3所述的反向引物。
40.本技术实施例还公开了一种如上所述的棉花启动子pghper21的制备方法，包括如下步骤：以棉花全基因组dna为模板，利用引物对进行pcr扩增，
41.所述引物对包括：如seq id no.2所述的正向引物和如seq id no.3所述的反向引物。
42.此外，本技术实施例还公开了如上所述的棉花启动子pghper21及转基因细胞系在培育能增强脱叶剂响应的棉花中的应用。
43.在一些实施例中，所述应用具体包括如下步骤：
44.将上述受棉花化学脱叶剂诱导的棉花启动子pghper21连接于载体中，构建重组表达载体；
45.将所述重组表达载体转化到大肠杆菌或农杆菌gv3101菌株中进行表达，获得含有启动子pghper21基因的菌液；
46.将所述菌液转入到棉花细胞、组织或器官中。
47.在另一些实施例中，所述启动子pghper21在脱叶剂诱导下在棉花叶柄离层区特异性表达。
48.下面结合具体实施例进行说明。
49.一、pghper21的筛选及ghper21表达模式分析
50.通过前期化学脱叶剂敏感品种及不敏感品种脱叶剂处理的表达谱及棉花各组织表达谱数据，筛选出仅在叶柄离层中受脱叶剂处理诱导表达的基因，如图1中a所示；并从陆地棉基因组数据库中提取ghper21(ncbi登录号nc_053440)基因序列，以其特异区段设计引物对进行qrt-pcr验证其在脱叶剂喷施前后不同时间点的表达模式，如图1中b所示。
51.qrt-pcr步骤如下：
52.1.材料的种植及取样
53.使用对化学脱叶剂敏感材料x50和化学脱叶剂不敏感材料x33，种植于棉花温室，待植株长至吐絮期，将各系和对照分为两部分，一部分正常培养，另一部分涂抹浓度为1
‰
的脱叶剂(欣噻利)，在处理1、3、5天后分别取离层装入2ml离心管中，并迅速在液氮中冷冻，-80℃保存备用。
54.2.rna提取及反转录
55.表1反转录体系(25μl体系)
56.[0057][0058]
将步骤1中保存在-80℃的样品用液氮在研钵中磨样，使用天根公司的多糖多酚rna提取试剂盒提取植株叶片的总rna，具体操作参见试剂盒说明书(cat.#dp441,tiangen)。根据所得的rna浓度，取2μg rna进行反转录实验(如表1的反应体系)。向0.5ml离心管中加入2μg总rna和1μl oligo(dt)，补充depc水至15μl，混匀后，70℃变性5min，迅速放冰上静置5min，再向离心管加入其余试剂，用枪头吸打混匀，瞬时离心。将样品放置反转仪，设置程序：42℃，60min；70℃，15min。反应结束后用ddh2o将得到的cdna稀释10倍，-20℃保存备用。
[0059]
3.rt-pcr和qrt-pcr
[0060]
将步骤2中得到的cdna溶液稀释10倍，rt-pcr的反应总体系为20μl，体系成分如下：10μl cdna模板，2μl10
×
easytaq buffer，0.4μl 10mm dntps，0.2μl引物，0.2μl easytaq(5u)，补充ddh2o至20μl。进行pcr反应，产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
[0061]
其中，正向引物序列为：caccattgatttggtgctcgcc，如seq id no.4所示；反向引物序列为：acacaatgaactcgccctaccg，如seq id no.5所示。
[0062]
表2 rt-pcr程序设定
[0063]
项目温度(℃)持续时间(s)预变性95300变性9530退火58-6030延伸7230
[0064]
rt-pcr检测有结果后，同样使用稀释10倍的cdna溶液用作为模板，qrt-pcr反应体系成分如下：7.5μlcdna，0.5μl primer-f，0.5μl primer-r，9μl sybr green-mix(bio-rad)充分混匀。运行仪器abi 7500real-time pcr system(applied biosystems，美国)进行定量pcr分析。设置反应程序为95℃，30s，1cycle；95℃，5s；60℃，35s，40cycles。设置内参基因为棉花内源泛素酶基因ubiquitin，目的基因和内参基因均设置3个技术重复。采用δct的计算方法利用excel来计算相对表达量。其中，正向引物序列为：caccattgatttggtgctcgcc，如seq id no.4所示；反向引物序列为：acacaatgaactcgccctaccg，如seq id no.5所示。
