1.本发明属于植物耐热性研究
技术领域：
：，具体的涉及一种用于快速评价黄瓜耐热能力的因子及应用。
背景技术：
：：2.极端的气候变化影响了植物的生长发育，高温是限制农作物产量和质量的主要非生胁迫之一。黄瓜(cucumissativusl.)是葫芦科的一员，是一种在世界各地栽培的重要蔬菜。黄瓜喜温但不耐热。长时间处于35℃以上的环境，黄瓜的生长会受到抑制。当环境温度超过50℃时，黄瓜会迅速枯萎死亡。高温胁迫常导致叶、茎萎蔫，根系生长迟缓，花粉活力下降，果实畸形，甚至植株死亡，从而降低黄瓜果实产量和商品性。3.全球气候变化所带来的高温天气，影响着黄瓜的生长及生产。挑选耐热黄瓜品种进行种植更有利于适应气候变化以及提高生产效率。但是，高温对黄瓜带来的众多影响中，哪些指标可以用来区分耐热性尚未明确。而且，不同的黄瓜品种对高温有着不同的抵抗能力。耐热黄瓜可以通过形态和生理上的变化减少热胁迫的伤害，但仅凭单一指标不能确定植物的耐热性。采用多指标综合评价的方法可以判断植物对非生物胁迫的抗性，如主成分分析(pca)。综合评价是对多个复杂指标进行降维，并计算主成分函数的得分。通过将植物表型与科学评价方法相结合，筛选出能反映抗性的综合指标，有利于快速鉴定黄瓜品种的耐热性，为qtl耐热性育种提供候选指标。然而，黄瓜耐热性的综合评价仍不清楚，如何准确反映植物耐热性，综合评价植物耐热性，在育种工作中显得尤为重要。技术实现要素：4.针对目前现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种用于快速评价黄瓜耐热能力的因子，所述因子为黄瓜品种三叶期时的h2o2含量和光合作用效率fq’/fm’，其中，黄瓜品种的耐热能力与h2o2水平变化呈负相关，与fq’/fm’变化呈正相关。5.优选地，h2o2含量和光合作用效率fq’/fm’是对三叶期黄瓜植株进行3天的高温胁迫后测量得到的数值，所述高温胁迫的条件为：高温组昼/夜温度为43℃/38℃，时长16h/8h。6.本发明通过实验筛选得到可用于快速评价黄瓜耐热性的h2o2和光合作用效率fq’/fm’两个指标，实验分两部分，一部分观察表型和测指标，另一部分分析耐热指标。观察表型时得到热害指数，测指标则通过相关性分析、pca、隶属函数等方法得到耐热能力值。热害指数和耐热能力值显著相关，则表明指标的测定结果可以用来反映植株耐热性。最后构建回归方程筛选得到h2o2和fq’/fm’两个与耐热性相关性较高的指标。7.具体地，本发明针对能快速评价黄瓜耐热性指标(h2o2和fq’/fm’)筛选的过程包括以下步骤：8.s1、在高温胁迫处理条件和对照条件下，对选定的黄瓜品种进行播种期及三叶期各单项指标测定，并观察植株表型；9.s2、根据步骤s1观察的植株表型，计算热害指数(hii)＝[∑(热害等级×该等级植株数)]/(最高热害等级×调查植株总数)×100；[0010]其中，热害等级符合以下标准：0，无损伤；1、一片叶子下垂；2、多片叶子下垂，或一片叶子出现明显的发黄、焦灼、萎蔫；3、多片叶子表现出明显的发黄、焦灼、萎蔫；4、植物枯萎甚至死亡；[0011]s3、计算s1测定的各单项热相关指标的耐热系数，[0012]耐热系数(％)＝热处理测量值/对照测定值×100，并利用ibmspss做相关性分析；[0013]s4、对s1测定的各单项指标进行主成分分析(pca)，根据特征值大于1的准则提取主成分，并利用软件ibmspss分析得到各主成分中各指标的相关系数、各主成分综合指标的贡献率；[0014]s5、根据以下公式计算各品种各主成分综合指标值ci，隶属函数值u(xj)，各主成分的综合指标权重wj，各品种耐热能力d值，[0015]ci＝∑(该主成分中各指标的相关系数×该指标的耐热系数)；[0016]u(xj)＝(xj–xmin)/(xmax–xmin)；[0017][0018][0019]式中j＝1，2，...n，其中xj是第j个主成分综合指标值，xmin是第j个主成分综合指标的最小值，xmax是第j个主成分综合指标的最大值；wj表示第j个主成分综合指标在所有综合指标中的重要性，pj是每个黄瓜品种第j个主成分综合指标的贡献率；[0020]s6、当步骤s2所得热害指数和步骤s5所得各品种耐热能力d值显著相关时，以s5的各品种耐热能力d值为因变量，以s3的各单项指标的耐热系数为自变量，建立黄瓜耐热性评价数学模型，黄瓜耐热性鉴定逐步回归方程如下：y＝-0.646x8 0.339x10 1.177，决定系数r2＝0.999，f＝15321.782，p＝0.006；式中x8表示h2o2，x10表示光合作用效率fq’/fm’。