1.本发明属于农业害虫生物活性测定技术领域，尤其涉及一种高效测定西花蓟马生物活性的方法及其应用。
背景技术：
2.西花蓟马(frankliniella occidentalis)又称苜蓿蓟马，缨翅目蓟马科花蓟马属，是一种入侵害虫。属于过渐变态，一生经过卵、若虫、成虫3个阶段：(1)卵：肾形或长椭圆形，长约0.3mm，呈白色透明状；(2)若虫：分为4个龄期，与成虫相似，呈黄色，3龄期触角变为鞘囊状，翅芽外露；(3)成虫：体长1.1-1.5mm，复眼呈红色，身体呈黄色或淡褐色。
3.西花蓟马通过取食直接危害寄主植物之外，还能传播多种病毒，如番茄褪绿病毒(tomato chlorosis virus,tosv)、凤仙花坏死斑病毒(impatiens necrotic spot virus,insv)及番茄斑萎蔫病毒(tomato spotted wilt virus,tswv)等。以西花蓟马传播tswv为例，西花蓟马取食时，病毒通过口器进入消化道，在糖蛋白gn和gc的作用下进入中肠，病毒在中肠中大量复制增殖，通过对健康植株进行锉吸式取食，使植物叶片受伤，从而让病毒成功侵入植物体内，致使植株感病。tswv以循环增殖型传播方式传播，西花蓟马一旦携带病毒，则终生带毒。目前已知tswv可以感染900多种植物，在已知的传播tswv媒介中，西花蓟马传播效率最高，而由病毒造成的经济损失远远大于西花蓟马本身造成的危害。
4.关于防治西花蓟马的研究很少，其中关键制约是缺乏bt对西花蓟马杀虫活性的测定方法，从而限制了对西花蓟马有活性bt菌株的筛选应用。
5.目前，对西花蓟马生物活性测定的方法主要有叶管药膜法和薄膜饲喂法等。其中叶管药膜法装置容积小，管壁内极易形成一层水雾，容易导致试虫溺死。薄膜饲喂法虽一端利用橡皮筋将尼龙纱网固定，相对减小了环境的湿度，但玻璃管壁上同样容易形成水雾导致试虫溺死；并且尼龙网一端容易产生缝隙，试虫易被困而死；更换饲料时，玻璃管有短暂开口状态，试虫易逃逸，而影响生测结果。
6.所以目前亟需一种针对“bt对西花蓟马生物活性测定体系”，可进一步筛选对西花蓟马具有高毒力的bt菌株，发掘有效的cry基因并对未来建立相应bt工程菌或转基因作物提供基因资源的改进方案。
技术实现要素：
7.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种高效测定西花蓟马生物活性的方法及其应用。本发明将西花蓟马接入设置有取食口和透气孔的生测装置中，然后将透气孔封口，将药液和液态饲料混合制成的液体食物添加到取食口中，在适宜条件下养虫一段时间后观察记录西花蓟马的死亡数，计算死亡率和校正死亡率。使用该方法死亡误差小，校正死亡率高，相较于现有技术中的叶管药膜法、薄膜饲喂法更为高效。本发明中的药液也可为保藏号为cgmccno.24768的bt cy6菌株制成的胞晶混合物，西花蓟马的校正死亡率也较高，也可有效应用于西花蓟马生物活性测定体系中，同时还具有环保等优点，对西花蓟马等引起的农
业害虫研究意义更为重大。
8.为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
9.本发明提供了一种高效测定西花蓟马生物活性的方法，所述方法采用的生测装置由生测瓶盖和透明生测瓶体组成；所述生测瓶盖由外瓶盖和内瓶盖组成，所述透明生测瓶体由透明瓶体、透气孔和封口膜组成，所述生测瓶盖上设置有取食口、透气孔和封口膜，所述取食口由食物保护膜、液体食物和取食膜组成；所述外瓶盖可自由旋转，所述内瓶盖与所述透明瓶体以螺纹旋接，所述取食口和所述透气孔贯穿所述外瓶盖和所述内瓶盖上下两层，所述取食口和所述透气孔可通过旋转所述外瓶盖的方式开关，所述所述取食口和所述透气孔位置相对，所述透气孔和所述透气孔位于同一侧。
10.优选的，所述方法具体包括以下步骤：步骤(一)：将西花蓟马接入所述生测装置中；步骤(二)：将所述生测装置的所述透气孔和所述透气孔封口，将所述液体食物添加到所述生测装置的所述取食口中；步骤(三)：养虫；步骤(四)：观察记录西花蓟马的死亡数，并计算死亡率和校正死亡率。
