一种生产fr901379衍生物的基因工程菌及其应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种生产fr901379衍生物的基因工程菌及其应用，所述基因工程菌为失活编码α-酮戊二酸依赖性氧化酶和/或p450单加氧酶的基因的丝状真菌。本发明还涉及利用所述基因工程菌生产的fr901379衍生物。
背景技术：
2.米卡芬净是一种棘白霉素类抗生素，于2006年fda批准上市，主要用于治疗深部真菌感染。棘白霉素类化合物通过非竞争性抑制细胞壁1,3-β葡聚糖合酶的活性来抑制真菌细胞壁的合成，具有良好的抗真菌活性及毒副作用小的优点。但目前棘白霉素类药物仅有三种，分别是米卡芬净，卡泊芬净和阿尼芬净，对于深部真菌感染的治疗用药较少，因此迫切需要发现更多具有活性的棘白霉素类化合物。
3.fr901379是合成米卡芬净的关键前体，由丝状真菌coleophoma empetri f-11899产生，其结构式为：
4.其生物合成机制尚无报道。
5.纽莫康定b0(pneumocandin b0，pb0)是合成卡泊芬净的关键前体，由丝状真菌glarea lozoyensis产生，其生物合成途径已报道；ecb(echinocandin b)是合成阿尼芬净的关键前体，由丝状真菌aspergillus pachycristatus产生，其生物合成途径也已报道。三种化合物都是通过pks和nrps途径合成的环脂肽类化合物。
技术实现要素：
6.为了解决现有技术中需要发现更多具有生物活性的棘白霉素类衍生物，提供了一种生产fr901379衍生物的基因工程菌及其应用。
7.本发明在丝状真菌coleophoma empetri f-11899中利用crispr/cas9的方法对参与fr901379合成的基因进行敲除，验证了基因的功能，同时获得了一系列具有生物活性的衍生物，该类衍生物具有一定的成药潜在价值。
8.为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之一为：一种基因工程菌，所述基因工程菌在出发菌丝状真菌coleophoma empetri中失活编码α-酮戊二酸依赖性氧化酶和/或p450单加氧酶的基因，其中所述α-酮戊二酸依赖性氧化酶为ceoxy1或ceoxy4，所述p450单
加氧酶为cep450-1、cep450-2或cep450-3。
9.在本发明一些优选实施方案中，所述出发菌为coleophoma empetri f-11899，和/或，所述ceoxy1的氨基酸序列如seq id no:24所示，和/或，所述ceoxy4的氨基酸序列如seq id no:26所示，和/或，所述cep450-1的氨基酸序列如seq id no:28所示，和/或，所述cep450-2的氨基酸序列如seq id no:30所示，和/或，所述cep450-3的氨基酸序列如seq id no:32所示。
10.在本发明一些优选实施方案中，编码所述ceoxy1的核苷酸序列如seq id no:25所示，和/或，编码所述ceoxy4的核苷酸序列如seq id no:27所示，和/或，编码所述cep450-1的核苷酸序列如seq id no:29所示，和/或，编码所述cep450-2的核苷酸序列如seq id no:31所示，和/或，编码所述cep450-3的核苷酸序列如seq id no:33所示。
11.为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之二为：一种如技术方案之一所述的基因工程菌的构建方法，所述构建方法为在出发菌中使如技术方案之一中所定义的编码α-酮戊二酸依赖性氧化酶和/或p450单加氧酶的基因失活。
12.在本发明一些优选实施方案中，所述失活为在所述出发菌中导入cas9系统和靶向如技术方案之一中所定义的编码α-酮戊二酸依赖性氧化酶和/或p450单加氧酶的基因的sgrna表达盒。
13.在本发明一些具体实施方案中，所述导入的方法为通过农杆菌介导法导入相应的质粒。
14.在本发明一些具体实施方案中，所述cas9系统包含编码cas9酶的基因，所述sgrna表达盒包含能够特异性识别目的基因的n20片段。