[0021]本发明步骤s1所述黄瓜选取不同基因型且表型性状差异较大的品种。[0022]本发明步骤s1中所述播种期时，黄瓜种子培养经高温胁迫处理温度为37℃、40℃或43℃，对照组温度为28℃；s1中所述三叶期时，对三叶龄黄瓜植株进行3天的高温胁迫，高温组昼/夜温度为43℃/38℃，时长16h/8h，对照组昼/夜温度25℃/20℃，时长16h/8h。[0023]本发明步骤s1中所述各单项指标包括叶倾角、叶角、茎粗、mda、gsh、o2-、pod、h2o2、fv/fm、fq’/fm’(光合作用效率)、etr、chla、chlb。[0024]本发明步骤s1中所述观察植株表型包括种子发芽率、植株地上部萎蔫程度(易观察且最能直观反映植物的生长状态)、植株生长点、植株茎横截面、根系密度及根系活力。[0025]本发明还提供了所述因子h2o2含量和光合作用效率fq’/fm’在判断黄瓜耐热能力中的应用。[0026]优选地，在判断黄瓜耐热能力时，具体操作过程为：对三叶期黄瓜植株进行3天的高温胁迫，高温组昼/夜温度为43℃/38℃，时长16h/8h，对照组昼/夜温度25℃/20℃，时长16h/8h，分别测量高温组及对照组植株叶片的h2o2含量和光合作用效率fq’/fm’，当高温组较对照组h2o2水平升高，且fq’/fm’降低，判断该黄瓜品种耐热能力弱；反之则判断该黄瓜品种耐热能力强。[0027]本发明还提供了所述因子h2o2含量和光合作用效率fq’/fm’在筛选耐热黄瓜品种中的应用。[0028]与现有技术相比，本发明的有益效果是：[0029]本发明研究观察测定了4个不同黄瓜品种的表型和热相关指标，并对其耐热性进行了评价，确定了可用于区分黄瓜耐热性的多项指标，如种子发芽率、叶片倾角、茎粗、根系活力、叶绿素荧光和膜系统相关等指标。本发明将与耐热性相关的13个单项指标转化为3个新的独立综合指标，贡献率分别为53.865％，19.667％，9.251％，三个主成分的累计贡献率达到82.783％。通过比较热害指数和耐热能力值，发现二者显著负相关，表明指标的测定统计结果与植物的热害表型一致，耐热综合指标可以用来反映植物的耐热性。为了筛选与耐热性相关性较高的指标，以d值为因变量，以13个耐热系数为自变量，通过逐步回归方程表明，区分品种耐热性的指标倾向于h2o2和fq’/fm’。在另外的8个黄瓜品种中，验证了h2o2和fq’/fm’可以明显区分黄瓜品种的耐热性。这些结果可以简化黄瓜耐热性的鉴定过程，并有助于具有高温稳定性的黄瓜育种过程。附图说明[0030]图1为本发明高温胁迫下的种子萌发，(a-h)：“2014”(a，e)、“hc3”(b，f)、“xs”(c，g)、“xtmc”(d，h)的种子在28℃(a-d)和37℃(e-h)下发芽3天；(i-j)：高温处理3天后下胚轴(i)和根(j)的长度；(k)：“2014”、“hc3”、“xs”、“xtmc”种子经40℃或43℃处理2天后，28℃复苏2天后的发芽率；(l-w)：“2014”(l，p，t)、“hc3”(m，q，u)、“xs”(n，r，v)、“xtmc”(o，s，w)种子在28℃处理2天(l-o)、40℃处理2天和28℃恢复2天(p-s)、43℃处理2天和28℃恢复2天(t-w)的萌发情况；比例尺代表1cm(a-h，l-w)；(i-k)中的误差线代表九个生物重复的标准偏差；**和*分别表示极显著差异和显著的差异，p《0.01和p《0.05(t检验)。