1.本发明涉及一种明胶蛋白的荧光标记方法及定量分析方法，属于明胶蛋白定量分析技术领域。
背景技术：
2.明胶是一种水溶性蛋白，可从动物皮肤、肌腱、韧带和骨头等富含胶原的组织中提取出来。作为一种天然生物基材料，明胶的生物相容性好，且具有良好的生物降解性、细胞粘附和增殖、无毒、无免疫原性和价格低廉等特点，在生物医学和组织工程领域具有极大的潜在应用，比如用作医用敷料、修复软骨损伤等。
3.明胶作为一种天然高分子蛋白，其来源广，结构复杂。明胶作为胶原的水解产物，实现明胶的定量分析可能与某些疾病指标联系，比如由胶原沉淀引起的近端指间关节膨大，心肌间质胶原沉淀引起的心肌纤维化等。因此，实现明胶蛋白的定量分析尤为重要。现阶段针对明胶蛋白的定性分析已有较多手段，比如实时荧光pcr法检测明胶的牛、猪源性成分，高效液相色谱串联质谱法检测肽链氨基酸序列等等。在对明胶进行定量分析前需对明胶蛋白进行荧光标记。然而传统的荧光标记方法往往面临着蛋白沉积引起荧光衰减的问题，且明胶作为一种蛋白需要温和的标记条件。如何在不影响明胶本身结构(明胶不变性)的情况下，实现对明胶蛋白的有效标记是实现明胶定量分析的关键。
4.聚集诱导发光(aie)是响应荧光的一个相对较新的概念。与常规的发光体不同，典型的aie发光体具有螺旋桨状的非平面结构。在稀溶液中，aie分子经历分子间旋转，通过非辐射途径消耗能量并使之不发光。在蛋白结合并包裹的情况下，由于来自相邻分子的物理约束，限制了染料分子的自由旋转，从而诱导出高效率的荧光活性。这种独有的aie特性提供了在化学传感、物理可视化和生物成像方面的响应性荧光点亮分析策略，许多aie荧光染料系统已被证实为高亮度、低背景和具有良好的光稳定性的材料。
5.但是，现有技术中并没有报道采用aie荧光染料对明胶蛋白进行标记和定量分析的方法。
技术实现要素：
6.本发明提供了一种明胶蛋白的荧光标记方法及定量分析方法，可以有效解决上述问题
7.本发明是这样实现的：
8.一种明胶蛋白的荧光标记方法，将四氮唑修饰的聚集诱导发光的荧光染料分子溶于水相、醇相或pbs buffer溶液中，再与明胶蛋白溶液混合，得到荧光蛋白复合物溶液。
9.作为进一步改进的，所述四氮唑修饰的的聚集诱导发光的荧光染料分子的结构式如下：
[0010][0011]
其中，r
′
、r
″
、r
″′
及r
″″
中的至少一个为四氮唑基。
[0012]
作为进一步改进的，所述四氮唑修饰的聚集诱导发光的荧光染料分子选自tpe-4ta、tpe-3ta、tpe-2ta、tpe-ta中的一种或多种。
[0013]
作为进一步改进的，所述四氮唑修饰的聚集诱导发光的荧光染料分子为tpe-4ta。
[0014]
作为进一步改进的，所述四氮唑修饰的聚集诱导发光的荧光染料分子溶于水相、醇相或pbs buffer溶液中的浓度为1
×
10-2
～10-4
mol/l。
[0015]
作为进一步改进的，所述醇相为乙醇。
[0016]
作为进一步改进的，所述明胶蛋白的荧光标记方法还包括用激发光照射荧光蛋白复合物溶液，根据是否观察到的荧光判断明胶蛋白是否被有效标记。
[0017]
作为进一步改进的，所述明胶蛋白溶液的配置的温度为35-45℃，搅拌时间为25-35min。
[0018]
一种明胶蛋白的定量分析方法，包括以下步骤：
[0019]
s1，配置梯度浓度的明胶蛋白溶液，采用上述的方法对明胶蛋白进行标记，测试荧光强度；
[0020]
s2，拟合出荧光强度与明胶蛋白浓度的关系的标准曲线；
[0021]
s3，获取明胶蛋白样本，采用步骤s1的方法测试荧光强度，再根据标准曲线对样本中的明胶蛋白进行定量分析。
[0022]
作为进一步改进的，所述测试荧光强度的激发波长为340-450nm。
[0023]
本发明的有益效果是：
[0024]
本发明所采用的四氮唑修饰的聚集诱导发光的荧光染料分子，其主要特征就在于染料分子溶于水相或醇相时不发光，但与明胶蛋白结合时，能够高效地被激发出荧光，从而可以应用于一种明胶蛋白荧光点亮标记的简便高效方法和定量分析方法。
[0025]
本发明的明胶蛋白的荧光标记方法表现为蛋白包裹导致增强染料荧光发射，以及聚集诱导发光现象。该类染料标记稳定性好，可长时间与明胶蛋白结合。
[0026]
本发明明胶蛋白的荧光标记方法只需简单混合明胶溶液和荧光染料溶液，即可达到高效标记的效果，反应条件温和，安全性高，不需要复杂反应条件。
附图说明
[0027]