[0065]
二、启动子pghper21序列的获得及顺式作用元件分析
[0066]
运用生物信息学手段对ghper21转录起始位点(atg)上游2000bp左右的区段进行顺式元件分析，其序列见序列seq id no.1所示。通过植物顺式调控元件、增强子和阻遏物的数据库plant care(http://www.dna.affrc.go.jp/place/signalscan.html)对2kb序列进行预测，结果显示ghper21启动子序列拥有脱落酸响应元件和许多光响应元件(表3)。而脱落酸作为一种能引起叶片脱落的植物激素，与棉花叶柄脱落相关。
[0067]
表3pghper21顺式作用元件分析
[0068][0069]
三、pghper21载体构建
[0070]
pghper21::gus载体的构建具体步骤如下：
[0071]
1.设计引物
[0072]
根据ghper21基因上游2kb启动子区域，运用软件primer5.0设计两端带attb接头的引物对，包括正向引物：ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgcatcagtctcagcctttagaagaca，如seq id no.2所示；反向引物ggggaccactttgtacaagaaagctgggtggttaagagtcatgtccttggattt，如seq id no.3所示。
[0073]
2.启动子序列pcr扩增
[0074]
以棉花jin668全基因组dna为模板，进行pcr扩增。
[0075]
(1)如下表4制备pcr反应体系
[0076]
表4pcr反应体系(20μl)
[0077][0078][0079]
(2)pcr程序设定
[0080]
设置pcr仪反应程序为：95℃，5min；95℃，60s；58℃，30s；72℃，30s，29cycles；72℃，5min。结束后，样品于4℃保存。
[0081]
(3)琼脂糖凝胶电泳检验扩增结果
[0082]
取6μl pcr产物点样，以5k的maker为对照，用0.8％1
×
tbe琼脂糖凝胶电泳进行检测，阳性条带对应的碱基对个数为引物设计时片段的长度。
[0083]
3.bp连接
[0084]
将bp反应体系置于室温下4～5h，反应体系(5μl)如表5所示。
[0085]
表5 bp反应体系
[0086]
试剂用量(μl)ddh2o2.5pcr产物1载体pdoner-zeo1bp clonase
tm
ii enzyme mix0.5
[0087]
4.转化大肠杆菌感受态(bp反应产物)
[0088]
将bp反应产物通过热激法转化至大肠杆菌感受态top10中。
[0089]
(1)将大肠杆菌感受态top10取出后，置于冰上等待融化。同时打开恒温水浴锅，调温至42℃。
[0090]
(2)将5μl的连接产物加入彻底融化的感受态中，用无菌枪头轻轻吸打混匀，冰上放置30min。
[0091]
(3)将感受态置于水浴锅中42℃热激90s，再冰上放置3分钟。加入200μl soc溶液，37℃摇床震荡活化40min，至菌液混匀。
[0092]
(4)吸取活化好的感受态200μl，均匀涂抹于lb固体培养基(含50μg/ml卡那霉素)平板表面，待吹干后，置于37℃培养箱中暗培养约12-16h。
[0093]
(5)取灭菌后的2ml离心管，加入600μl液体lb培养基(含50μg/ml卡那霉素)，挑取单克隆放入离心管中并吸打混匀，37℃摇床震荡培养4-5h，至菌液混匀。
[0094]
(6)每个单克隆取菌液1μl作为模板，用目标序列上游引物与载体下游引物检测阳性，其中，目标序列上游引物序列为：ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgcatcagtctcagcctttagaagaca，如seq id no.6所示；载体下游引物序列为：gcgatccagactgaatgccc，如seq id no.7所示。