[0031]图2为本发明高温胁迫下四个黄瓜品种的表型特征，(a-t)：“2014”(a，e，o，m，q)、“hc3”(b，f，j，n，r)、“xs”(c，g，k，c，s)和“xtmc”(d，h，l，p，t)植株在常温条件(a-h)和3天高温胁迫(i-t)下的表型表征；(u-v)：高温胁迫3天后“2014”、“hc3”、“xs”、“xtmc”的热害级别(u)和热害指数(v)；(w-z)：“2014”(w)、“hc3”(x)、“xs”(y)和“xtmc”(z)植株在3天高温胁迫后的顶端生长点表型；比例尺代表10cm(a-t)，1cm(w-z)。[0032]图3为本发明高温胁迫后四个黄瓜品种地上部分的表型指标，(a)叶角(角度1)和叶倾角(角度2)的示意图；(b-d)：“2014”、“hc3”、“xs”和“xtmc”植株在3天高温胁迫后的叶角(茎与第一叶柄之间的角度)(b)，叶倾角(第一叶片与第一叶柄之间的角度)(c)，茎(第一节)横截面积(d)的变化；(e-l)：“2014”(e，i)、“hc3”(f，j)、“xs”(g，k)、“xtmc”(h，l)在常温条件下(e-h)和3天高温胁迫下(i-l)的茎横截面；(m-t)：常温条件(m-p)和3天高温胁迫(q-t)下“2014”(m，q)、“hc3”(n，r)、“xs”(o，s)和“xtmc”(p，t)叶片的气孔变化；比例尺代表1cm(e-l)和10μm(m-t)；(b-d)中的误差线代表九个生物重复的标准偏差；**和*分别表示极显著差异和显著的差异，p《0.01和p《0.05(t检验)。[0033]图4为本发明高温胁迫后四个黄瓜品种地下部分的表型指标，(a-h)：“2014”(a，e)、“hc3”(b，f)、“xs”(c，g)和“xtmc”(d，h)植株在常温条件下(a-d)和3天高温胁迫下(e-h)土壤层中的根系形态；(i-x)：常温条件(i-p)和3天高温胁迫(q-x)下“2014”(i，m，q，u)、“hc3”(j，n，r，v)、“xs”(k，o，s，w)和“xtmc”(l，p，t，x)根部的细胞活力，绿色荧光代表fda(荧光素二乙酸酯)染色显示的活细胞(i-l，q-t)，红色荧光代表pi(碘化丙锭)染色显示的死细胞(m-p，u-x)；比例尺代表5cm(a-h)，500μm(i-x)。[0034]图5为本发明高温胁迫后四个黄瓜品种的叶绿素荧光特性，(a-l，a'-l')：“2014”(a，a'，e，e'，i，i')、“hc3”(b，b'，f，f'，j，j')、“xs”(c，c'，g，g'，k，k')和“xtmc”(d，d'，h，h'，l，l')植株的叶绿素荧光fv/fm(a-d，a'-d')、fq’/fm’(e-h，e'-h')、etr(i-l，i'-l')在正常温度条件(a-d，e-h，i-l)和3天的高温胁迫下(a'-d'，e'-j'，i'-l')，fv/fm：psii光化学的最大量子产率(也称为原始光化学最大产量)，fq’/fm’：光合作用效率，etr：相对电子转移率，右边的彩色线条代表不同数值荧光下的颜色；(m-o)：“2014”、“hc3”、“xs”、“xtmc”植株经过3天高温胁迫后的fv/fm(m)、fq’/fm’(n)、etr(o)值；(p-r)：高温胁迫后“2014”、“hc3”、“xs”和“xtmc”植株叶绿素a(p)、叶绿素b(q)和类胡萝卜素(r)的变化；(m-r)中的误差线代表九个生物重复的标准偏差；**和*分别表示极显著差异和显著的差异，p《0.01和p《0.05(t检验)。