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0028]
图1是本发明实施例1提供的点亮明胶蛋白的原理图。
[0029]
图2是本发明实施例1、实施例2、实施例3和对比例1提供的点亮明胶蛋白的效果
图。
[0030]
图3是本发明实施例1、实施例2、实施例3和对比例1提供的荧光光谱和荧光寿命图。其中，a为荧光光谱图，b为荧光寿命图。
[0031]
图4是本发明实施例4和实施例5提供的点亮梯度浓度明胶蛋白的荧光光谱图。
[0032]
图5是本发明实施例4和实施例5提供的对明胶蛋白定量分析的线性关系图。
具体实施方式
[0033]
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
[0034]
本发明实施例提供一种明胶蛋白的荧光标记方法，将四氮唑修饰的聚集诱导发光的荧光染料分子溶于水相、醇相或pbs buffer溶液中，再与明胶蛋白溶液混合，得到荧光蛋白复合物溶液。该方法的荧光标记原理如图1所示，这类由四氮唑修饰的化合物，其负电荷的四氮唑阴离子与明胶蛋白中的氨基阳离子之间通过静电相互作用结合，明胶蛋白分子包裹四氮唑修饰的四苯乙烯探针分子从而发生荧光点亮。
[0035]
作为进一步改进的，所述四氮唑修饰的的聚集诱导发光的荧光染料分子的结构式如下：
[0036][0037]
其中，r
′
、r
″
、r
″′
及r
″″
中的至少一个为四氮唑基，其他选自氢、杂原子、烷基、不饱和烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基中的一种或几种。
[0038]
四氮唑基选自以下基团：
[0039][0040]
作为进一步改进的，所述四氮唑修饰的聚集诱导发光的荧光染料分子选自tpe-4ta、tpe-3ta、tpe-2ta、tpe-ta中的一种或多种，结构式如下：
[0041][0042]
作为进一步改进的，所述四氮唑修饰的聚集诱导发光的荧光染料分子为tpe-4ta。
[0043]
作为进一步改进的，所述四氮唑修饰的聚集诱导发光的荧光染料分子溶于水相、醇相或pbs buffer溶液中的浓度为1
×
10-2
～10-4
mol/l。
[0044]
作为进一步改进的，所述醇相为乙醇。
[0045]
作为进一步改进的，所述明胶蛋白的荧光标记方法还包括用激发光照射荧光蛋白复合物溶液，根据是否观察到的荧光判断明胶蛋白是否被有效标记。
[0046]
作为进一步改进的，明胶为一种水溶性高分子蛋白，配制其水溶液时温度不能过高，以免导致明胶蛋白变性。所述明胶蛋白溶液的配置的温度优选为35-45℃。另外，明胶具有发泡性，溶解时不能长时间搅拌，搅拌速度不宜过快，否则会产生大量气泡。所述明胶蛋白溶液的配置搅拌时间优选为25-35min。
[0047]
本发明实施例还提供一种明胶蛋白的定量分析方法，包括以下步骤：
[0048]
s1，配置梯度浓度的明胶蛋白溶液，采用上述的方法对明胶蛋白进行标记，测试荧光强度；
[0049]
s2，拟合出荧光强度与明胶蛋白浓度的关系的标准曲线；
[0050]
s3，获取明胶蛋白样本，采用步骤s1的方法测试荧光强度，再根据标准曲线对样本中的明胶蛋白进行定量分析。
[0051]
作为进一步改进的，所述测试荧光强度的激发波长为340-450nm。
[0052]
实施例所用明胶为a型明胶，bloom 300g，来源于西格玛奥德里奇集团。
[0053]
实施例1
[0054]
本实施例实现了明胶蛋白的荧光标记，具体过程为：
[0055]
(1)称取0.005g明胶蛋白于去离子水中，水浴加热至40℃，搅拌约30分钟后完全溶解，定容至25ml，于热水浴中静置30分钟左右，得200mg/l明胶蛋白水溶液。
[0056]
(2)称取0.006g tpe-4ta，溶于10.00ml乙醇，配制为1
×
10-3
mol/l的tpe-4ta乙醇溶液。
[0057]
(3)取2.97ml步骤(1)中的明胶溶液，加入0.03ml步骤(2)的tpe-4ta溶液，混合均匀。
[0058]
实施例2
[0059]
本实施例实现了明胶蛋白的荧光标记，与实施例1的区别在于，将添加的tpe-4ta
换成tpe-2ta。称取0.005g tpe-2ta溶于10ml乙醇中，配制为1
×
10-3
mol/l的tpe-2ta乙醇溶液，其余过程参考实施例1。
[0060]