15.在本发明一些具体实施方案中，所述sgrna表达盒由5s rrna作为启动子，引导n20片段和sgrna的转录。
16.在本发明一些具体实施方案中，通过导入质粒pdht/sk-pc导入所述cas9系统；通过导入敲除质粒导入所述sgrna表达盒。
17.在本发明一些具体实施方案中，所述敲除质粒还包含抗性基因表达盒，所述抗性基因表达盒为g418抗性基因表达盒，所述g418抗性基因表达盒包含trpc启动子片段、trpc终止子片段和g418抗性基因neo片段；所述敲除质粒的骨架为pag1-h3。
18.在本发明一些优选实施方案中，所述编码cas9酶的基因的核苷酸序列如seq id no:38所示；和/或，所述n20片段的核苷酸序列如seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4和/或seq id no:5所示。
19.为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之三为：一种fr901379衍生物，所述fr901379衍生物的结构如式i所示：
[0020][0021]
r1为h；r2、r4和r5独立地为h或oh；r3为c
1-6
烷基或h(优选为甲基)；r6为h或x
为一价阳离子；
[0022]
或，r3为h；r1、r2、r4和r5独立地为h或oh；r6为h或x
为一价阳离子；
[0023]
或，r1、r2和r4为oh；r3为c
1-6
烷基；r5和r6为h；
[0024]
带“*”的碳原子独立地为手性碳原子或非手性碳原子，当为手性碳原子时，独立地为r构型和/或s构型。
[0025]
在某一方案中，所述x
为na
、k
或nh
4
，例如为na
。
[0026]
在某一方案中，r3中，所述c
1-6
烷基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基；优选为甲基。
[0027]
在某一方案中，所述fr901379衍生物的结构如式i-1所示：
[0028][0029]
在某一方案中，r1为h；r2为oh；r3为甲基；r4为h；r5为h；r6为oso3na。
[0030]
在某一方案中，r1为oh；r2为oh；r3为h；r4为oh；r5为oh；r6为oso3na。
[0031]
在某一方案中，r1为oh；r2为oh；r3为h；r4为oh；r5为h；r6为oso3na。
[0032]
在某一方案中，r1为oh；r2为h；r3为h；r4为oh；r5为h；r6为oso3na。
[0033]
在某一方案中，r1为h；r2为h；r3为甲基；r4为oh；r5为h；r6为oso3na。
[0034]
在某一方案中，r1为oh；r2为oh；r3为甲基；r4为oh；r5为h；r6为h。
[0035]
在某一方案中，所述fr901379衍生物为以下任一化合物：
[0036][0037]
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之四为：一种制备fr901379衍生物的方法，所述方法包括在发酵培养基中培养如技术方案之一所述的基因工程菌，使其表达产生fr901379衍生物；所述fr901379衍生物为如技术方案之三所定义，或为fr901381或fr901382。
[0038]
在本发明一些具体实施方案中，所述发酵培养基的ph值为6.0～7.0，和/或，所述
发酵培养基包含80～120g/l甘露醇，4～6g/l棉籽饼粉，8～12g/l黄豆饼粉，3～5g/l k2hpo4和0.8～1.2g/l caco3；和/或，所述培养的温度为23～27℃，和/或，所述培养的转速为200～240rpm，和/或，所述培养的时间为8～12天。
[0039]
在本发明一些优选实施方案中，所述发酵培养基的ph值为6.5；所述甘露醇浓度为100g/l，所述棉籽饼粉浓度为5g/l，所述黄豆饼粉浓度为10g/l，所述k2hpo4浓度为4g/l，所述caco3浓度为1g/l；所述温度为25℃；所述转速为220rpm；所述时间为10天。
[0040]