[0035]图6为本发明高温胁迫后四个黄瓜品种的膜系统和氧化还原系统，(a-f)：高温胁迫3天后“2014”、“hc3”、“xs”、“xtmc”植株的相对电导率(rec)(a)、丙二醛(mda)(b)、超氧自由基(o2-)(c)、过氧化氢(h2o2)(d)、过氧化物酶(pod)(e)、谷胱甘肽(gsh)(f)；(g-n)：叶片用dab染色，在常温条件和3天高温胁迫后“2014”(g，k)、“hc3”(h，l)、“xs”(i，m)和“xtmc”(j，n)植物中h2o2的积累，绿色表示h2o2积累；(o-v)：叶片进行nbt染色，揭示了常温条件和3天高温胁迫后“2014”(o，s)、“hc3”(p，t)、“xs”(q，u)和“xtmc”(r，v)植株体内o2-的积累，蓝色表示o2-积累；比例尺代表1cm(g-v)；(a-f)中的误差线代表九个生物重复的标准偏差；**和*分别表示极显著差异和显著的差异，p《0.01和p《0.05(t检验)。[0036]图7为本发明中计算得到的“2014”、“hc3”、“xs”、“xtmc”的耐热能力值(d)(图7a)；耐热能力值(d)与热害指数(hii)的相关性(图7b)。[0037]图8为本发明其他品种指标的确定，(a)：3天高温胁迫下“yb”、“hl”、“dn”、“mn”、“zs04”、“402”、“02-3”、“bm”植株的表型表征；(b-c)：高温胁迫3天后“yb”、“hl”、“dn”、“mn”、“zs04”、“402”、“02-3”、“bm”的热害级别(b)和热害指数(c)；(d)：高温胁迫3天后“yb”、“hl”、“dn”、“mn”、“zs04”、“402”、“02-3”、“bm”的fq’/fm’值；(e)：高温胁迫3天后“yb”、“hl”、“dn”、“mn”、“zs04”、“402”、“02-3”、“bm”的过氧化氢(h2o2)；(f-m，f'-m')：常温条件下(f-m)和3天高温胁迫下(f'-m')的“yb”(f，f')、“hl”(g，g')、“dn”(h，h')、“mn”(i，i')、“zs04”(j，j')、“402”(k，k')、“02-3”(l，l')、“bm”(m，m')的叶绿素荧光fq’/fm’；(n-u，n'-u')：叶片用dab染色，在常温条件(n-u)和3天高温胁迫(n'-u')后，h2o2在“yb”(n，n')、“hl”(o，o')、“dn”(p，p')、“mn”(q，q')、“zs04”(r，r')、“402”(s，s')、“02-3”(t，t')、“bm”(u，u')中积累；绿色表示h2o2的积累；比例尺代表10cm(a)，1cm(n-u，n'-u')；(d-e)中的误差线代表九个生物重复的标准偏差；**和*分别表示极显著差异和显著的差异，p《0.01和p《0.05(t检验)。[0038]图9为本发明筛选的耐热性指标在其他品种的应用，(a-f)：高温胁迫3天后，“2014”、“hc3”、“xs”和“xtmc”植株的茎长(a)、节间长(b)、叶柄长(c)、apx(d)、sod(e)和pro(f)；(g-h)：高温胁迫3天后“yb”、“hl”、“dn”、“mn”、“zs04”、“402”、“02-3”、“bm”的叶片倾角(g)和茎横截面积(h)；(i-x)：叶片用dab染色，在常温条件(i-p)和3天高温胁迫(q-x)后，o2-在“yb”(i，q)、“hl”(j，r)、“dn”(k，s)、“mn”(l，t)、“zs04”(m，u)、“402”(m，v)、“02-3”(o，w)、“bm”(p，x)中的积累，蓝色表示o2-积累，比例尺代表1cm(i-x)；(a-h)中的误差线代表九个生物重复的标准偏差；**和*分别表示极显著差异和显著的差异，p《0.01和p《0.05(t检验)。[0039]图10为黄瓜对热应激中热激蛋白的上调表达，(a-f)：热激蛋白表达水平；(g)：种子在40℃或43℃下处理2天后在28℃下恢复2天的发芽率；(a-g)中的误差线代表九个生物重复的标准偏差；**和*分别表示极显著差异和显著的差异，p《0.01和p《0.05(t检验)。[0040]图11为各成分特征值及各指标在主成分中的相关性分布，(a)：各成分的特征值，提取出3个特征值大于1的主成分；(b)：各指标在3个主成分中的相关性空间分布。具体实施方式[0041]下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0042]本发明实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。