1.本发明涉及微小颗粒显微成像与检测技术领域，尤其涉及一种应用于非荧光多颗粒分辨的显微成像系统与方法。
背景技术：
2.超分辨光学显微镜已经成为细胞生物学、神经科学、制药和纳米光子领域的重要工具。目前应用最广泛的超分辨纳米技术主要基于荧光显微镜，能够对样本进行选择性标记。这种基于荧光标记显微镜的技术能够提供较高的图像对比度，然而标记方式的限制阻碍了其应用范围。近年来，提出了许多无标记超分辨成像方法。干涉散射显微镜(iscat)和单颗粒干涉反射显微镜(spir)对纳米尺度物体具有高的灵敏度，在这两种技术中来自物体的散射场与相干参考场叠加在一起。旋转相干散射显微镜(rocs)在暗场模式下采用倾斜、相干照明来提高图像分辨率和对比度。
3.提高光学显微镜的分辨能力是显微成像技术的关键问题，在荧光超分辨技术中，较为典型的是基于点扫描成像的受激发射损耗荧光成像(sted)、荧光差分技术(fed)和结构光照明超分辨光学显微成像技术(sim)。以上技术中，sted通过空心损耗光场将荧光淬灭，减小系统点扩散函数(psf)，从而提升分辨率；fed通过时间尺度的二次成像，进行时域差分减小光学系统psf，实现对比度提升；sim将物体高频信息编码至低空间频率来实现分辨率提高。
4.然而，与荧光超分辨纳米显微镜相比，尽管无标记成像技术对单分子的检测尺度和定位精度都可以达到纳米级，但对两个或多个点源时的检测分辨率目前依然受到限制。研究报道通过基底材料的设计可以提高无标记散射检测分辨率。等离子体材料在可见光波段内有更高的有效折射率，因此，基于等离子材料如表面等离极化结构和双曲超材料被应用于散射成像来提高分辨率。特殊材料增强的无标记显微镜在应用范围和加工上存在一定程度限制。提高分辨率的另一个方式是从点扩散函数入手，通过对系统点扩散函数的大小或形状进行调控，以实现图像分辨率的提升。目前的无标记非荧光成像技术中，依然缺乏一种基于系统点扩散函数调控，实现宽视场成像下样品面多个颗粒检测分辨率提高的技术。
技术实现要素：
5.为克服上述问题，本发明提供一种应用于非荧光多颗粒分辨的显微成像系统与方法。
6.本发明的第一个方面提供一种应用于非荧光多颗粒分辨的显微成像系统，包括照明光路、成像光路、调控与处理模块，所述照明光路的发射端和成像光路的入射端共同设置有样品台(12)，样品台(12)上设置有待检测样品；
7.所述照明光路包括沿光路依次设置的光源模块、偏振调制模块和照明模块，光源模块提供照明光并将光调制为平行线偏振光，偏振调制模块调整入射的平行线偏振光为s偏振态，照明模块将调整好的s线偏振光引入待检测样品面；
8.所述成像光路包括沿光路依次设置的高倍物镜(11)和成像模块，待检测样品面上样品颗粒的散射光和基底的反射光一起被高倍物镜(11)收集后，由成像模块将散射信号与反射光进行干涉成像；
9.所述调控与处理模块包括图像处理模块(17)和位移调控模块(18)，图像处理模块(17)将干涉成像的信号进行图像处理，位移调控模块(18)实时调控样品位置。
10.进一步，所述光源模块包括提供连续激光的连续激光器(1)、以及沿激光光路依次设置的第一低倍物镜(2)、旋转散射片(3)和第二低倍物镜(4)；所述第一低倍物镜(2)将激光束会聚到旋转散射片(3)上，旋转散射片(3)削弱入射光相干性以消除干涉条纹，第二低倍物镜(4)收集经过旋转散射片(3)的光。
11.所述偏振调制模块包括沿光路依次设置的起偏器(5)、第一全反镜(6)、半波片(7)和第一检偏器(8)；起偏器(5)调整入射平行光为线偏振光；第一全反镜(6)调整入射光方向；半波片(7)于调整偏振光的偏振方向；第一检偏器(8)调整入射线偏振光的偏振方向为s线偏振光。
12.进一步，所述偏振调制模块包括沿光路依次设置的起偏器(5)、第一全反镜(6)、半波片(7)、第三全反镜(19)和第二分束镜(20)，第二分束镜(20)的出射端设置有偏振分析仪(21)；
13.起偏器(5)调整照明光为平行线偏振光，所述平行线偏振光经过第一全反镜(6)反射后进入半波片7调整线偏振光的偏振方向后，经过第三全反镜(19)反射后通过第二分束镜(20)分为两束，透射光进入偏振分析仪(21)，反射光作为照明光；半波片(7)与偏振分析仪(21)实时调整线偏振方向，使照明光偏振态变为s偏振态。