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之五为：如技术方案之一所述的基因工程菌在生产fr901379衍生物中的应用，所述fr901379衍生物如技术方案之三所定义，或所述fr901379衍生物为fr901381或fr901382。
[0041]
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0042]
本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0043]
本发明的积极进步效果在于：
[0044]
本发明在丝状真菌coleophoma empetri f-11899中利用crispr/cas9的方法对参与fr901379合成的基因进行敲除，验证了基因的功能，获得了具有生产fr901379衍生物功能的基因工程菌。同时还获得了一系列具有生物活性的衍生物，该类衍生物具有一定的成药潜在价值。
附图说明
[0045]
图1为对照菌株ce-pc、工程菌株c.e(δceoxy1)、工程菌株c.e(δceoxy4)、工程菌株c.e(δcep450-1)、工程菌株c.e(δcep450-2)、工程菌株c.e(δcep450-3)的发酵产物的hplc图谱。
[0046]
图2为对照菌株ce-pc、工程菌株c.e(δceoxy2)的hplc图谱。
[0047]
图3为对照菌株ce-pc、工程菌株c.e(δceoxy3)的hplc图谱。
具体实施方式
[0048]
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0049]
本发明敲除菌株的构建：
[0050]
首先将含有cas9基因(seq id no:38)的质粒pdht/sk-pc通过农杆菌介导(agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,amt)的方法导入出发菌株coleophoma empetri f-11899，获得工程菌株ce-pc。
[0051]
在质粒pagg的基础上利用分子克隆方法构建用于基因敲除的sgrna表达盒子，该表达盒子由5s rrna作为启动子，引导n20和sgrna的转录，n20为用于敲除目的基因的20bp的靶基因序列。对于不同的目的基因，设计的n20如下表1：
[0052]
表1
[0053][0054]
将构建好的敲除质粒导入工程菌株ce-pc中，挑取转化子，对转化子进行pcr验证筛选，对得到的敲除菌株进行发酵培养，hplc检测发酵产物，lc-ms分析产物的分子量。
[0055]
最后，将本专利中的所有化合物进行抗真菌活性检测。
[0056]
本发明所用的菌株、质粒、试剂、仪器及hplc检测方法：
[0057]
菌株aspergillus pachycristatus nrrl11440购自于nrrl菌种保藏中心。用于amt的agrobacterium tumefaciens lba4404感受态购自唯地生物公司。质粒pag1-h3来自于中国科学院微生物研究所。pdht/sk-pc来自于中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所合成生物学元件与数据库研究组。
[0058]
本发明中使用的dna胶回收纯化试剂盒和质粒提取试剂盒购自上海生工，反转录试剂盒、pcr酶及所有限制性内切酶都购自takara公司，同源重组试剂盒(clonexpress ii one step cloning kit)购自vazyme公司，色谱纯的乙腈购自amethyst chemicals公司，其他常规试剂均为国产分析纯或进口分装。
[0059]
本发明中使用的恒温发酵摇床购自上海世平实验设备有限公司，1200型高效液相色谱仪购自agilent technologies公司。
[0060]
本发明所用的培养基
[0061]
1、液体lb培养基(1l)
[0062]
蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl 10g，蒸馏水1l；121℃灭菌20分钟。
[0063]
2、固体lb培养基(1l)
[0064]
蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl 10g，琼脂粉20g；121℃灭菌20分钟。
[0065]
3、ppy培养基(1l)：高聚蛋白胨20g，酵母提取物20g，马铃薯肉汤培养基20g。
[0066]
4、诱导液体培养基(im):0.8ml k buffer，20ml mn buffer,1ml 1％cacl2·
2h2o,10ml 0.01％feso4·
7h2o,5ml微量元素，2.5ml 20％硝酸铵，10ml 50％甘油，40ml1m mes，10ml 20％葡萄糖，加905.7ml无菌水。
[0067]
培养基中所用溶液：
[0068]
1％cacl2·
2h2o：称取1g cacl2·
2h2o,加水定容至100ml，使用前需灭菌。
[0069]
0.01％feso4·
7h2o：称取0.01g feso4·
7h2o，加水定容至100ml，使用前需过滤除菌。
[0070]
20％葡萄糖：称取20g葡萄糖，加水定容至100ml，使用前需灭菌。
[0071]
50％甘油：量取50ml的甘油，与50ml的水混匀，使用前需灭菌。
[0072]
20％硝酸铵：称取20g硝酸铵，加水定容至100ml，使用前需灭菌。
[0073]
k buffer：将1.25m k2hpo4·
3h2o加入1.25m k2hpo4至ph为4.8，使用前需灭菌。
[0074]
mn buffer：称取3g mgso4·
7h2o和1.5g nacl，加水定容至100ml，使用前需灭菌。
[0075]
微量元素：称取10mg znso4·
7h2o,10mg cuso4·
5h2o,10mg h3bo3,10mg mnso4·
h2o,10mg namoo4·
2h2o，加水定容至100ml，使用前需灭菌。
[0076]
1m mes：称取10.66g mes，溶解于水中，调节ph至5.3，定容至50ml。保存于-20℃冰箱中，使用前需过滤除菌。
[0077]
0.2m as：称取785mg的as，溶解于dmso中，定容至20ml，避光保存于20℃冰箱中，使用前需过滤除菌。
[0078]
5、诱导固体培养基：向以灭菌的含2％琼脂粉的无菌水中加0.8ml k buffer，20ml mn buffer,1ml 1％cacl2·
2h2o,10ml 0.01％feso4·
7h2o,5ml微量元素，2.5ml 20％硝酸铵，10ml 50％甘油，40ml 1m mes，10ml 20％葡萄糖。
[0079]
6、种子培养基配方(1l)：
[0080]
葡萄糖20g，黄豆饼粉10g，kh2po
4 2g，ph值为6.5；121℃灭菌20分钟。
[0081]
7、发酵培养基配方(1l)：
[0082]
甘露醇100g，棉籽饼粉5g，黄豆饼粉10g，k2hpo
4 4g，caco
3 1g，ph值为6.5；121℃灭菌20分钟。
[0083]
本发明中的hplc检测方法为：
[0084]
hplc液相检测方法：
[0085]
流动相：50％乙腈和50％水(含0.5％nah2po4)；
[0086]
色谱柱：c18 4.6
×
250nm；
[0087]
流速：1ml/min；
[0088]
检测波长：210nm；
[0089]
柱温：30℃；
[0090]
进样量：20μl。
[0091]
本发明所用引物的碱基序列见下表2，其中-f表示上游引物，-r表示下游引物。
[0092]
表2
[0093]
[0094][0095]
实施例1ceoxy1的基因敲除及产物分析
[0096]
本实施例敲除的ceoxy1的基因的氨基酸序列如seq id no:24所示，其核苷酸序列如seq id no:25所示。
[0097]
1、质粒构建：
[0098]
(1)pagg及pagg-sgrna-ceoxy1的构建
[0099]
以pag1-h3为模板，用引物ptrpc-f/r(本实施例使用的引物的碱基序列见表2)进行pcr得到trpc启动子片段(片段1)。以质粒pegfp-n2为模板，用引物neor-f/r进行pcr得到g418抗性基因neo片段(片段2)。以pag1-h3为模板，用引物ttrpc-f/r进行pcr，得到trpc终止子片段(片段3)。以pcr片段1，片段2，片段3为模板，用引物ptrpc-f和ttrpc-r进行重叠pcr，得到g418抗性基因表达盒，将该表达盒连接至hindiii/spei线性化的pag1-h3载体上，最终得到质粒pag1-hg。pag1-hg利用ecori单切后自连得到pagg。