[0095]
(7)选择阳性重组单克隆进行测序(擎科公司完成)，一个载体挑选3个单克隆。
[0096]
(8)将测序结果与原序列进行比对分析，每个基因选择1个序列正确的阳性重组单克隆，保证接头和目标片段序列准确无误。若序列都有错误，则重新选取阳性单克隆进行测序。2ml离心管摇菌5h，保存菌液(甘油终浓度15％-20％)，用用天根的快速质粒小提试剂盒提取质粒，具体操作见试剂盒说明书(cat.#dp105，tiangen)
[0097]
5.lr反应
[0098]
将lr反应体系置于室温下4～5h，反应体系如下(5μl)，如表6所示。
[0099]
表6 lr反应体系
[0100]
试剂用量(μl)ddh2o2.5上一步提取的质粒1载体pkgwfs71lr clonase
tm
ii plus enzyme mix0.5
[0101]
6.转化大肠杆菌感受态(lr反应产物)
[0102]
将lr反应产物通过热激法转化至大肠杆菌感受态top10中，将菌液涂抹在含有壮
观霉素(spe,100μg/ml)的lb固体平板上，选取单克隆检测阳性，选择三个阳性单克隆测序，对结果正确的菌液提取质粒并保菌
[0103]
7.启动子载体转化农杆菌
[0104]
使用电转法将上述质粒电转至农杆菌中，步骤如下：
[0105]
(1)枪头灭菌，离心管灭菌；
[0106]
(2)打开电转仪预热，将电压调为1800v；
[0107]
(3)依次用ddh2o、酒精清洗电转杯，并将电转杯置于紫外光消毒灯下灭菌10min，之后预冷；
[0108]
(4)将感受态农杆菌和之前提取的质粒各2μl混合，用无菌枪头混匀后加入电转杯空隙；
[0109]
(5)将电转杯放入仪器双击“pluse”即完成电转；
[0110]
(6)将400μl soc加入电转杯吸打混匀，吸取出混合均匀的菌液于两毫升无菌离心管中，活化菌液于28℃摇床，持续1h后取出100μl涂皿(用spe
的lb培养基)；将培养皿倒放入28℃恒温培养箱2d，挑单克隆、摇菌、阳性检测，用甘油保存于-80℃冰箱待用。
[0111]
pghper21::ckx3表达载体的构建过程如下：
[0112]
研究构建了pghper21::ckx3载体。pghper21::ckx3载体是在前期构建了35s::ckx3载体的情况下，通过infusion技术将35s替换成pghper21，步骤如下：
[0113]
1.35s::ckx3载体通过bp-lr方法构建，其中，使用到的正向引物为：
[0114]
ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgcatggctgtaagcttcccaat，如seq id no.8所示；
[0115]
反向引物为：ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgttaattgttattgaaaattc，如seq id no.9所示。
[0116]
2.设计酶切接头(stu1和spe1)引物扩增pghper21，其中，使用到的正向引物为：atgtatgataattcgagctcatcagtctcagcctttagaagaca，如seq id no.10所示，反向引物为：ttgtgatatcactagtgtccttggatttaatatatttttggt，如seq id no.11所示。
[0117]
3.sac1和spe1双酶切35s::ckx3载体质粒。
[0118]
4.infusion连接：
[0119]
向带盖的pcr管中依次加入infusion反应体系成分，将混合物轻轻混匀。37℃水浴30min，冰上放置5min，-20℃保存备用。
[0120]
表7 infusion体系
[0121]
试剂用量(μl)pcr产物1酶切后的35s::ckx3-3载体1exnase0.55
×
ce buffer1ddh2o1.5
[0122]
5.infusion反应产物热激转化至大肠杆菌感受态top10中。
[0123]
6.重组载体的阳性鉴定、测序及农杆菌转化。
[0124]