11.优选的，所述生测装置中所述透明生测瓶体容积为100ml，瓶高为67mm，直径为42mm。
12.优选的，所述生测装置中所述取食口直径为15mm，所述透气孔和所述透气孔直径为10mm。
13.优选的，所述封口采用的是双层拉伸的石蜡封口膜pm-996，所述石蜡封口膜pm-996的拉伸倍数为4倍，所述封口方式为从瓶外封口。
14.优选的，所述液体食物由药液和液态饲料按照1:2的体积比混合制成。
15.优选的，所述药液由吡虫
·
虫满腈稀释制成。
16.优选的，所述养虫的温度为26
±
1℃，相对湿度为40％-60％，光周期(l:d)为16h:8h。
17.本发明还提供了一种基于bt菌株的高效测定西花蓟马生物活性的方法，使用以上所述方法，所述药液为bt菌株的胞晶混合物。
18.优选的，所述bt菌株为bt cy6菌株，分类学命名为苏云金杆菌(bacillus thuringiensis)，保藏号为cgmcc no.24768。
19.与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：
20.(1)采用本发明中的生测装置以吡虫
·
虫满腈为药液饲喂西花蓟马24h后，西花蓟马的校正死亡率为85.39％，处理组死亡率显著高于对照组试虫死亡率，说明本发明中的生测装置可有效用于测定胃毒药剂对西花蓟马的杀虫活性。
21.(2)本发明中的生测装置在瓶口和瓶身处均设有通气孔，有效地降低了装置内的湿度；同时设置双层瓶盖和可开关取食口，可有效避免更换饲料时试虫逃逸现象。因此使用本发明的方法可有效避免现有技术，例如叶管药膜法和薄膜饲喂法中试虫溺亡和逃逸引起的较大误差，测定结果更加高效。
22.(3)采用本发明中的生测装置以bt cy6菌株制成的胞晶混合物对西花蓟马也有较高杀虫活性，校正死亡率为53.33％，同时使用bt cy6菌株，与使用吡虫
·
虫螨腈等相比更加环保，延缓昆虫对化学药剂抗性产生，且对人畜无害不易残留，对西花蓟马等引起的农业危害损失研究意义更为重大。
23.保藏证明说明：
24.保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
25.保藏编号：cgmccno.24768；
26.保藏日期：2022年04月25日；
27.保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
28.分类学命名：苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis)。
附图说明
29.图1为本发明实施例1中所使用的生测装置；
30.图2为本发明实施例2中18株bt菌株对西花蓟马的杀虫活性结果。
具体实施方式
31.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
32.下面结合实施例，对本发明的技术方案进行进一步详细阐述。
33.实施例1
34.本实施例提供了一种高效测定西花蓟马生物活性的方法，使用的生测装置如图1所示，由生测瓶盖1和透明生测瓶体2组成；所述生测瓶盖1由外瓶盖3和内瓶盖4组成，所述透明生测瓶体2由透明瓶体5、透气孔6和封口膜7组成，所述生测瓶盖1上设置有取食口8、透气孔9和封口膜10，所述取食口8由食物保护膜11、液体食物12和取食膜13组成；所述外瓶盖3可自由旋转，所述内瓶盖4与所述透明瓶体5以螺纹旋接，所述取食口8和所述透气孔9贯穿所述外瓶盖3和所述内瓶盖4上下两层，所述取食口8和所述透气孔9可通过旋转所述外瓶盖3的方式开关，所述所述取食口8和所述透气孔9位置相对，所述透气孔6和所述透气孔9位于同一侧。
35.本实施例提供的高效测定西花蓟马生物活性的方法具体过程如下：
36.(1)吡虫
·
虫满腈500倍稀释，备用；
37.(2)用研钵将晾干的新鲜洁净的豆角研磨，再用200目纱布过滤获得汁液，制成液态饲料，置于-20℃保存备用；