[0100]
以coleophoma empetri f-11899基因组为模板，5s-f/r为引物，pcr得到5s rrna片段。用n20-ceoxy1-f和sgrna-r为引物，pcr得到可特异性识别ceoxy1的sgrna片段。以5s rrna片段和sgrna片段作为模板，用5s-f和sgrna-r为引物进行重叠pcr，得到sgrna表达盒。将该表达盒利用同源重组试剂盒(clonexpress ii one step cloning kit)连接至bglii/ecori酶切处理的pagg线性载体，得到敲除质粒pagg-sgrna-ceoxy1。
[0101]
2、敲除菌株的构建
[0102]
利用amt，将质粒pagg-sgrna-ceoxy1导入ce-pc菌株中，筛选得到工程菌株c.e(ceoxy1)。
[0103]
3、工程菌株c.e(ceoxy1)的发酵
[0104]
为了检测工程菌株c.e(δceoxy1)的发酵产物，将其接种于20ml种子培养基中，25
℃，220rpm，培养4d，按10％接种量接种到30ml发酵培养基中，25℃，220rpm，培养10天。
[0105]
4、hplc检测
[0106]
利用反向hplc(安捷伦)检测发酵产物：取2ml发酵液，加8ml丙酮充分混匀，超声震荡30min，过滤后得滤液进行检测，结果如图1所示。
[0107]
结果显示：工程菌株c.e(ceoxy1)的发酵产物化合物1的分子量为1149，经分析化合物1的结构为：
[0108][0109]
5、抗真菌活性：活性结果见下表3，由结果可知，化合物1有抗真菌活性。
[0110]
实施例2ceoxy4的基因敲除及产物分析
[0111]
本实施例敲除的ceoxy4的基因的氨基酸序列如seq id no:26所示，其核苷酸序列如seq id no:27所示。
[0112]
1、质粒构建：
[0113]
(1)pagg-sgrna-ceoxy4的构建
[0114]
以coleophoma empetri f-11899基因组为模板，5s-f/r为引物，pcr得到5s rrna片段。用n20-ceoxy4-f和sgrna-r为引物，pcr得到可特异性识别ceoxy4的sgrna片段。以5s rrna片段和sgrna片段作为模板，用5s-f和sgrna-r为引物进行重叠pcr，得到sgrna表达盒。将该表达盒利用同源重组试剂盒(clonexpress ii one step cloning kit)连接至bglii/ecori酶切处理的pagg线性载体，得到敲除质粒pagg-sgrna-ceoxy4。
[0115]
2、敲除菌株的构建
[0116]
利用amt，将质粒pagg-sgrna-ceoxy4导入ce-pc菌株中，筛选得到工程菌株c.e(δceoxy4)。
[0117]
3、工程菌株c.e(δceeoxy4)的发酵
[0118]
为了检测工程菌株c.e(δceoxy4)的发酵产物，将其接种于20ml种子培养基中，25℃，220rpm，培养4d，按10％接种量接种到30ml发酵培养基中，25℃，220rpm，培养10天。
[0119]
4、hplc检测
[0120]
利用反向hplc(安捷伦)检测发酵产物：取2ml发酵液，加8ml丙酮充分混匀，超声震荡30min，过滤后得滤液进行检测，结果如图1所示。
[0121]
结果显示：工程菌株c.e(δceoxy4)的发酵产物化合物2、3、4的分子量分别为1160、1144、1128，经分析化合物2的结构为：
[0122][0123]
经分析化合物3的结构为：
[0124][0125]
经分析化合物4的结构为：
[0126][0127]
5、抗真菌活性：活性结果见下表3，由结果可知，化合物2、3、4均有抗真菌活性。
[0128]
实施例3cep450-1的基因敲除及产物分析
[0129]
本实施例敲除的cep450-1的基因的氨基酸序列如seq id no:28所示，其核苷酸序列如seq id no:29所示。