四、pghper21::gus和pghper21::ghckx3在棉花中的遗传转化
[0125]
供体材料为陆地棉品系(jin668)，选择饱满一致jin668种子，剥去种皮，用0.1％升汞溶液杀菌10-15min，期间不断摇动，再用无菌水冲洗种子3次，每次3-5min，将种子置于ms培养基表面。30℃暗培养1天后扶苗，继续暗培养4～5天。
[0126]
将含有pghper21::gus和pghper21::ghckx3载体的农杆菌gv3101菌株接种于2ml含100mg/l壮观霉素(spe )的lb液体和含100mg/l卡那霉素(k )的lb液体中，28℃震荡培养1天，活化好的菌液分别接20μl于20ml含100mg/l壮观霉素(spe )的新鲜液体lb和含100mg/l卡那霉素(k )的新鲜液体lb中，于28℃震荡培养过夜，吸取1ml浑浊菌液于2ml无菌离心管，8000rpm离心30s收集菌体，用20ml含50mg/l乙酰丁香酮(as)的mgl培养基(具体成分见后面描述)重新悬浮菌体，28℃振荡培养30min，用于侵染下胚轴。
[0127]
农杆菌介导的棉花下胚轴的转化具体步骤如下：
[0128]
在超净工作台中，取30株无菌苗，在无菌滤纸上将下胚轴切成0.7cm小段接入50ml无菌锥形瓶，分别加入活化好的含有目标载体pghper21::gus和pghper21::ghckx3的农杆菌菌液中，侵染3-5min，期间摇动数次；倒去菌液，将下胚轴置于无菌滤纸上吸干表面菌液，置于超净工作台吹10～15min后接入不含抗生素的2,4-d诱导培养基(具体成分见后面描述)上，在21℃黑暗条件下共培养36～48h；共培养结束后将下胚轴切段接入含卡那霉素(100mg/l)和头孢霉素(100mg/l)的2，4-d的诱导培养基(具体成分见后面描述)，在28℃弱光下培养；每月继代一次至出现胚性愈伤组织；将胚性愈伤陆续接入胚分化培养基(具体成分见后面描述)，继续每月继代一次至体细胞胚成熟，将成熟的子叶胚接入生根培养基(具体成分见后面描述)上萌发，直至获得完整植株。
[0129]
本实施例中所用的培养配方：
[0130]
mgl培养基：胰蛋白胨5g/l，nacl 5g/l，mgso4﹒7h2o 0.1g/l，kh2po4 0.25g/l，甘露醇5g/l，甘氨酸1g/l，用蒸馏水补充至1l。
[0131]
2,4-d诱导培养基：以ms为基础培养基，添加2,4-d 0.1mg/l，细胞激动素(kt)0.1mg/l，葡萄糖30g/l，phytagel 2.5g/l，用蒸馏水补充至1l。调ph至5.9。
[0132]
胚分化培养基：以ms为基础培养基，添加1.9g/l kno3，kt 0.1mg/l，葡萄糖30g/l，gln1.0g/l，asn 0.5g/l，phytagel 2.5g/l，用蒸馏水补充至1l。调ph至5.9。
[0133]
生根培养基：以1/2ms为基础培养基，添加葡萄糖15g/l，phytagel 2.5g/l，用蒸馏水补充至1l。调ph为5.9。
[0134]
上述培养基配方中所述的基础ms培养基配方为:大量元素(kno
3 1.9g/l，nh4no31.65g/l，kh2po
4 0.17g/l，mgso4﹒7h2o 0.37g/l，cacl2﹒2h2o 0.44g/l)，微量元素(ki 0.83mg/l，h3bo
3 6.2mg/l mnso4﹒4h2o 22.3mg/l，znso4﹒7h2o 8.6mg/l，na2moo4﹒2h2o0.25mg/l，cuso4﹒5h2o 0.025mg/l，cocl
2 0.025mg/l)，铁盐(na2﹒edta 37.3mg/l，feso4﹒7h2o 27.8mg/l)，有机成分(肌醇100mg/l，gly 2mg/l，vb1 0.1mg/l，vb6 0.5mg/l，vb5 0.5mg/l)。
[0135]
五、转基因植株pcr阳性鉴定
[0136]
对获得的t0代转基因植株进行pcr阳性鉴定，具体步骤如下：
[0137]
1.植株全基因组dna的提取(ctab法)。
[0138]
(1)准备工作：取等质量钢珠，用酒精清洗后纸巾擦干，用纸巾包裹放入通风橱；配置dna裂解液和dna抽提缓冲液；开启水浴锅，温度设定为65℃；
