1.本发明涉及一种多功能磁共振造影剂及其制备方法和应用，尤其涉及一种钆基共价有机框架磁共振造影剂及其制备方法和应用。
背景技术：
2.由于核磁共振成像mri的造影机理，其在软组织造影成像中有不可替代的作用，且作为一种非辐射成像方式，核磁共振成像对被测人损害非常微小，被认为是一种较为安全的临床成像手段，由于某些病灶难以在核磁共振中清晰地显示出来，在临床上核磁共振成像还需要造影剂辅助才能达到良好造影效果。mri造影剂能增加不同组织间的明暗对比，可以使病变组织与其周围环境之对比突显出来以更方便判断病灶情况，据统计，临床上约45％的核磁共振成像案例需要借助造影剂才能达到发现病灶的效果。稀土元素钆(gd)的原子中的4f电子轨道存在7个未成对的电子，使得钆具有非常大的磁力矩，可用作磁泡记忆装置中的媒体物质，也可用于信息储存。作为顺磁性的gd
3
离子，还可作为mri造影剂，然而游离的gd
3
离子毒性较大，不宜直接注射入活体动物中，目前临床上通常将gd
3
包裹在有机配体中，以此显著降低gd元素在体内的代谢速度并降低gd的毒性，如临床上最常用的核磁共振造影剂钆喷葡酸的衍生物。目前，临床上商用的钆喷葡酸衍生物通常只含一个钆原子，其弛豫率较低。根据所罗门-布罗伯根-摩根理论(solomon bloembergen morgan theory)，t1加权核磁共振造影剂的有效部分，具有高顺磁性的gd
3
离子，当多个gd
3
集中在一个分子的范围内，形成钆离子簇，则其能够达到协同作用。这种协同作用使得，造影剂溶液中的部分水分子可能既是直接受gd
3
离子与之配位影响的内界水分子，也是受与之相邻gd
3
离子影响的外界水分子，这种两个或多个gd
3
的共同作用，将能有效提高造影剂的纵向弛豫率，从而达到更好的造影效果。此外，分散在水中的造影剂单元在溶液中的整体翻转时间也将对造影剂的性能产生显著的影响，因此，将钆簇合物分子束缚在高分子层中，即形成高分子负载的钆簇合物纳米粒子，则更能够显著提高造影剂的造影能力。造影性能更优良的造影剂使得临床上一方面可以减少造影剂的使用量，在得到令人满意效果的同时降低造影剂中重金属对身体的毒害，另一方面，在使用相同的重金属的量时，多钆离子型造影剂能够达到更好的造影效果，从而为临床的诊断提供更加可靠的核磁共振图像。
3.虽然多gd
3
离子纳米造影剂表现出的弛豫率明显高于典型的gd
3
离子螯合剂，但没有表面修饰的纳米颗粒生物相容性和稳定性差，导致他们的应用有限。通过明确的聚合物的共价附着为gd的表面修饰提供了一种修饰和调整纳米颗粒弛豫特性的方法，使其具有更多的表面功能，也增加其体内稳定性和生物相容性。
4.可逆加成-碎片链转移(raft)聚合可以说是最通用的活性自由基聚合(lrp)技术。它已被广泛应用于制备先进生物医学应用的高度专业化材料。raft聚合物的另一个优点是在每个聚合物链的末端存在一个硫碳糖基硫基。文献表明，在亲核试剂存在的情况下，硫代硫基可以还原为硫醇，如伯胺或硼氢化钠。而硫醇已被证明与各种金属表面和半导体纳米颗粒的表面反应强烈，如金、银和硒化镉纳米颗粒表面。因此，利用巯基聚合物末端的硫与
钆的相互作用，将高分子修饰到钆基共价有机框架纳米材料表面，提高其生理稳定性和弛豫率。
技术实现要素：
5.本发明的目的是要改善gd基造影剂t1弛豫率较低的特点，以含氮高的四-(对氨基苯基卟啉)为单体，通过金属卟啉化学制备gd(iii)-卟啉，再通过氨基与含二醛基的化合物形成可逆的亚胺键连接的钆卟啉基共价有机框架聚合物造影剂gd-pcofs，使得一个造影剂分子包含多个gd离子，发挥协同作用，有效提高造影剂的纵向弛豫率。
6.用raft聚合物对gd-pcofs纳米颗粒的表面进行改性。通过raft聚合形成均聚物。通过raft聚合形成均聚物的一般聚合过程包括根据需要将单体、raft剂和溶剂添加到一个150ml的schlenk烧瓶中。将溶液脱气30min，然后置于高纯度的氮气气氛下。aibn被添加到第二个150ml的施伦克烧瓶中，经过三次疏散-清洗循环，然后留在高纯度的氮气气氛下，通过套管将单体溶液转移到含有引发剂的烧瓶中，并加热反应一段一定的时间。通过蒸发剩余单体和溶剂过夜，从聚合溶液中分离聚合物。此外，还采用十二烷基硫醇代替raft聚和物对gd-pcofs纳米颗粒表面进行修饰。获得的gd-pcofs顺磁性纳米材料，该材料粒径均一，分散性及水溶性良好、磁学性能优异。