[0130]
1、质粒构建：
[0131]
(1)pagg-sgrna-cep450-1的构建
[0132]
以coleophoma empetri f-11899基因组为模板，5s-f/r为引物，pcr得到5s rrna片段。用n20-cep450-1-f和sgrna-r为引物，pcr得到可特异性识别cep450-1的sgrna片段。以5s rrna片段和sgrna片段作为模板，用5s-f和sgrna-r为引物进行重叠pcr，得到sgrna表达盒。将该表达盒利用同源重组试剂盒(clonexpress ii one step cloning kit)连接至bglii/ecori酶切处理的pagg线性载体，得到敲除质粒pagg-sgrna-cep450-1。
[0133]
2、敲除菌株的构建
[0134]
利用amt，将质粒pagg-sgrna-cep450-1导入ce-pc菌株中，筛选得到工程菌株c.e(δcep450-1)。
[0135]
3、工程菌株c.e(δcep450-1)的发酵
[0136]
为了检测工程菌株c.e(δcep450-1)的发酵产物，将其接种于20ml种子培养基中，25℃，220rpm，培养4d，按10％接种量接种到30ml发酵培养基中，25℃，220rpm，培养10天。
[0137]
4、hplc检测
[0138]
利用反向hplc(安捷伦)检测发酵产物：取2ml发酵液，加8ml丙酮充分混匀，超声震荡30min，过滤后得滤液进行检测，结果如图1所示。
[0139]
结果显示：工程菌株c.e(δcep450-1)的发酵产物分别为fr901381和fr901382，分子量分别为1158、1142，经分析fr901381的结构为：
[0140][0141]
经分析fr901382的结构为：
[0142][0143]
5、抗真菌活性：活性结果见下表3，由结果可知，fr901381和fr901382均有抗真菌活性。
[0144]
实施例4cep450-2的基因敲除及产物分析
[0145]
本实施例敲除的cep450-2的基因的氨基酸序列如seq id no:30所示，其核苷酸序列如seq id no:31所示。
[0146]
1、质粒构建：
[0147]
(1)pagg-sgrna-cep450-2的构建
[0148]
以coleophoma empetri f-11899基因组为模板，5s-f/r为引物，pcr得到5s rrna片段。用n20-cep450-2-f和sgrna-r为引物，pcr得到可特异性识别cep450-2的sgrna片段。以5s rrna片段和sgrna片段作为模板，用5s-f和sgrna-r为引物进行重叠pcr，得到sgrna表达盒。将该表达盒利用同源重组试剂盒(clonexpress ii one step cloning kit)连接至bglii/ecori酶切处理的pagg线性载体，得到敲除质粒pagg-sgrna-cep450-2。
[0149]
2、敲除菌株的构建
[0150]
利用amt，将质粒pagg-sgrna-cep450-2导入ce-pc菌株中，筛选得到工程菌株c.e(δcep450-2)。
[0151]
3、工程菌株c.e(δcep450-2)的发酵
[0152]
为了检测工程菌株c.e(δcep450-2)的发酵产物，将其接种于20ml种子培养基中，25℃，220rpm，培养4d，按10％接种量接种到30ml发酵培养基中，25℃，220rpm，培养10天。
[0153]
4、hplc检测
[0154]
利用反向hplc(安捷伦)检测发酵产物：取2ml发酵液，加8ml丙酮充分混匀，超声震荡30min，过滤后得滤液进行检测，结果如图1所示。
[0155]
结果显示：工程菌株c.e(δcep450-2)的发酵产物化合物5分子量为1126，经分析化合物5的结构为：
[0156][0157]
5、抗真菌活性：活性结果见下表3，由结果可知，化合物5有抗真菌活性。
[0158]
实施例5cep450-3的基因敲除及产物分析
[0159]
本实施例敲除的cep450-3的基因的氨基酸序列如seq id no:32所示，其核苷酸序列如seq id no:33所示。