[0139]
(2)取样0.2g直接放入2ml离心管中，加入200μl dna抽提缓冲液和钢珠；60hz磨样机研磨90s；同时，将适量dna裂解液预热；
[0140]
(3)将研磨后的离心管打开，加入800μl预热的dna裂解液；放入水浴锅中进行裂解反应30min。期间，每10min将离心管轻轻上下颠倒几次，混匀；
[0141]
(4)取出置于通风橱内，加入氯仿800μl，用移液枪轻柔吸打20min以充分混匀。室温12000rmp离心10min；
[0142]
(5)取上清(约800μl)于新的离心管中，加800μl氯仿，用移液枪轻柔吸打20min以充分混匀。12000rmp离心10min；
[0143]
(6)重复上一步骤1-2次，最后将上清(800μl)加入1.5ml离心管中；
[0144]
(7)加入800μl异丙醇，用摇床或手动轻摇混匀，直至出现白色絮状物即为dna提取物；
[0145]
(8)倒掉上清，用75％酒精清洗两次，倒掉酒精并将离心管打开，置于通风橱内吹干，加入50μl双蒸水溶解，轻弹后加水定容至500μl，放入4℃冰箱保存。
[0146]
2.pcr扩增
[0147]
(1)以稀释10倍的dna样品为模板，以正向引物nptii-f：ttgtgcctgaagcgggaagg，如seq id no.12所示；反向引物nptii-r：cgataccgtaaagcacgaggaa，如seq id no.13所示；进行pcr扩增。pcr体系如表8所示。
[0148]
表8 pcr反应体系
[0149]
试剂用量(μl)ddh2o1610
×
buffer2dntp0.4npt
ⅱ‑
r0.25npt
ⅱ‑
f0.2easy-taq酶0.2dna模板1
[0150]
(2)pcr程序设定
[0151]
设置pcr仪反应程序为：95℃，5min；95℃，60s；58℃，30s；72℃，30s，28cycles；72℃，5min。结束后，样品于4℃保存。
[0152]
3.琼脂糖凝胶电泳检验扩增结果
[0153]
取6μl pcr产物点样，以5k的maker为对照，用0.8％1
×
tbe琼脂糖凝胶电泳进行检测，根据基因在位于引物对之间的长度确定阳性带大小。
[0154]
六、转基因棉花pghper21::gus在响应化学脱叶剂后gus染色
[0155]
对阳性单株进行种植，收获种子，获得t1代，对t1代转基因材料进行gus染色分析，结果如图4所示，具体步骤如下：
[0156]
1.卡那霉素筛选阳性单株及阴性株：将t0代获得的种子种植于卡那筛选培养基(无菌苗培养基加入200mg/l卡那霉素)上，第5天观察侧根的生长情况，若有侧根生长则为阳性，对应的植株进行后续染色实验和温室种植；若无侧根，则为阴性株，作为阴性对照。
[0157]
2.苗期不同组织的gus染色分析。各系和对照选两株幼苗，用小刀切割为根、下胚
轴、子叶三部分。其中，根注意保留侧根，尽量防止侧根折断，下胚轴取3段，长2-3mm，叶片防止弯折和机械损伤。将不同株系材料分别放入不同的离心管，做好标记后，加入适量的gus染液至浸没组织，然后放入37℃暗箱中恒温处理过夜(12-14h)。将gus染液回收并避光保存，以便重复使用；加入75％的酒精，浸没材料；于将上述逆境处理的无菌苗取出，37℃恒温箱中脱色1-2h；换酒精继续脱色，2-3次，若脱色效果不明显，继续处理多次或换用无水乙醇(100％)酒精脱色。将材料取出，擦去表面酒精放置于白色背景板上拍照。
[0158]
3.对5叶期植株进行gus组织化学染色。对阳性植株和阴性对照进行种植，在5叶期对植株进行脱叶剂处理。将各系和对照分为两部分，一部分正常培养，另一部分涂抹浓度为1
‰
的脱叶剂(脱吐隆)，24h后进行取样。各系和对照选两株植株，用小刀切割为根、下胚轴、叶片、离层四部分进行gus染色分析，gus组织化学定位法参照jefferson等(gus fusions:β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.embo j,1987,6:3901-3907)方法，将转化转基因植株的不同器官，组织放到gus染色液溶液中，37℃保温2h至过夜，经70％酒精脱色后faa固定保存在中，肉眼或在体式显微镜观察gus基因表达情况，然后在体式显微镜(leika mzflⅲ)下照相。gus染色液成分如下(100ml)：x-gluc 90mg、氯霉素10.0mg、0.1m磷酸钠缓冲液(ph 7.0)50ml、甲醇20％(v/v)，补足无菌水至100ml；组织固定液(faa)：70％乙醇90ml、5％醋酸5ml、38％甲醛5ml。