[0043]实施例1、黄瓜耐热指标筛选的试验方法[0044]1、材料与方法[0045]1.1、植物材料[0046]“2014”、“hc3”、“xs”、“xtmc”、“bm”、“zs04”、“yb”、“dn”、“hl”、“mn”、“402”、“02-3”黄瓜品种在华南农业大学(中国广州)的标准培养室中生长。黄瓜种子用温水浸泡，然后在28℃的培养箱中发芽。发芽整齐后，将它们种植在无菌的新鲜土壤基质中，在25℃/16h白天和20℃/8h夜晚的培养室中培养。根据标准管理实践进行害虫和水管理。[0047]1.2、种子发芽率[0048]黄瓜种子用温水浸泡，然后在28℃、37℃、40℃、43℃的培养箱中培养。培养2天后，统计种子在28℃和37℃下的发芽率，并在培养了第3天时测量根和下胚轴的长度。将40℃和43℃培养了2天的种子在28℃下再恢复2天，然后统计发芽率。[0049]1.3、热处理和热害指数[0050]将三叶龄黄瓜植株分别置于高温胁迫(16h/8h，43℃/38℃，昼/夜)和对照条件(16h/8h，25℃/20℃，昼/夜)下处理3天。观察植株形态，计算热害指数：[0051]热害指数(hii)＝[∑(热害等级×该等级植株数)]/(最高热害等级×调查植株总数)×100。[0052]其中，热害等级(参考bhattarai,s,etal.,2021)符合以下标准：0，无损伤；1、一片叶子下垂；2、多片叶子下垂，或一片叶子出现明显的发黄、焦灼、萎蔫；3、多片叶子表现出明显的发黄、焦灼、萎蔫；4、植物枯萎甚至死亡。[0053]1.4、表型、叶绿素荧光和根活力[0054]测量茎、第一节间和第一叶柄的长度，测量第一片叶的叶角(茎和叶柄之间的角度)和叶片倾角(叶柄和叶之间的角度)。通过扫描仪(canoscanlide120)检查茎横截面，并通过imagej测量茎横截面的面积。用蔡司显微镜观察叶片的气孔。[0055]使用叶绿素荧光成像仪(plantexplorerpsiihs；phenovationlifesciences,wageningen,thenetherlands)观察叶绿素荧光。将根浸泡在37℃下的含1％(w/v)fda或0.5％(w/v)pi的磷酸缓冲液(pbs)(ph7.0)中20分钟，然后在pbs缓冲液中冲洗10分钟。通过荧光显微镜(carlzeisslsm710)分别在488/530nm和535/615nm处拍摄fda和pi染色的根。荧光素二乙酸酯(fda)，一种细胞渗透性酯酶底物，能被分解成荧光素，从而对活细胞进行染色。碘化丙锭(pi)是一种细胞膜不可渗透的染料，用于染色死亡细胞。[0056]1.5、h2o2和o2-的检测[0057]将叶子浸泡在3，3-二氨基联苯胺(dab)溶液(1mg/mldab-hcl，ph3.8)或硝基氮蓝四唑(nbt)(1mg/mlnbt，溶于10mm叠氮化钠和10mm磷酸缓冲液中，ph7.8)。在过氧化物酶的催化下，过氧化氢(h2o2)能迅速与dab反应生成绿色化合物，从而将h2o2定位在植物组织中。超氧自由基(o2-)是含氧自由基之一，它将nbt还原成不溶于水的蓝色物质，从而将o2-定位在叶片中。[0058]1.6、生理指标的测定[0059]用乙醇提取植物叶片中的叶绿素，叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素分别在470、649和665nm的波长下用分光光度法定量。用电导率仪(dds-307)测定叶片的相对电导率。使用硫代巴比妥酸法测定植物叶片中的丙二醛(mda)含量。用试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司)测定过氧化氢(h2o2)和超氧自由基(o2-)。植物叶片中的过氧化物酶(pod)和超氧化物歧化酶(sod)用愈创木酚和硝基氮蓝四唑法测定。谷胱甘肽(gsh)和抗坏血酸过氧化物酶(apx)通过分光光度法测定。