7.本发明的另一目的在于提供上述gd基共价有机框架纳米材料的制备方法。
8.本发明的再一目的在于提供上述gd基共价有机框架纳米材料作为核磁共振造影剂的用途，作为核磁共振t1加权造影剂，所述顺磁性纳米粒子的使用量为0.01mmolgd/kg体重。
9.在一个1.0t的mri扫描仪(bruker icon，小动物活体磁共振成像系统)上进行了体外弛豫率的测量和小鼠肿瘤部位造影。表征了gd-pcofs纳米粒子和聚合物表面修饰的gd-pcofs纳米粒子的纵向弛豫时间(t1)和横向弛豫时间(t2)并与临床使用的造影剂的性能进行比较。t1计算扫描采用自旋回波成像，重复时间(tr)值为10000、8000、5000、2500、1000、500、250、150、150、100、30和25ms，最小回波时间(te)、5nm切片厚度、128
×
128矩阵和18cm视场。t2计算的扫描采用自旋回波成像，tr为1500，四种不同的te值分别为15、30、45和60ms，5nm切片厚度，128
×
128矩阵和18cm视场。所有样品，包括临床用造影剂，在去离子中连续稀释，用高纯氮气脱气，并用聚丙烯小瓶密封。分析通过感兴趣区域获取信号强度通过各个序列的(i)测量值进行分析。ii＝i
o，i
(1-exp
(-t/ti)
).
10.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
11.1、本发明通过金属卟啉化学，在卟啉分子上结合多个gd离子，再进一步合成20-80nm左右，亚胺键连接的钆卟啉基共价有机框架聚合物gd-pcofs纳米造影剂，相比于传统的小分子核磁共振造影剂，其在体内的保留时间更长，并能够利用实体肿瘤的高通透性和滞留效应，以实现在实体肿瘤部位的富集，获得显著的成像造影效果。然后通过一端含有巯基的分子对gd-pcofs表面进行修饰，得到粒径均匀且分散性良好的核磁共振造影剂。
12.2、本发明一个造影剂分子中含有多个钆离子，可以达到优异的核磁共振成像造影效果，一方面在使用同等钆量时成像效果更好，另一方面在达到同等成像效果时可以降低造影剂的使用量，减少重金属钆对人体的毒性。
附图说明
13.图1是本发明中gd-pcofs纳米造影剂电镜照片，具有良好结晶性的完整的长方形片状结构形貌，20-80纳米。
14.图2是本发明中聚n-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺修饰的gd-pcofs纳米造影剂的横向以及纵向弛豫率表征：a)phpma-gd-pcofs纳米造影剂，b)钆喷酸葡胺r1和r2。通过弛豫率表征发现，phpma-gd-pcofs纳米造影剂的纵向弛豫率(126.35s-1
mm-1
)是临床上使用的钆喷酸葡胺纵向弛豫率(10.49s-1
mm-1
)的约12倍，由此可知phpma-gd-pcofs纳米造影剂具有良好的t1加权核磁共振造影效果。
15.图3是本发明中聚(((聚乙二醇)甲基醚)丙烯酸酯-gd-pcofs纳米造影剂的动物t1加权磁共振造影效果图。通过此动物的t1加权磁共振造影效果图，可以在活体层次上说明ppegmea-gd-pcofs纳米造影剂具有良好的磁共振造影效果。
16.图4是本发明中聚丙烯酸酯-gd-pcofs纳米造影剂的动物t1加权核磁共振成像图中肿瘤处的亮度值在不同时间点的统计表。通过此表可以看到paa-gd-pcofs纳米造影剂对动物肿瘤的磁共振造影具有良好功效。
具体实施方式
17.本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
18.实施例1