实施例3
[0061]
本实施例实现了明胶蛋白的荧光标记，与实施例1的区别在于，将添加的tpe-4ta换成tpe-ta。称取0.004g tpe-ta溶于10ml乙醇中，配制为1
×
10-3
mol/l的tpe-ta乙醇溶液，其余过程参考实施例1。
[0062]
用350nm激发光照射上述混合溶液，可以观察到的蓝绿色荧光发射，结果如图2所示。荧光强度的比较通过测试比较荧光光谱发射峰值，所用仪器为爱丁堡稳态瞬态荧光光谱仪fls1000，固定激发波长为350nm，比较tpe-4ta特征发射峰(499nm)对应的峰值大小。荧光寿命同样由爱丁堡稳态瞬态荧光光谱仪fls1000测得，固定发射波长为499nm，测得荧光寿命图。荧光光谱和荧光寿命图如图3所示。
[0063]
由图2和图3可知，aie分子tpe-4ta对明胶蛋白有良好的识别点亮效果，荧光为蓝绿色，最大发射波长位于499nm,。随着明胶蛋白浓度增大，荧光也随之呈现出增强的变化趋势，在肉眼状态下可观察到荧光由无到发光的显著对比。
[0064]
由图2和图3可知，tpe-2ta也对明胶蛋白具有良好的识别点亮效果，荧光为蓝色，最大发射波长位于484nm，荧光也会随着明胶蛋白浓度的增大而增强。但tpe-2ta对明胶蛋白的点亮效果不如tpe-4ta，这是因为tpe-4ta中的四个四唑基团，使其与蛋白间的相互作用更强，与仅有两个四唑修饰的tpe-2ta相比，具有更为显著的荧光发射。
[0065]
由图2和图3可知，tpe-ta对明胶蛋白也具有一定的识别点亮效果，但其只含一个四唑基团，与明胶蛋白结合后荧光相比于实施例1、实施例2较弱。
[0066]
对比例1
[0067]
本对比例与实施例1的区别在于，未添加任何染料。其余过程参考实施例1。
[0068]
对比例2
[0069]
本对比例与实施例1的区别在于，添加了nascn。在实施例1的步骤(1)中于明胶水溶液中加入0.30g nascn粉末，混合均匀。其余过程参考实施例1。
[0070]
nascn使蛋白质变性，tpe-4ta并不能明显点亮变性后的明胶蛋白，这说明蛋白空间结构被破坏时，tpe-4ta不再对其具有点亮效果。即tpe-4ta只能点亮具有特定空间结构的明胶蛋白。
[0071]
对比例3
[0072]
本对比例与实施例1的区别在于，将明胶蛋白替换为纤连蛋白、弹性蛋白和南极假丝酵母脂肪酶。
[0073]
相比于明胶蛋白，tpe-4ta与纤连蛋白，弹性蛋白和脂肪酶混合后无明显荧光变化。这是因为明胶蛋白的空腔结构刚好对tpe-4ta具有较好的包裹作用，而另外三种蛋白具有的空间立体结构不同于明胶蛋白，其空腔结构无法包裹tpe-4ta染料分子。且明胶蛋白与tpe-4ta存在着静电作用，进一步限制了染料分子运动，从而产生良好的识别点亮效果。
[0074]
实施例4
[0075]
本实施例实现了明胶蛋白荧光标记的定量分析。具体过程为：
[0076]
(1)配制梯度浓度的明胶蛋白溶液：称取0.005g明胶蛋白于去离子水中，水浴加热至40℃，搅拌约30分钟后完全溶解，定容至25ml，得200mg/l明胶蛋白母液，取适量后分别稀
释至所需浓度，分别为0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、15、20、40mg/l。
[0077]
(2)取0.03ml(1
×
10-3
mol/l)tpe-4ta乙醇溶液加入2.97ml梯度浓度的明胶蛋白溶液中混合均匀，固定荧光光谱仪的激发/发射狭缝参数为5nm，设置最佳激发波长为激发(λ
tpe-4ta
＝346nm)，测试荧光强度。根据荧光强度峰值与浓度进行拟合，得拟合曲线，如图5所示，该分子在一定浓度范围内都具有良好定量效果(如图4所示)，tpe-4ta对明胶蛋白定量的线性范围分别为0.1-2mg/l(如图5所示)，最低测试检出限低至0.1mg/l。
[0078]
实施例5
[0079]
本实施例实现了明胶蛋白荧光标记的定量分析与实施例4的区别在于，将添加的tpe-4ta换成tpe-2ta，λtpe-2ta＝325nm。其余过程参考实施例4。
[0080]
如图4和图5所示，tpe-2ta对明胶蛋白定量的线性范围为0.1-5mg/l，最低测试检出限低至0.1mg/l。
[0081]
以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。