38.(3)将上述吡虫
·
虫满腈稀释药液与上述液态饲料按照1:2的体积比混合制成液体食物，备用；
39.(4)选择透明生测瓶体容积为100ml，瓶高为67mm，直径为42mm的生测装置；
40.(5)内外瓶盖用开孔器打直径为10mm和15mm的位置相对的两个通孔，在15mm通孔的那面瓶身中间用10mm钻头开孔；
41.(6)两个直径为10mm的透气孔用拉伸4倍后的双层石蜡封口膜pm-996封口，供试虫换气；
42.(7)将拉伸4倍后的石蜡封口膜pm-996置于瓶盖上下15mm的孔中间，添加100μl上述液体食物于食物保护膜和取食膜组成的双层膜饲料囊中央；
43.(8)每瓶接入10头西花蓟马，每3瓶为一个重复，每个处理设置三次重复，用无菌水 液态饲料(体积比：1:2)作对照；
44.(9)接虫后将玻璃管水平置于养虫室，温度26
±
1℃，相对湿度40％-60％，光周期(l:d)16h:8h，饲养西花蓟马，每天更换饲料，观察试虫取食与存活情况，6天后统计死亡数，计算校正死亡率，结果如表1所示。
45.其中：判断西花蓟马死亡的标准为：用毛笔尖轻轻碰触蓟马虫体，不能爬出一个虫体长度的试虫视作死亡。
46.校正死亡率公式为：校正死亡率(％)＝(处理死亡率-对照死亡率)/(1-对照死亡率)
×
100％。
47.表1本发明生测装置对西花蓟马的生物活性测定结果
[0048][0049]
注：表中死亡率数据，为平均值
±
标准误。吡虫
·
虫满腈处理西花蓟马后死亡率与对照死亡率间差异性，以表中数字后“*”，“**”或“***”表示(t-test，“*”为0.01《p《0.05；“**”为0.0001《p《0.01；“***”为p《0.0001)。
[0050]
用本实施例中的方法饲喂西花蓟马12h时试虫开始出现行动迟缓、死亡现象，18h时试虫大量死亡。结果显示，吡虫
·
虫满腈饲喂西花蓟马24h后，对照组死亡率仅为1.11％，吡虫
·
虫满腈处理组死亡率为85.56％，二者呈现极显著差异，吡虫
·
虫满腈对西花蓟马的校正死亡率为85.39％。因此，本发明中的饲喂法可用于测定胃毒药剂对西花蓟马的杀虫活性。
[0051]
对比例1
[0052]
参考叶管药膜法对西花蓟马进行生物活性测定(张志军等，2013)，具体方法如下：
[0053]
(1)吡虫
·
虫满腈500倍稀释，备用；
[0054]
(2)将1.5ml上述药液置于离心管，室温放置30min后弃药液，于通风橱中吹干待用；
[0055]
(3)将新鲜洁净的直径为1.5cm的甘蓝叶片，在上述药液中浸泡10s后取出并自然晾干，将叶片连同1cm2大小的滤纸置于相应药液的离心管中，叶片背面朝上，每管1片；
[0056]
(4)每管接10头西花蓟马成虫，每3管为一个重复，每个处理设置三次重复，封口膜两层封口，以无菌水作对照；
[0057]
(5)接虫后将所有的离心管水平放置于养虫室，温度26
±
1℃，相对湿度40％-60％，光周期(l:d)为16h:8h，观察并记录西花蓟马试虫死亡数，统计结果计算死亡率和校正死亡率。结果如表2所示。
[0058]
判断西花蓟马死亡的标准和校正死亡率公式同实施例1。
[0059]
表2叶管药膜法对西花蓟马的生物活性测定结果
[0060][0061]
注：表中死亡率数据，为平均值
±
标准误。吡虫
·
虫满腈处理西花蓟马后死亡率与对照死亡率间差异性，以表中数字后“*”，“**”或“***”表示(t-test，“*”为0.01《p《0.05；“**”为0.0001《p《0.01；“***”为p《0.0001)。
[0062]
使用本对比例的方法饲喂西花蓟马10h时试虫开始出现行动迟缓、死亡现象，18h时试虫大量死亡。结果显示，吡虫
·
虫满腈饲喂西花蓟马24h后，对照组死亡率为16.67％，吡虫
·
虫满腈处理组死亡率为96.67％，二者呈现极显著差异，吡虫
·
虫满腈对西花蓟马的校正死亡率可达到96.00％。
[0063]
对比例2