14.进一步，所述照明模块包括沿光路依次设置的宽场照明透镜(9)、分束镜(10)和高倍物镜(11)，宽场照明透镜(9)将入射平行线偏振光会聚；分束镜(10)反射照明光，高倍物镜(11)将照明光收集并发射到待检测样品面。
15.进一步，所述照明模块包括沿光路依次设置的起偏器(5)、第一全反镜(6)、半波片(7)、第一检偏器(8)、声光偏转器(22)、4f系统第一透镜(23)、4f系统第二透镜(24)、分束镜(10)和高倍物镜(11)；
16.起偏器(5)调整照明光为平行线偏振光，平行线偏振光经过第一全反镜(6)反射后进入半波片(7)调整线偏振光的偏振方向后，进入第一检偏器(8)调整所述线偏振光为s线偏振光；平行线偏振光通过声光偏转器(22)对光线在二维方向上进行快速扫描，4f系统第一透镜(23)和4f系统第二透镜(24)将偏转后的光束经分束镜(10)反射后会聚到高倍物镜(11)后焦面，会聚后的照明光经过高倍物镜(11)形成宽场平行光照射样品台(12)。
17.进一步，所述成像光路上通过高倍物镜(11)收集样品颗粒散射光与基底反射光后通过分束镜(10)后设置有成像模块；所述分束镜(10)的入射端连接有高倍物镜(11)，分束镜(10)的发射端连接所述成像模块；
18.所述成像模块包括第二全反镜(13)、第二检偏器(14)、镜筒透镜(15)和探测器(16)，第二全反镜(13)改变探测光方向；第二检偏器(14)进一步调整用于干涉成像光的偏振分量；镜筒透镜(15)将检偏后的所述颗粒散射光与反射光会聚；探测器(16)将散射光与反射光干涉成像。
19.进一步，所述调控与处理模块包括图像处理模块(17)和位移调控模块(18)，图像
处理模块(17)，用于对探测器获得信号进行处理获得颗粒干涉信号；位移调控模块(18)实时调控样品的三维位置。
20.进一步，所述第一低倍物镜(2)和第二低倍物镜(4)放大倍率为10，数值孔径为0.25，所述高倍物镜(11)放大倍率为100，数值孔径为1.4；所述分束镜(10)的透射反射光分束比t:r＝50:50；所述第二检偏器(14)的偏振比为s:p＝5:95。
21.本发明的第二个方面提供一种应用于非荧光多颗粒分辨的显微成像方法，包括以下步骤：
22.s1：连续激光器(1)发射照明光经过第一低倍物镜(2)后会聚，经过旋转的散射片(3)后通过第二低倍物镜(4)收集并调整为平行光；
23.s2：平行光经过起偏器(5)调整照明光为平行线偏振光，所述平行线偏振光经过第一全反镜(6)反射后进入半波片(7)调整线偏振光的偏振方向后，进入第一检偏器(8)调整所述线偏振光为s线偏振光；
24.设定θ1为起偏器(5)透光轴与x轴夹角，θ2为半波片(7)快轴与x轴夹角，θ3为第一检偏器透光轴与x轴夹角，结合如下公式：
[0025][0026][0027]
设定起偏器(5)夹角θ1，第一检偏器(8)夹角π/2，通过转动半波片(7)角度θ2，满足a1＝0，使通过半波片(7)后的光能全部通过第一检偏器(8)；
[0028]
s3：所述平行线偏振光经过宽场照明透镜(9)和分束镜(10)后会聚于高倍物镜(11)后焦面，会聚后的照明光经过高倍物镜(11)形成宽场平行光照射样品台(12)；
[0029]
s4：样品台(12)上样品颗粒的散射光与样品基底表面的反射光一起被高倍物镜(11)收集后经过分束镜(10)、第二全反镜(13)、第二检偏器(14)，抑制背景反射光后进入镜筒透镜(15)将光线会聚于探测器(16)上进行干涉成像；
[0030]
s5：图像处理模块(17)对采集获得的一系列图像矩阵进行处理，通过平均或中值滤波获得图像背景，差值法获得信号并进行归一化；
[0031]
s6：计算系统多颗粒下点扩散函数psf，并与颗粒间距进行拟合；
[0032]
s7：根据归一化后的图像和拟合曲线反算颗粒间距并进行颗粒定位，获取多颗粒位置和间距信息。
[0033]
本发明的有益效果是：
[0034]