19.gd-pcofs纳米粒子的制备，具体步骤为：
20.gd-tapp合成：在150ml三颈烧瓶中，加入50ml乙醇，然后称取67.4mg 5，10，15，20-四(4-氨基苯基)卟啉(4nh2tapp，0.1mmol)和49.2mg gdcl3·
6h2o(0.2mmol)加入其中，200℃回流4h。冷却后得到混合固体为未反应的gdcl3和gd-4tapp的混合物，用大量水溶解，离心(16000rpm
×
20min)并用去离子水洗涤3次，冷冻干燥得到gd-tapp(78.3mg，产率94.5％)。
21.gd-pcof的合成：称取49.9mg gd-4tapp(0.06mmol)和25.2mg联苯二甲醛(0.12mmol)置于pyrex管中，加入4ml混合溶剂(邻二氯苯∶正丁醇＝4∶1)，超声5min后，加入0.4ml6m醋酸，循环真空冻融三次，然后通过高温熔融封管，在120℃下反应3天。得到的红褐色固体通过四氢呋喃、二氯甲烷浸泡2天，冷冻干燥得到gd-pcof(50.3mg，产率71.1％)。
22.raft聚合物的合成：将n-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(8.50g)，加入叔丁醇(40.0ml)中，搅拌下加入2-(十二烷基硫基硫代羰基硫基)-2-甲基丙酸(0.100g)，2，2-偶氮二异丁腈(0.00450g)，在90℃下反应4h，得到(聚n-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺，phpma，转化率＝62.4％，mn，experimental＝19070g/mol).
23.gd-pcof的表面修饰
24.将hpma的raft聚合物(0.1g)加入50ml无水n，n-二甲基甲酰胺(dmf)中，放在150ml的烧瓶中搅拌直至生成均匀的溶液，然后加入0.5ml己胺，在室温下搅拌2h，将raft聚合物端转化为以巯基终止的聚合物端。将gd-pcofs纳米颗粒(0.01g)悬浮在另一个15ml的dmf中，放在另一个装有搅拌棒的150ml烧瓶中保持搅拌状态，然后将末端转化为巯基的raft均聚物溶液转移到gd-pcofs纳米颗粒溶液中。将得到的混合溶液在室温下搅拌24小时。通过
重复离心和dmf(2次)和乙醇(2次)中重复离心和再悬浮，从raft聚合物表面修饰的gd-pcofs纳米颗粒中去除未反应的聚合物，然后干燥得到最终的表面修饰的gd基造影剂。
25.实施例2
26.gd-pcofs纳米粒子的制备，具体步骤为：
27.gd-tapp合成：在150ml三颈烧瓶中，加入50ml乙醇，然后称取67.4mg 5，10，15，20-四(4-氨基苯基)卟啉(4nh2tapp，0.1mmol)和49.2mg gdcl3·
6h2o(0.2mmol)加入其中，200℃回流4h。冷却后得到混合固体为未反应的gdcl3和gd-4tapp的混合物，用大量水溶解，离心(16000rpm
×
20min)并用去离子水洗涤3次，冷冻干燥得到gd-tapp(78.3mg，产率94.5％)。
28.gd-pcof的合成：称取49.9mg gd-4tapp(0.06mmol)和25.2mg联苯二甲醛(0.12mmol)置于pyrex管中，加入4ml混合溶剂(邻二氯苯∶正丁醇＝4∶1)，超声5min后，加入0.4ml6m醋酸，循环真空冻融三次，然后通过高温熔融封管，在120℃下反应3天。得到的红褐色固体通过四氢呋喃、二氯甲烷浸泡2天，冷冻干燥得到gd-cof(50.3mg，产率71.1％)。
29.raft聚合物的合成：将n-异丙基丙烯酰胺(10.07g)，加入二甲基甲酰胺(50ml)中，搅拌下加入2-(十二烷基硫基硫代羰基硫基)-2-甲基丙酸(0.0698g)，2，2-偶氮二异丁腈(0.0290g)，在70℃反应24h，得到(聚n-异丙基丙烯酰胺，pnipam，转化率＝33％，m
n，experimental
＝18 023g/mol).