使用酸性茚三酮法测定脯氨酸(pro)。[0060]1.7、定量实时rt-pcr[0061]使用chamqtmuniversalsybrqpcrmastermix(q711-02/03,vazyme,nanjing,china)和基因特异性引物(supplementarytables6)进行所有qrt-pcr分析。使用ct(2-δδct)方法评估基因表达。[0062]1.8、统计分析[0063]采用microsoftexcel2016进行数据整理与分析。用ibmspss统计软件包进行主成分和逐步回归分析。版本24.0(ibminc.,ammonk,n.y.,usa)。[0064]耐热系数(％)＝热处理测量值/对照测定值×100公式(1)[0065]计算各品种的ci(综合指标)值：[0066]ci＝∑(该主成分中各指标的相关系数×该指标的耐热系数)公式(2)[0067]不同黄瓜品种各综合指标的隶属函数值如下：[0068]u(xj)＝(xj–xmin)/(xmax–xmin)j＝1，2，...，n公式(3)[0069]综合指标权重：[0070][0071]各黄瓜品种的整体耐热能力如下:[0072][0073]其中xj是第j个主成分综合指标值，xmin是第j个主成分综合指标的最小值，xmax是第j个主成分综合指标的最大值。wj表示第j个主成分综合指标在所有综合指标中的重要性，pj是每个黄瓜品种第j个主成分综合指标的贡献率。根据热胁迫下各黄瓜品种的综合指标评价得出耐热能力(d)值。[0074]实施例2、高温胁迫对黄瓜的影响[0075]2.1、高温抑制黄瓜种子的萌发[0076]按照实施例1中1.2对种子的处理结果发现，在常温条件下(28℃)，4个黄瓜品种种子萌发良好(图1a-d)。当温度升高到37℃时，虽然4个品种的种子都萌发了，但高温胁迫后“2014”的下胚轴保持不变，“hc3”、“xs”和“xtmc”的下胚轴伸长受到抑制(图1e-h，1i)。高温抑制了4个品种的根伸长(图1j)。当温度升高到40℃或43℃培养2天时，4个黄瓜品种的种子均不能萌发。在常温条件下(28℃)复苏2天后，“2014”种子萌发(图1l，p，t)，“hc3”种子未能萌发(图1m，q，u，k)。虽然“xs”和“xtmc”的种子在40℃处理2天并在28℃恢复时部分萌发，但所有种子在43℃处理后完全丧失萌发能力。结果表明，“2014”种子具有较强的耐热性和热恢复力。[0077]2.2、高温胁迫下黄瓜植株的表型[0078]按照实施例1中方法1.3对4个黄瓜品种(“2014”、“hc3”、“xs”和“xtmc”)在三叶期进行了为期3天的高温胁迫。在常温下，四个黄瓜品种具有相同的生长形态(图2a-h)。在高温胁迫下，“2014”植株仅表现出轻微的萎蔫叶片(图2i，m，q)，而“xtmc”植株表现出严重的热敏症状，包括植株萎蔫，叶片下垂并呈褐色边缘(图2l，p，t)。“hc3”和“xs”植物保持中性生长势(图2j-k，n-o，r-s)。根据植株枯萎程度，将热害等级分为五级。“2014”和“hc3”植物显示出比“xs”和“xtmc”更低的伤害水平，这提醒了它们的表型(图2u)。“2014”、“hc3”、“xs”和“xtmc”的热害指数分别为18.8、23.6、44.1、68.8(图2v)。因此，“2014”、“hc3”被初步认为是耐热品种，“xs”和“xtmc”被认为是热敏品种。此外，在高温处理后，热敏植物的顶端生长点被破坏，而耐热植物的顶端生长点保持着较高活力(图2w-z)，这意味着耐热植物对热有很强的适应力。[0079]为了研究高温条件下耐热和热敏黄瓜植株的表型特征，测定了地上部分的一些表型指标。与常温相比，高温胁迫后四个品种黄瓜的茎长、第一节间长和第一叶柄长没有显著变化(图9a-c)。热处理后“hc3”的叶角增大，而“xtmc”的叶角减小(图3a-b)。“2014”、“hc3”的叶倾角水平没有变化，而“xs”、“xtmc”的叶倾角有所下降，表明高温胁迫后热敏植株的叶片下垂程度有所扩大(图3c)。