结合sers基底用于ctcs捕获和分析的微流控芯片的制作方法-j9九游会真人

结合sers基底用于ctcs捕获和分析的微流控芯片的制作方法
技术领域
1.本发明涉及芯片技术领域，具体的说，本发明涉及一种sers增强基底和微流控芯片相结合对ctcs的捕获和分析的微流控芯片的制作方法。


背景技术：

2.目前，癌症仍然是世界上致死率最高的疾病之一，最新的研究表明，每年将有数百万人死于癌症，因此癌症严重威胁着人类的生命健康。癌症是一种涉及异常细胞生长的疾病，这种细胞疾病会扩散并且严重威胁其他组织。癌症起源于细胞受损的遗传物质或者dna，当细胞的dna发生变化时，该细胞开始与相邻健康细胞发生变化，它与健康细胞不同，经过癌变的细胞既不遵从内部指令，也不与其他细胞保持协同一致。简言之，癌细胞无论从外观以及功能都与健康细胞截然不同，当突变细胞分裂形成两个突变细胞的时候，这种裂变过程将不受控制的持续下去，直到细胞增殖形成一团成为肿瘤的细胞。肿瘤的关键危险是其能够对健康组织具有较强的侵袭性，具有很强的扩散能力。癌细胞在患者体内扩散到人身体的各个部位的多阶段过程被称为癌症转移。其中，90％癌症患者死于转移性癌症。因此，设计一种高效且低廉便携的策略，用于ctcs的早期检测及预后具有极其重要的意义。
3.1928年，印度物理学家raman小组使用汞弧灯照射苯溶液时，发现散射光中夹杂着与入射频率不相同的微弱光谱，它的频率均匀的分布在入射光的频率两边。这一发现，后被命名为拉曼散射。后于1974年，fleischmann等人通过实验验证了表面增强拉曼(sers)现象，这一发现引起了研究人员们极大地兴趣。通过不懈研究，人们发现粒子的大小、形状、介电环境、电子密度、有效电子质量都会引起表面等离子体共振(spr)，产生sers增强，基于这种原理，开发出一序列的sers增强基底。
4.微流控技术是一种在微纳尺度空间中精确控制和操纵微纳流体的科学技术。微流控芯片，也被称为芯片实验室(loc)，是用于实现微流控技术的技术平台和设备之一。微流控芯片可以将生物和化学实验中涉及的基本功能单元(如样品制备、反应、分离和检测)集成在一个几平方厘米的芯片上。流体通过微通道流入每个反应单元。微流控芯片的基本特征和优势是在微小平台上灵活组合和大规模集成多个技术单元。因此，被广泛应用于临床监测、电化学实验、细胞实验等诸多领域。微流控技术在ctcs的分离和检测过程中占据着重要的地位。
5.ctc首先从癌症患者血液中检测出来，被认定为是从肿瘤上脱落的癌细胞，由于它存在于血液中，因此可以从血液中进行分离。近些年来，各种策略被开发出来用于ctcs的分离，主要原理分为两大类：第一种基于ctcs生物特性，利用ctcs表面的生物信息，进行免疫亲和捕获；第二种依据细胞基于细胞的尺寸、电荷、密度和弹性等物理特性的。ctcs的检测手段主要包含；荧光检测，电化学检测和拉曼检测。
6.发明人的在先发明专利申请，申请号：202210556477.2申请日：2022-05-19，名称为用于循环肿瘤细胞捕获和分析的基底制备方法及应用，公开了一种用于循环肿瘤细胞捕获和分析的基底制备方法，包括步骤s1，大尺寸ps微球的单层密堆积膜的制备；步骤s2，提
拉转移步骤s1制得的大尺寸ps微球单层密堆积膜至pet膜上；步骤s3，微米锥阵列基底制备；步骤s4，电子束蒸镀金膜；步骤s5，基底上的适体孵育；本发明体还提供了上述用于循环肿瘤细胞捕获和分析的基底制备方法制备的基底在微流控芯片中的应用。本发明的周期性密堆积排列的基底，其具备微纳异质的微锥阵列拥有良好的sers特性，在修饰完适体后通过基底的物理特性和适体的亲和力结合，有着较高的ctcs捕获效率。微流控芯片与sers基底的结合，提升了捕获效率，提供了同时具备捕获和检测ctcs的平台。
7.本发明有借鉴该在先申请之处，即也是采用微流控芯片与sers基底的结合，用于ctcs捕获和分析，但是也具有较大的差别。