[0159]
图4中，选取pcr检测为阳性的其中一个pghper21::gus转基因株系pper-1进行gus染色定性实验，以35s::gus和阴性分离株为对照。35::gus转基因植株苗期组织着色明显，阴性植株无着色，pghper21::gus转基因植株在幼苗时期的子叶、下胚轴以及根部基本无染色；另外在5叶期的叶片、主茎、根部染色情况均与阴性对照相似，而在叶柄离层区相对于阴性对照而言有轻微染色，pghper21具有受化学脱叶剂诱导的组织特异性表达特性。
[0160]
七、转基因棉花pghper21::gus表达量及pghper21::ghckx3在响应脱叶剂后表型和表达量检测
[0161]
对pghper21::gus t1代转基因材料叶柄离层gus表达量和pghper21::ckx3t1代转基因棉花叶柄离层ghckx3表达量进行分析，如图5所示。
[0162]
图5中a和b是5叶期pghper21::gus转基因4个阳性株系植株进行脱叶剂处理和对照(水)处理，分别在叶片(图5a)和叶柄离层(图5b)部位取样，经过qrt-pcr检测gus在组织中的表达量。对比对照组和处理组的gus表达量，发现在叶片中，处理组的表达量基本低于对照组，并且表达量都很低。因此排除了启动子pghper21驱动基因在叶片中大量表达的可能。而在离层中，有两组处理组的表达量要明显高于对照组。说明pghper21很可能驱动gus在离层中特异表达。图5c是pghper21::ghckx3的其中两个阳性株系pghper21::ghckx3#11和pghper21::ghckx3#9叶柄离层中ghckx3的表达显著高于对照材料，说明pghper21能够驱动ghckx3在叶柄离层区表达；图5d是pghper21::ghckx3#11和pghper21::ghckx3#9脱叶剂处理前及处理后3、6、12、24、48、72h叶柄离层中ghckx3的表达量与对照相比有一定程度提高。
[0163]
1.样品的获得
[0164]
收获pghper21::gus的t0代植株的种子，种植于光照培养室中，待幼苗长至5叶期，将各系和对照分为两部分，一部分正常培养，另一部分涂抹浓度为1
‰
的脱叶剂(欣噻利)，24小时后分别取叶片和离层装入2ml离心管中，并迅速在液氮中冷冻，-80℃保存备用。
[0165]
对温室中生长至吐絮期的pghper21::ghckx3 t1代植株进行脱叶剂处理(浓度为1
‰
的欣噻利)。在处理前和处理后的3、6、12、24、48、72h分别对离层进行取样。
[0166]
2.rna提取及反转录同步骤一。
[0167]
3.rt-pcr和qrt-pcr同步骤一。
[0168]
对pghper21::ckx3t1代转基因棉花进行脱叶剂喷施前后表型考察。
[0169]
取样：对温室中生长至吐絮期的pghper21::ghckx3 t1代植株进行脱叶剂处理(浓度为1
‰
的欣噻利)。在处理前和处理后的3、6、12、24、48、72h分别对约6-9节位的叶柄离层组织进行取样，约0.5cm茎段用于组织染色，如图6所示。
[0170]
由图6中左图可以形象的看出在脱叶剂诱导情况下，pghper21::ghckx3转基因材料的脱叶情况明显早于jin668；右图组织切片也可以明显观察到pghper21::ghckx3#9株系在第48h叶柄离层脱落细胞开始活跃处于细胞松散状态即将形成断裂带。
[0171]
另外，对处于脱叶剂喷施前后不同时间点的6-9节位的叶柄进行人工手动去除叶柄，单面保护刀片取残留在棉花植株主体上的暴露面约0.1cm厚，置于2.5％戊二醛固定液中，真空泵抽真空15min，送样用于扫描电镜观察叶柄离层断裂面细胞形态，如图7所示。
[0172]