30.gd-pcof的表面修饰
31.将nipam的raft聚合物(0.1g)加入50ml无水n，n-二甲基甲酰胺(dmf)中，放在150ml的烧瓶中搅拌直至生成均匀的溶液，然后加入0.5ml己胺，在室温下搅拌2h，将raft聚合物端转化为以巯基终止的聚合物端。将gd-pcofs纳米颗粒(0.01g)悬浮在另一个15ml的dmf中，放在另一个装有搅拌棒的150ml烧瓶中保持搅拌状态，然后将末端转化为巯基的raft均聚物溶液转移到gd-pcofs纳米颗粒溶液中。将得到的混合溶液在室温下搅拌24小时。通过重复离心和dmf(2次)和乙醇(2次)中重复离心和再悬浮，从raft聚合物表面修饰的gd-pcofs纳米颗粒中去除未反应的聚合物，然后干燥得到最终的表面修饰的gd基造影剂。
32.实施例3
33.gd-pcofs纳米粒子的制备，具体步骤为：
34.gd-tapp合成：在150ml三颈烧瓶中，加入50ml乙醇，然后称取67.4mg 5，10，15，20-四(4-氨基苯基)卟啉(4nh2tapp，0.1mmol)和49.2mg gdcl3·
6h2o(0.2mmol)加入其中，200℃回流4h。冷却后得到混合固体为未反应的gdcl3和gd-4tapp的混合物，用大量水溶解，离心(16000rpm
×
20min)并用去离子水洗涤3次，冷冻干燥得到gd-tapp(78.3mg，产率94.5％)。
35.gd-pcof的合成：称取49.9mg gd-4tapp(0.06mmol)和25.2mg联苯二甲醛(0.12mmol)置于pyrex管中，加入4ml混合溶剂(邻二氯苯∶正丁醇＝4∶1)，超声5min后，加入0.4ml6m醋酸，循环真空冻融三次，然后通过高温熔融封管，在120℃下反应3天。得到的红褐色固体通过四氢呋喃、二氯甲烷浸泡2天，冷冻干燥得到gd-cof(50.3mg，产率71.1％)。
36.raft聚合物的合成：将聚(乙二醇)丙烯酸甲酯(12.8ml)，无水二氧六环(13.5ml)，2-(十二烷基硫基硫代羰基硫基)-2-甲基丙酸(0.096g)，2，2-偶氮二异丁腈(0.0024g)，在60℃下反应18h(聚(((聚乙二醇)甲基醚)丙烯酸酯)，ppegmea，转化率＝49％，m
n，experimental
＝19 042g/mol).