技术实现要素：

8.本发明的目的提供了一种具有更大比表面积的二元微纳阵列基底，再利用反应离子刻蚀的方法制备了粗糙的微纳表面，这种粗糙表面具有良好的sers增强特性和ctcs捕获性能，接着解决了血液中ctcs数量极少，难以分离的问题，最后提出了一种用于捕获与检测的微流控平台。
9.为实现本发明的发明目的，本发明提出以下技术方案：
10.一种结合sers基底用于ctcs捕获和分析的微流控芯片的制作方法，包括以下步骤：
11.步骤s1，二元微纳阵列基底阳模板的制备；
12.步骤s10，制备设两种图案的掩膜板：图案a和图案b，其中，图案b外径尺寸为图案a的一半；
13.优选的，所述的图案a为齿轮结构，图案b为四叶草结构。
14.步骤s11利用uv紫外光刻机，先在硅基板上光刻出图案a的结构，经过后烘操作使得图案显现出来；
15.步骤s12，通过第二次旋涂光刻胶进行二次光刻，将图案b的结构移植到图案齿轮结构表面；
16.步骤s13，经过显影坚膜得到二元微纳阵列结构的阳模板；
17.步骤s2，二元微纳阵列基底的制备；
18.所述的二元微纳阵列基底的制备过程为，制备材料为pmma粉末以及乳酸乙酯溶液；pmma粉末和乳酸乙酯溶液混合后加入磁珠，在磁力搅拌器台，进行溶解，直至溶液清澈透明；
19.静置后备用；
20.使用pdms搅拌均匀后置于真空腔室去除气泡；
21.对制备的阳模板进行注塑倒模；
22.将制备的pmma溶液倒在pdms模板上进行倒模；
23.脱模，得到二元微纳阵列基底；
24.优选的，所述的步骤s2具体为，所述的二元微纳阵列基底的制备，制备材料为pmma粉末以及乳酸乙酯溶液；取50ml玻璃瓶，加入5g的pmma粉末和30g的乳酸乙酯溶液，质量比为1:6，加入磁珠，在磁力搅拌器台，1000rmp进行溶解，直至溶液清澈透明；将该溶液常温静置12h，等待气泡消除备用；使用聚二甲基硅氧烷(pdms)，pdms使用ab胶使用比例为10:1，搅
拌均匀后置于真空腔室去除气泡，对制备的阳模板进行注塑倒模，置于70℃烘箱2h；将制备的pmma溶液倒在pdms模板上进行倒模，置于70℃烘箱加热固化12h；待到冷却后，进行脱模，得到二元微纳阵列基底。
25.步骤s3，微加工制备二元微纳阵列基底；
26.所述的步骤s3具体为，将步骤s2所得的pmma基底放入反应离子刻蚀机中，进行反应离子刻蚀刻蚀，将刻蚀功率设置为350w，氧气流量设置为30sccm，刻蚀压强调至5pa，刻蚀时间设置为45min，最终得到了具有良好微纳表面的二元微纳阵列基底。
27.步骤s4，电子束蒸镀金膜；
28.所述的步骤s4中，所述的电子束蒸镀金膜的步骤为：将制备的二元微纳阵列基底固定在镀金圆盘上，将蒸金控制为0.03nm.s-1
的速率，使用膜厚仪来对基底上的蒸镀金层厚度进行控制，最终镀金厚度为50nm左右。
29.步骤s5，基底上的适体孵育；
30.所述的步骤s5中，所述的基底上的适体孵育的步骤为：将上述镀金基底置于提前配好的浓度为100nmol.l-1
的特异性适体溶液中，将装有特异性适体和镀金基底的离心管悬吊在漩涡振荡器的边缘，进行轻微的振荡，促进适体与二元微纳基底进行结合；如上振荡2h后取出，用pbs进行适当冲洗2-3遍，得到经过适体修饰的sers二元微纳阵列基底。
31.步骤s6，微流控芯片的制备。
32.所述的步骤s6中，所述的微流控芯片的制备的步骤为：通过uv紫外光刻技术将设计的芯片掩膜制备成芯片的硅阳模板，使用聚二甲基硅氧烷(pdms)，pdms使用ab胶使用比例为10:1，搅拌均匀后置于真空腔室去除气泡，对制备的阳模板进行注塑倒模，置于70℃烘箱2h；后使用刀具将pdms芯片分割切成单块，即得到了单层的微流控芯片。
33.优选的，本发明还包括步骤s7，微流控芯片与基底的封接，
34.具体为：将制备的微流控芯片使用无水乙醇进行超声清洗，置于加热台70℃进行烘干；将烘干的pdms芯片进行氧等离子处理60s，之后将步骤s5完成适体修饰的二元微纳阵列基底嵌入微流控芯片上预留的腔室中，并迅速将微流控芯片与玻璃片贴合，完成组装封接。