“2014”的茎变粗，“xs”、“xtmc”变细(图3d，e-l)。所有4个品种都表现出叶片气孔关闭的趋势(图3m-t)。[0080]对于地下部分，“xs”和“xtmc”植物的根量因高温胁迫而减少，而“2014”、“hc3”植物的根量保持不变(图4a-h)。我们进一步观察了根的细胞活力，与“xs”、“xtmc”相比，“2014”、“hc3”在高温胁迫下表现出增强的根活性(图4i-x)。“xs”和“xtmc”的根中活细胞较少(图4s-t)，根尖中死细胞较多(图4w-x)。综上所述，这些结果表明耐热品种在高温下仍能保持良好的生长状态。[0081]2.3、高温影响黄瓜的光合系统、膜系统和氧化还原系统[0082]为了深入了解植物暴露于高温后的光合系统，测量了叶片叶绿素荧光和光合系统参数。“2014”植株保持稳定的光合状态，这反映在fv/fm(光系统ii光化学的最大量子效率)略有降低，fq’/fm’(光合作用效率)和etr(相对电子转移速率)有所提高(图5a-a'，e-e'，i-i'，m，n)。高温胁迫处理后，“hc3”、“xs”、“xtmc”植株表现出降低的fv/fm、fq’/fm’和etr(图5b-o)。高温使“xtmc”植株的叶绿素a和叶绿素b含量急剧下降(图5p-q)。4个黄瓜品种的类胡萝卜素含量因高温而降低(图5r)。[0083]为了进一步了解响应高温的生理变化，测量了一些主要的生理指标。相对电导率是反映植物膜系统完整性的一个重要指标。高温胁迫后，“2014”和“hc3”的相对电导率略有上升，“xs”和“xtmc”的相对电导率急剧上升(图6a)。mda(丙二醛)是膜脂氧化的重要指标，仅在热处理后的“xs”和“xtmc”中增加(图6b)。这些结果表明，高温胁迫破坏了热敏型黄瓜的细胞膜系统。[0084]接下来，我们检测了叶片中o2-(超氧自由基)和h2o2(过氧化氢)的含量和分布。与常温相比，高温胁迫后“2014”和“hc3”叶片中的o2-和h2o2含量没有变化，而“xs”和“xtmc”显著增加(图6c，d)。叶片用nbt和dab染色，蓝色部分是o2-积累，绿色部分是h2o2积累。高温处理后，o2-和h2o2广泛分布在“xs”和“xtmc”植株的叶组织中(图6g-n，o-v)。“xtmc”植株中pod(过氧化物酶)的减少削弱了过氧化物清除能力，导致植物无法缓解热害(图6e)。抗氧化防御系统中的重要物质gsh(谷胱甘肽)在“2014”受到热应激时增加(图6f)。这些结果表明，高温破坏了热敏型黄瓜的氧化还原系统。[0085]实施例3、黄瓜耐热指标的筛选及评价[0086]首先对各个指标进行了分析，将能用于区分品种耐热性的指标转化为耐热系数(见表1)。其中，高温下4个品种黄瓜的叶片倾角和fv/fm低于常温下(耐热系数《1)，高温下o2-高于常温下(耐热系数》1)。然后，分析所有耐热系数之间的相关性(见表2)，对于叶倾角，其与叶角，fv/fm，叶绿素a、b显著正相关，而与o2-显著负相关，与其他指标无相关性。而对于h2o2，其与叶倾角、叶角、gsh以外的指标均显著相关。结果表明，各个指标之间存在一定的相关性，但又有差异，单一指标无法全面准确地描述黄瓜耐热性。[0087]表1热相关指标耐热系数[0088][0089]表2各指标间的相关性[0090][0091]为了减少单个指标的误差，采用主成分分析来对复杂的指标进行统计。运用该方法，提取出3个主成分(特征值》1)(图11a)。主成分用ci(综合指标)来表示，3个综合评价指标中ci1–ci3的贡献率分别为:53.865％、19.667％、9.251％，累计贡献率为82.783％(表3)。综合指标下面是其与各个独立指标的相关系数，图11b表示各个独立指标在3个主成分中的相关性系数分布。通过该方法，将13个单项指标转化为3个新的综合指标，以代表原始指标的大部分信息，有效地将复杂的指标联系起来。[0092]主成分并非一个独立指标，而是一个综合指标，每一个综合指标都包含了13个独立的指标的特性。