由扫描电镜结果可以观察到pghper21::ghckx3转基因株系在脱叶剂喷施后48h开始出现圆润未破裂的细胞，而对照材料jin668仍然呈现比较严重的细胞破碎；而在72h时，pghper21::ghckx3转基因株系包括维管束在内的区域均开始或绝大部分细胞均完整饱满，而jin668材料只是部分区域出现圆滑细胞形态，维管束部分并未开始。因此pghper21能够受到脱叶剂诱导在棉花叶柄离层区特异性表达。
[0173]
脱叶剂处理前后叶柄离层组织染色观察具体步骤：
[0174]
1、固定：70％faa固定液100ml：无水乙醇70ml，37％甲醛溶液10ml冰乙酸5ml加水定容至100ml。将需要固定的材料尽量剪小，加入预冷的固定液，固定液体积应不少于材料体积的10倍。将固定液放置于冰上抽真空15min，缓慢放气，再重复两次，直到材料沉底。抽完真空后更换新鲜的固定液，固定过夜。
[0175]
2、脱水
[0176]
脱水程序如表9所示。
[0177]
表9脱水程序
[0178]
乙醇溶液时长50％乙醇30min50％乙醇30min50％乙醇30min70％乙醇1h，可过夜也可长期保存85％乙醇1h95％乙醇1h以上，推荐过夜
[0179]
3、继续脱水透明
[0180]
继续脱水透明程序如表10所示。
[0181]
表10继续脱水透明程序
[0182]
溶液时长无水乙醇1h
无水乙醇1h3/4体积无水乙醇 1/4体积二甲苯1h1/2体积无水乙醇 1/2体积二甲苯1h1/4体积无水乙醇 3/4体积二甲苯1h二甲苯1h二甲苯1h
[0183]
4、浸蜡
[0184]
浸蜡程序如表11所示。
[0185]
表11浸蜡透明程序
[0186]
溶液温度时长二甲苯 约1/4体积碎蜡42℃过夜继续补碎蜡42℃1-2天纯蜡60℃3h纯蜡60℃3h纯蜡60℃3h，可过夜
[0187]
5、包埋
[0188]
根据样品预先叠好大小合适的纸盒，在电磁炉上熔好新鲜的石蜡于60℃的恒温箱中备用，包埋的液体石蜡温度不宜过高，避免烫坏组织。
[0189]
6、修块
[0190]
将蜡块从纸盒中取出来，从底下可以看到红色的样品，根据需要将样品蜡块修成横切或者纵切的方向，切片机刀片的切面要呈长方形，否则不易成蜡带。
[0191]
7、切片
[0192]
将修好的蜡块粘在长方形的底座上，并固定于切片机上，将蜡块平行于切片机的刀片，调整切片厚度，开始切片，用毛笔接蜡带，切好的蜡带平铺于干净的纸上。
[0193]
8、粘片和展片
[0194]
在干净的载玻片上涂抹10ul 0.1％的poly-l-lysine，37℃烘1个小时以上，完成后在载玻片上滴加蒸馏水，将蜡带切成小片段，平铺在载玻片上，使蜡带浮于蒸馏水上，将载玻片放于37-42℃的烘片机上烘片5分钟，蜡带展平后吸走多余的水，最后将载玻片置于切片盒中37-42℃烘1-2天。
[0195]
9、脱蜡和复水
[0196]
脱蜡和复水程序如表12所示。
[0197]
表12浸蜡透明程序
[0198]
[0199][0200]
10、染色
[0201]
用0.5％甲苯胺蓝(0.5g甲苯胺蓝溶解在100ml双蒸水中)染色约3min
[0202]
11、脱水透明
[0203]
用刚刚脱蜡和复水的染色缸中以相反的顺序进行，如表13所示。
[0204]
表13
[0205]
蒸馏水2min蒸馏水2min30％乙醇1min50％乙醇1min70％乙醇1min80％乙醇1min95％乙醇1min无水乙醇1min无水乙醇1min1/2二甲苯 1/2无水乙醇2min二甲苯5min二甲苯5min
[0206]
12、封片
[0207]
中性树胶(国药)和二甲苯等体积混匀作为封片剂，将切片从二甲苯中取出，滴加两滴封片剂，用镊子夹取一张干净的盖玻片缓慢盖在玻片上，避免产生气泡，在通风橱中吹1h以上，37-42℃恒温箱中过夜烘干。
[0208]
13、观察
[0209]
切片可于显微镜下观察拍照，或者在切片盒中长期保存。
[0210]
以上所述，仅为本技术较佳的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本技术揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。