1、基于干涉散射成像的偏振依赖，通过偏振调制进行psf调控，可提高对多个散射颗粒聚集的分辨能力；
[0035]
2、采用反射式干涉散射成像光路，装置简单，兼容多种成像模式，包括暗场成像、共聚焦成像、荧光成像等。
附图说明
[0036]
图1为本发明实施例1中所述的一种应用于非荧光多颗粒分辨的显微成像系统的结构示意图；
[0037]
图2为本发明的光源模块的结构示意图(a)以及旋转散射片的局部结构图(b)；
[0038]
图3为本发明的图像处理模块的处理流程示意图；
[0039]
图4为本发明实施例2中所述的一种应用于非荧光多颗粒分辨的显微成像系统的结构示意图；
[0040]
图5为本发明实施例3中所述的一种应用于非荧光多颗粒分辨的显微成像系统的结构示意图；
[0041]
图6为本发明的不同颗粒间距下s偏振光干涉散射显微成像psf与p偏振光干涉散射psf仿真对比图：沿y方向；
[0042]
图7为本发明的不同颗粒间距下s偏振光干涉散射显微成像psf与p偏振光干涉散射psf仿真对比图：沿x方向；
[0043]
图8为本发明对多个粒径为300nm的sio2进行偏振干涉散射显微成像(a)以及传统圆偏振光照明探测p偏振光的干涉散射显微成像(b)的对比图；
[0044]
附图标记说明：1-连续激光器，2-第一低倍物镜，3-旋转散射片，4-第二低倍物镜，5-起偏器，6-第一全反镜，7-半波片，8-第一检偏器，9-宽场照明透镜，10-分束镜，11-高倍物镜，12-样品台，13-第二全反镜，14-第二检偏器，15-镜筒透镜，16-探测器，17-图像处理模块，18-位移调控模块，19-第三全反镜，20-第二分束镜，21-偏振分析仪，22-声光偏转器，23-4f系统第一透镜，24-4f系统第二透镜。
具体实施方式
[0045]
下面将结合附图对本发明专利的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0046]
在本发明的描述中，需要说明的是，如出现术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，如出现术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
[0047]
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，如出现术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
[0048]
实施例1
[0049]
见图1，一种应用于非荧光多颗粒分辨的显微成像系统包括照明光路、成像光路和调控与处理模块，所述照明光路上按光路方向依次连接连续激光器1，第一低倍物镜2，旋转
散射片3，第二低倍物镜4，起偏器5，第一全反镜6，半波片7，第一检偏器8，宽场照明透镜9，所述成像光路按光路方向依次连接高倍物镜11，分束镜10，第二全反镜13，第二检偏器14，镜筒透镜15，探测器16，所述调控与处理模块由图像处理模块17(见图3)和位移调控模块18组成。
[0050]
本实施例中，如图2所示，光源模块中连续激光器1输出中心波长为445nm的高斯光束，由第一低倍物镜2、第二低倍物镜4将激光束调整为平行光。在第一低倍物镜2的焦点处放置旋转散射片3，由步进电机3-1及散射片3-2构成，削弱激光束的相关性以去除干涉系统中杂散光带来的额外干涉条纹。光源模块的输出光束大小、激光能量和相干性均可自由调节。
[0051]
本实施例中，通过偏振调制模块和探测路的检偏器设计，实现对样品颗粒背景反射光的抑制。偏振调制后的照明光为s偏振态，样品面上的s偏振反射光通过探测光路的第二检偏器14进行正交偏振抑制，提高图像的对比度。
[0052]
在上述实施例的基础上，如图6所示，对不同y方向间距dy下两个颗粒干涉散射psf进行仿真。仿真参数设定：照明激光波长为455nm，高倍物镜数值孔径1.4，放大倍率100。颗粒y方向间距dy从0.2μm增加到0.4μm，p偏振态的中心圆形psf中无法分辨出两个颗粒，相反，s偏振态的四瓣psf中能够分辨出两个散射颗粒。