[0160]
1、质粒构建：
[0161]
(1)pagg-sgrna-cep450-3的构建
[0162]
以coleophoma empetri f-11899基因组为模板，5s-f/r为引物，pcr得到5s rrna片段。用n20-cep450-3-f和sgrna-r为引物，pcr得到可特异性识别cep450-3的sgrna片段。以5s rrna片段和sgrna片段作为模板，用5s-f和sgrna-r为引物进行重叠pcr，得到sgrna表达盒。将该表达盒利用同源重组试剂盒(clonexpress ii one step cloning kit)连接至bglii/ecori酶切处理的pagg线性载体，得到敲除质粒pagg-sgrna-cep450-3。
[0163]
2、敲除菌株的构建
[0164]
利用amt，将质粒pagg-sgrna-cep450-3导入ce-pc菌株中，筛选得到工程菌株c.e(δcep450-3)。
[0165]
3、工程菌株c.e(δcep450-3)的发酵
[0166]
为了检测工程菌株c.e(δcep450-3)的发酵产物，将其接种于20ml种子培养基中，25℃，220rpm，培养4天，按10％接种量接种到30ml发酵培养基中，25℃，220rpm，培养10天。
[0167]
4、hplc检测
[0168]
利用反向hplc(安捷伦)检测发酵产物：取2ml发酵液，加8ml丙酮充分混匀，超声震荡30min，过滤后得滤液进行检测，结果如图1所示。
[0169]
结果显示：工程菌株c.e(δcep450-3)的发酵产物化合物6的分子量为1126，经分析化合物6的结构为：
[0170][0171]
5、抗真菌活性：化合物6的抗菌活性结果见表3，由结果可知，化合物6有抗真菌活性。
[0172]
表3抑菌活性检测结果
[0173][0174]
本发明所有涉及到的化合物结构通式如下，其中各化合物的基团r1～r6汇总如表4所示。
[0175][0176]
表4
[0177][0178]
对比例1ceoxy2和ceoxy3的基因敲除及产物分析
[0179]
本对比例敲除的ceoxy2的基因的氨基酸序列如seq id no:34所示，其核苷酸序列如seq id no:35所示；敲除的ceoxy3的基因的氨基酸序列如seq id no:36所示，其核苷酸序列如seq id no:37所示。
[0180]
1、质粒构建：
[0181]
(1)pagg-sgrna-ceoxy2和pagg-sgrna-ceoxy3的构建
[0182]
以coleophoma empetri f-11899基因组为模板，5s-f/r为引物，pcr得到5s rrna片段。用n20-ceoxy2-f和sgrna-r为引物，pcr得到可特异性识别ceoxy2的sgrna片段。以5s rrna片段和sgrna片段作为模板，用5s-f和sgrna-r为引物进行重叠pcr，得到sgrna表达盒。将该表达盒利用同源重组试剂盒(clonexpress ii one step cloning kit)连接至bglii/ecori酶切处理的pagg线性载体，得到敲除质粒pagg-sgrna-ceoxy2。同样的方法获得敲除质粒pagg-sgrna-ceoxy3。
[0183]
2、敲除菌株的构建
[0184]
利用amt，将质粒pagg-sgrna-ceoxy2导入ce-pc菌株中，筛选得到工程菌株c.e(δceoxy2)。将质粒pagg-sgrna-ceoxy3导入ce-pc菌株中，筛选得到工程菌株c.e(δceoxy3)。
[0185]
3、工程菌株的发酵
[0186]
为了检测工程菌株c.e(δceoxy2)和c.e(δceoxy3)的发酵产物，将其接种于20ml种子培养基中，25℃，220rpm，培养4d，按10％接种量接种到30ml发酵培养基中，25℃，220rpm，培养10天。
[0187]
4、hplc检测
[0188]
利用反向hplc(安捷伦)检测发酵产物：取2ml发酵液，加8ml丙酮充分混匀，超声震荡30min，过滤后得滤液进行检测。
[0189]
结果显示：如图2和图3所示，发酵产物中无fr901379及结构类似物的产生。