37.gd-pcof的表面修饰
38.将pegmea的raft聚合物(0.1g)加入50ml无水n，n-二甲基甲酰胺(dmf)中，放在150ml的烧瓶中搅拌直至生成均匀的溶液，然后加入0.5ml己胺，在室温下搅拌2h，将raft聚合物端转化为以巯基终止的聚合物端。将gd-pcofs纳米颗粒(0.01g)悬浮在另一个15ml的dmf中，放在另一个装有搅拌棒的150ml烧瓶中保持搅拌状态，然后将末端转化为巯基的raft均聚物溶液转移到gd-pcofs纳米颗粒溶液中。将得到的混合溶液在室温下搅拌24小时。通过重复离心和dmf(2次)和乙醇(2次)中重复离心和再悬浮，从raft聚合物表面修饰的gd-pcofs纳米颗粒中去除未反应的聚合物，然后干燥得到最终的表面修饰的gd基造影剂。
39.实施例4
40.gd-pcofs纳米粒子的制备，具体步骤为：
41.gd-tapp合成：在150ml三颈烧瓶中，加入50ml乙醇，然后称取67.4mg 5，10，15，20-四(4-氨基苯基)卟啉(4nh2tapp，0.1mmol)和49.2mg gdcl3·
6h2o(0.2mmol)加入其中，200℃回流4h。冷却后得到混合固体为未反应的gdcl3和gd-4tapp的混合物，用大量水溶解，离心(16000rpm
×
20min)并用去离子水洗涤3次，冷冻干燥得到gd-tapp(78.3mg，产率94.5％)。
42.gd-pcof的合成：称取49.9mg gd-4tapp(0.06mmol)和25.2mg联苯二甲醛(0.12mmol)置于pyrex管中，加入4ml混合溶剂(邻二氯苯∶正丁醇＝4∶1)，超声5min后，加入0.4ml6m醋酸，循环真空冻融三次，然后通过高温熔融封管，在120℃下反应3天。得到的红褐色固体通过四氢呋喃、二氯甲烷浸泡2天，冷冻干燥得到gd-cof(50.3mg，产率71.1％)。
43.raft聚合物的合成：将丙烯酸(20.0ml)，二甲基甲酰胺(45.5ml)，2-(十二烷基硫基硫代羰基硫基)-2-甲基丙酸(0.762g)，2，2-偶氮二异丁腈(0.0343g)，在70℃反应24h(聚丙烯酸酯，paa，转化率＝94％，m
n，experimental
＝12 856g/mol).
44.gd-pcof的表面修饰
45.将aa的raft聚合物(0.1g)加入50ml无水n，n-二甲基甲酰胺(dmf)中，放在150ml的烧瓶中搅拌直至生成均匀的溶液，然后加入0.5ml己胺，在室温下搅拌2h，将raft聚合物端转化为以巯基终止的聚合物端。将gd-pcofs纳米颗粒(0.01g)悬浮在另一个15ml的dmf中，放在另一个装有搅拌棒的150ml烧瓶中保持搅拌状态，然后将末端转化为巯基的raft均聚物溶液转移到gd-pcofs纳米颗粒溶液中。将得到的混合溶液在室温下搅拌24小时。通过重复离心和dmf(2次)和乙醇(2次)中重复离心和再悬浮，从raft聚合物表面修饰的gd-pcofs纳米颗粒中去除未反应的聚合物，然后干燥得到最终的表面修饰的gd基造影剂。
46.实施例5
47.gd-pcofs纳米粒子的制备，具体步骤为：
48.gd-tapp合成：在150ml三颈烧瓶中，加入50ml乙醇，然后称取67.4mg 5，10，15，20-四(4-氨基苯基)卟啉(4nh2tapp，0.1mmol)和49.2mg gdcl3·
6h2o(0.2mmol)加入其中，200℃回流4h。冷却后得到混合固体为未反应的gdcl3和gd-4tapp的混合物，用大量水溶解，离心(16000rpm
×
20min)并用去离子水洗涤3次，冷冻干燥得到gd-tapp(78.3mg，产率94.5％)。
49.gd-pcof的合成：称取49.9mg gd-4tapp(0.06mmol)和25.2mg联苯二甲醛
(0.12mmol)置于pyrex管中，加入4ml混合溶剂(邻二氯苯∶正丁醇＝4∶1)，超声5min后，加入0.4ml6m醋酸，循环真空冻融三次，然后通过高温熔融封管，在120℃下反应3天。得到的红褐色固体通过四氢呋喃、二氯甲烷浸泡2天，冷冻干燥得到gd-cof(50.3mg，产率71.1％)。
50.gd-pcof的表面修饰：用十二烷基硫醇(1.00ml)代替raft聚合物对gd-pcofs纳米颗粒表面进行修饰。
51.表1临床磁共振成像造影剂、未表面修饰和聚合物表面修饰钆基共价有机框架磁共振造影剂r1、r2、r2/r1
52.样品钆喷酸葡胺gd-pcof实施例1实施例2实施例3实施例4实施例5r1(s-1
mm-1
)10.4917.23126.3588.4595.1237.205.92r2(s-1
mm-1
)16.6825.32155.41113.15129.3644.1725.75r2/r11.591.471.231.281.361.194.35