[0053]
在上述实施例的基础上，如图7所示，在两个颗粒y方向距离dy＝0.08μm下，对不同x方向间距d
x
下两个颗粒干涉散射psf进行仿真。仿真参数设定：照明激光波长为455nm，高倍物镜数值孔径1.4，放大倍率100。颗粒x方向间距dy从0.2μm增加到0.4μm，结果同样表明，p偏振态的中心圆形psf中无法分辨出两个颗粒，而s偏振态的四瓣psf中能够分辨出两个散射颗粒和相对位置。
[0054]
在上述实施例的基础上，以粒径为300nm的sio2的干涉散射成像为例，选择激光波长为445nm。通过偏振调制模块实现s偏振光照明，并通过检偏器检测s偏振态的信号光与背景光被探测器16采集，如图8(a)所示；将一个1/4波片置于分束镜10与高倍物镜11之间，进行圆偏振光照明。利用偏振分束镜9反射端的s偏振光经过1/4波片形成圆偏振光照射样品面，调整第二检偏器14方位角为0
°
，探测p偏振背景光与信号干涉光，经过成像模块，干涉散射图像被探测器16采集，如图8(b)所示。相比于传统圆偏振光照明并探测p偏振分的成像方式，本发明提供的基于偏振选择的干涉散射显微成像系统与方法通过偏振调制后的四瓣状psf，提高了多颗粒的分辨能力，并结合正交偏振抑制背景光提高了信噪比。具备高灵敏度、高分辨力、长观测时间、宽视场等优势。
[0055]
实施例2
[0056]
基于实施例1所述的一种应用于非荧光多颗粒分辨的显微成像系统的成像方法，包括以下步骤：
[0057]
s1：连续激光器1发射照明光经过第一低倍物镜2后会聚，经过旋转散射片3后通过第二低倍物镜4收集并调整为平行光；
[0058]
s2：所述平行光经过起偏器5调整照明光为平行线偏振光，所述平行线偏振光经过第一全反镜6反射后进入半波片7调整线偏振光的偏振方向后，进入第一检偏器8调整所述线偏振光为s线偏振光；
[0059]
s3：所述平行线偏振光经过宽场照明透镜9和分束镜10后会聚于高倍物镜11后焦
面，会聚后的照明光经过高倍物镜11形成宽场平行光照射样品台12；
[0060]
s4：样品台12上样品颗粒的散射光与样品基底表面的反射光一起被高倍物镜11收集后经过分束镜10、第二全反镜13、第二检偏器14，抑制背景反射光后进入镜筒透镜15将光线会聚于探测器16上进行干涉成像；
[0061]
s5：图像处理模块17对采集获得的一系列图像矩阵进行处理，通过平均或中值滤波获得图像背景，差值法获得信号并进行归一化；
[0062]
s6：计算系统多颗粒下点扩散函数psf，并与颗粒间距进行拟合；
[0063]
s7：根据归一化后的图像和拟合曲线反算颗粒间距并进行颗粒定位，获取多颗粒位置和间距信息。
[0064]
实施例3
[0065]
见图4，一种应用于非荧光多颗粒分辨的显微成像系统包括照明光路、成像光路和调控与处理模块，所述照明光路上依次连接连续激光器1，第一低倍物镜2，旋转散射片3，第二低倍物镜4，起偏器5，第一全反镜6，半波片7，第三全反镜19，第二分束镜20，宽场照明透镜9，所述成像光路按光路方向依次连接高倍物镜11，分束镜10，第二全反镜13，第二检偏器14，镜筒透镜15，探测器16，所述调控与处理模块由图像处理模块17，位移调控模块18组成，所述第二分束镜20的出射端设置有偏振分析仪21。
[0066]
实施例4
[0067]
基于实施例3所述的一种应用于非荧光多颗粒分辨的显微成像系统的成像方法，包括以下步骤：
[0068]
s1：连续激光器1发射照明光经过第一低倍物镜2后会聚，经过旋转散射片3后通过第二低倍物镜4调整为平行光；
[0069]
s2：所述平行光经过起偏器5调整照明光为平行线偏振光，所述平行线偏振光经过第一全反镜6反射后进入半波片7调整线偏振光的偏振方向后，经过第三全反镜19反射后通过第二分束镜20分为两束，透射光进入偏振分析仪21，反射光作为照明光；
[0070]
s3：通过半波片7与偏振分析仪21实时调整线偏振方向，使照明光偏振态变为s偏振态；
[0071]
s4：所述反射平行线偏振光经过宽场照明透镜9和分束镜10后会聚于高倍物镜11后焦面，会聚后的照明光经过高倍物镜11形成宽场平行光照射样品台12；