比如ci1是综合指标1，对于这个综合指标，他与叶倾角的相关性是0.586，与叶角的相关性是0.636，与茎粗的相关性是0.813，依次类推(其绝对值约接近1，该单一指标和这个综合指标的相关性就越高)。[0093]表3各综合指标贡献率及其与各指标间的相关系数[0094][0095]根据公式(2)得到各品种的3个综合指标值，根据公式(3)计算出隶属函数值。其中u(x)值越高则品种的耐热性越强，比如对于ci1，“2014”的u(x1)最大，因此在这个综合指数下“2014”的耐热性最强。通过公式(4)计算出3个综合指数的权重(分别为0.651、0.238和0.112)。最后由公式(5)计算出黄瓜品种的综合耐热能力值(d)，并且从高到低的顺序为“2014”、“hc3”、“xs”、“xtmc”(表4)。[0096]表4各黄瓜品种的综合指标、隶属函数、耐热能力值[0097][0098]通过比较热害指数(图2v)和耐热能力值(图7a)，发现二者显著负相关(图10b)。表明指标的测定统计结果与植物的热害表型一致，耐热综合指标可以用来反映植物的耐热性。为了筛选与耐热性相关性较高的指标，以d值为因变量，以13个耐热系数为自变量，采用逐步回归法构建了最优回归方程：y＝-0.646x8 0.339x10 1.177(r2＝0.999，f＝15321.782，p＝0.006)，其中，x8代表h2o2，x10代表fq’/fm’。结果表明，h2o2和fq’/fm’两个指标对黄瓜耐热性有显著影响。[0099]实施例4、筛选的耐热性指标在其他品种评价耐热性的应用[0100]本发明通过测定已知的耐热性品种，得到耐热性筛选指数。然后，将这些指标应用于8个耐热性未知的品种(对待评价品种三叶龄黄瓜植株进行3天的高温胁迫，高温组昼/夜温度为43℃/38℃，时长16h/8h，对照组昼/夜温度25℃/20℃，时长16h/8h)，以确定这些指标是否普遍适用。首先，计算8个品种的热伤害水平和指数(图8a-c)。热害指数由低到高依次为“yb”、“hl”、“dn”、“zs04”、“mn”、“402”、“02-3”、“bm”。8个品种的叶倾角和茎横截面积与热害指数相似(图9g-h)。[0101]叶片叶绿素荧光和统计光合参数表明，“bm”和“02-3”植株的fq’/fm’因高温而显著降低(图8d，f-m，f'-m')。此外，“bm”和“02-3”的h2o2水平因高温而显著增加(图8e)。dab染色也表明h2o2大量分布在“bm”和“02-3”叶中(图8n-u，n'-u')。此外，nbt染色显示更多的o2-分布在“bm”和“02-3”的叶片上(图9i-x)。“yb”和“hl”种子在43℃处理和28℃恢复2天后发芽良好(图10g)。这些结果表明，h2o2和fq’/fm’与黄瓜品种的耐热性显著相关。[0102]在我们的实验中，在种子处理温度提高到43℃并恢复一段时间后，可以鉴定出极端耐热的种子品种(图1k，10g)。对于植物地下部分，过氧化氢的积累导致水分运输的减少。我们还发现，高温胁迫抑制了根系密度，破坏了根系活力。黄瓜中热激蛋白的上调表达也是植物在应对热应激中发挥的积极作用(图10a-f)。[0103]综上所述，我们采用了相关性分析、主成分分析和隶属度函数对更多的指标进行综合评价。我们将指标测定统计分析得到的耐热性与表型统计得到的热害指数进行了比较，发现两者之间存在显著的相关性。这些结果表明，高温对植物的影响体现在各个方面，这些不同的指标是构成植物耐热性的一部分。我们将研究结果应用于更多的黄瓜品种，验证了h2o2和fq’/fm’可以明显区分黄瓜品种的耐热性。[0104]显然，以上所述的具体实施方案，只是对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步的详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、同等替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12当前第1页12