[0064]
参考薄膜饲喂法对西花蓟马进行生物活性测定(叶佳琴等，2020)，具体方法如下：
[0065]
(1)吡虫
·
虫满腈500倍稀释，备用；
[0066]
(2)用研钵将晾干的新鲜洁净的豆角研磨，再用200目纱布过滤获得汁液，制成液态饲料，置于-20℃保存备用；
[0067]
(3)将上述吡虫
·
虫满腈稀释药液与上述液态饲料按照1:2的体积比混合制成液体食物，备用；
[0068]
(4)将4cm长的双通玻璃管，一端用200目纱布封口以便透气，另一端用双层pm-996封口膜制成取食膜系统；
[0069]
(5)滴加100μl上述液体食物于双层膜饲料囊中央；
[0070]
(6)每管接入10头西花蓟马成虫，每3管为一个重复，每个处理设置三次重复，用无菌水 液态饲料(体积比1:2)作对照；
[0071]
(7)接虫后将玻璃管水平置于养虫室，温度26
±
1℃，相对湿度40％-60％，光周期(l:d)16h:8h，观察并记录试虫死亡数，统计结果计算死亡率和校正死亡率。结果如表3所示。
[0072]
判断西花蓟马死亡的标准和校正死亡率公式同实施例1。
[0073]
表3薄膜饲喂法对西花蓟马的生物活性测定结果
[0074][0075]
注：表中死亡率数据，为平均值
±
标准误。吡虫
·
虫满腈处理西花蓟马后死亡率与对照死亡率间差异性，以表中数字后“*”，“**”或“***”表示(t-test，“*”为0.01《p《0.05；“**”为0.0001《p《0.01；“***”为p《0.0001)。
[0076]
使用本对比例的方法饲喂西花蓟马12h时试虫开始出现行动迟缓、死亡现象，18h时试虫大量死亡。结果显示，吡虫
·
虫满腈饲喂西花蓟马24h后，对照组死亡率为14.44％，吡虫
·
虫满腈处理组死亡率为84.44％，二者呈现极显著差异，吡虫
·
虫满腈对西花蓟马的校正死亡率可达到81.82％。
[0077]
综合比较实施例1和对比例1～2可知：对比例1中装置容积小，管壁内极易形成水雾，导致试虫溺亡，所以其对照组试虫死亡率较高；对比例2中，第一，装置一端利用橡皮筋将尼龙纱网固定，相对减小了环境的湿度，但玻璃管壁上同样容易形成水雾导致试虫溺亡；第二，尼龙网一端容易产生缝隙，导致试虫被困而死；第三，在更换饲料时，玻璃管有短暂开口状态，此时试虫易逃逸，进而影响生测结果，所以对比例2中对照组试虫死亡率也较高。而本发明实施例1中的方法在瓶口和瓶身处均设有通气孔，有效地降低了装置内的湿度；同时设置双层瓶盖和可开关取食口，可有效避免更换饲料时试虫逃逸现象。因此使用本发明的方法虽然校正死亡率不是最高，但是可有效避免试虫溺亡和逃逸引起的较大误差，对照组试虫死亡率均明显低于叶管药膜法和薄膜饲喂法，所以本发明的方法能更高效地应用于西花蓟马生物活性测定体系中。
[0078]
实施例2
[0079]
本实施例使用18株bt菌株对西花蓟马进行生物活性测定，具体过程如下：
[0080]
(1)制备胞晶混合物：将bt菌株接种于3ml lb液体培养基中，220rpm，30℃过夜。取200μl菌液，于1/2lb固体培养基中划线培养，每个样品培养5个平板。30℃培养箱中培养至晶体释放。收集晶体释放的样品至20ml无菌水的离心管中，涡旋震荡使胞晶混合物混合均匀，-20℃保存，备用；
[0081]
(2)将胞晶混合物和实施例1中的液体饲料按照1:2的体积比混合制成液体食物；
[0082]
(3)其他步骤参见具体实施例1。
[0083]
所述18株bt菌株对西花蓟马的杀虫活性结果如图2所示。
[0084]
生测结果显示，18株bt菌株中的bt cy6对西花蓟马有较高杀虫活性，校正死亡率为53.33％。虽然本实施例中的校正死亡率低于实施例1，但是本实施例中使用bt菌株相较于吡虫
·
虫满腈对环境安全，不伤害天敌，对人畜无毒，没有残毒，并能有效延缓害虫对化学农药抗性产生。
[0085]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。