[0072]
s5：样品台12上样品颗粒的散射光与样品基底表面的反射光一起被高倍物镜11收集后经过分束镜10、第二全反镜13、第二检偏器14，抑制背景反射光后进入镜筒透镜15将光线会聚于探测器16上进行干涉成像；
[0073]
s5：图像处理模块17对采集获得的一系列图像矩阵进行处理，通过平均或中值滤波获得图像背景，差值法获得信号并进行归一化；
[0074]
s6：计算系统多颗粒下点扩散函数psf，并与颗粒间距进行拟合；
[0075]
s7：根据归一化后的图像和拟合曲线反算颗粒间距并进行颗粒定位，获取多颗粒位置和间距信息。
[0076]
实施例5
[0077]
见图5，一种应用于非荧光多颗粒分辨的显微成像系统包括照明光路、成像光路和调控与处理模块，所述照明光路上按光路方向依次连接连续激光器1，第一低倍物镜2，旋转
散射片3，第二扩束准直透镜4，起偏器5，第一全反镜6，半波片7，第一检偏器8，声光偏转器22，4f系统第一透镜23，4f系统第二透镜24，所述成像光路按光路方向依次连接高倍物镜11，分束镜10，第二全反镜13，第二检偏器14，镜筒透镜15，探测器16，所述调控与处理模块由图像处理模块17，位移调控模块18组成。
[0078]
实施例6
[0079]
一种应用于非荧光多颗粒分辨的显微成像方法，包括以下步骤：
[0080]
s1：连续激光器1发射照明光经过第一低倍物镜2后会聚，经过旋转散射片3后通过第二低倍物镜4调整为平行光；
[0081]
s2：所述平行光经过起偏器5调整照明光为平行线偏振光，所述平行线偏振光经过第一全反镜6反射后进入半波片7调整线偏振光的偏振方向后，进入第一检偏器8调整所述线偏振光为s线偏振光；
[0082]
s3：所述平行线偏振光通过声光偏转器22对光线在二维方向上进行快速扫描，4f系统第一透镜23和4f系统第二透镜24将偏转后的光束经分束镜10反射后会聚到高倍物镜11后焦面，会聚后的照明光经过高倍物镜11形成宽场平行光照射样品台12；
[0083]
s4：样品台12上样品颗粒的散射光与样品基底表面的反射光一起被高倍物镜11收集后经过分束镜10、第二全反镜13、第二检偏器14，抑制背景反射光后进入镜筒透镜15将光线会聚于探测器16上进行干涉成像；
[0084]
s5：图像处理模块17对采集获得的一系列图像矩阵进行处理，通过平均或中值滤波获得图像背景，差值法获得信号并进行归一化；
[0085]
s6：计算系统多颗粒下点扩散函数psf，并与颗粒间距进行拟合；
[0086]
s7：根据归一化后的图像和拟合曲线反算颗粒间距并进行颗粒定位，获取多颗粒位置和间距信息。
[0087]
本发明的原理是：偏振调制的干涉散射显微成像是基于点扩散函数的偏振选择特性，通过起偏器、半波片和第一检偏器的组合，实现对样品颗粒的s光偏振照明。在s光偏振照明和探测条件下，系统的点扩散函数(psf)为特征性较强的四瓣分布。当多颗粒形成干涉散射时，四瓣型psf可以实现对颗粒间距位置的高灵敏度分辨。
[0088]
针对具体的偏振调制模块，所需的起偏器、半波片、第一检偏器方位角由偏振关系式给出，依次设定θ1为起偏器透光轴与x轴夹角，θ2为半波片快轴与x轴夹角，θ3为第一检偏器透光轴与x轴夹角，结合如下公式：
[0089][0090][0091]
之后，通过设定起偏器夹角θ1，第一检偏器夹角π/2，通过转动半波片角度为θ2，满足a1＝0，使通过半波片后的光能全部通过第一检偏器，即可满足偏振调制条件；
[0092]
偏振调制提高多颗粒干涉散射分辨能力的原理，不同偏振态与极性下干涉散射系
统有不同psf，传统p光的干涉散射psf为中央圆形加外环圆干涉环，s光的干涉散射psf为中央四瓣加外环四瓣状干涉环。通过偏振调制模块及探测路中引入检偏器，即可实现四瓣形psf获取，提高多颗粒干涉散射的分辨能力。
[0093]
本说明书实施例所述的内容仅仅是对发明构思的实现形式的列举，本发明的保护范围不应当被视为仅限于实施例所陈述的具体形式，本发明的保护范围也及于本领域技术人员根据本发明构思所能够想到的等同技术手段。