35.优选的，本发明还包括步骤s8，基底表征，
36.表征的方法为：通过扫描电子显微镜(sem)对基底的形貌进行表征；将基底浸泡在不同浓度的孔雀石绿异硫氰酸酯(mgitc)，使用labram hr evolution激光共聚焦拉曼光谱系统进行检测，通过拉曼报告分子mgitc对基底的sers增强性能进行表征。
37.本发明的优点和有益效果：
38.1.高比表面积的二元微纳阵列基底，具备良好的sers特性，其微纳表面形貌有利于ctcs进行着床，通过修饰特异性适体，基底的物理特性与免疫亲和相结合，使得基底有着较高的捕获效率。
39.2.微流控芯片与sers基底的结合，提高了ctcs的捕获效率，也为ctcs的后续研究分析提供了条件。
40.术语解释：
41.本文中所述的ps是指聚苯乙烯(ps)，pet是指聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)。
42.sers是指表面增强拉曼效应(sers)。
43.ctcs是指循环肿瘤细胞。
44.pdms是指聚二甲基硅氧烷。
45.pmma指的是聚甲基丙烯酸甲酯,是一种高分子聚合物,又称作亚克力或有机玻璃。
46.mgitc是指孔雀石绿异硫氰酸酯。
附图说明
47.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
48.图1为二元微纳阵列基底的加工流程图；
49.图2为二元微纳阵列基底修饰适体及ctcs捕获示意图；
50.图3为二元微纳阵列基底sem表征图；
51.图4为sers基底使用mgitc作为报告分子测得检测限的拉曼谱图；
52.图5为sers基底的均一性检测；
53.图6为sers基底的mapping图；
54.图7为微流控芯片捕获以及各部分分区功能示意图；
55.图8为基底捕获到ctcs的sem图；
56.图9为基底捕获到的ctcs在荧光下的图；
具体实施方式
57.下面将结合附图对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
58.图1是本发明中二元微纳阵列基底的制作以及微纳表面制备的流程，制备的二元微纳阵列基底，经过rie进行反应离子刻蚀，形成了最终的微纳形貌。
59.具体步骤为：
60.步骤s1，二元微纳阵列基底阳模板的制备；
61.步骤s10，制备设两种图案的掩膜板：图案a和图案b，其中，图案b外径尺寸为图案a的一半；
62.优选的，所述的图案a为齿轮结构，图案b为四叶草结构。
63.步骤s11利用uv紫外光刻机，先在硅基板上光刻出图案a的结构，经过后烘操作使得图案显现出来；
64.步骤s12，通过第二次旋涂光刻胶进行二次光刻，将图案b的结构移植到图案齿轮结构表面；
65.步骤s13，经过显影坚膜得到二元微纳阵列结构的阳模板；
66.步骤s2，二元微纳阵列基底的制备；
67.所述的二元微纳阵列基底的制备，制备材料为pmma粉末以及乳酸乙酯溶液；取50ml玻璃瓶，加入5g的pmma粉末和30g的乳酸乙酯溶液，质量比为1:6，加入磁珠，在磁力搅拌器台，1000rmp进行溶解，直至溶液清澈透明；将该溶液常温静置12h，等待气泡消除备用；使用聚二甲基硅氧烷(pdms)，pdms使用ab胶使用比例为10:1，搅拌均匀后置于真空腔室去
除气泡，对制备的阳模板进行注塑倒模，置于70℃烘箱2h；将制备的pmma溶液倒在pdms模板上进行倒模，置于70℃烘箱加热固化12h；待到冷却后，进行脱模，得到二元微纳阵列基底。
68.步骤s3，微加工制备二元微纳阵列基底；
69.所述的步骤s3具体为，将步骤s2所得的pmma基底放入反应离子刻蚀机中，进行反应离子刻蚀刻蚀，将刻蚀功率设置为350w，氧气流量设置为30sccm，刻蚀压强调至5pa，刻蚀时间设置为45min，最终得到了具有良好微纳表面的二元微纳阵列基底。
70.步骤s4，电子束蒸镀金膜；
71.所述的步骤s4中，所述的电子束蒸镀金膜的步骤为：将制备的二元微纳阵列基底固定在镀金圆盘上，将蒸金控制为0.03nm.s-1
的速率，使用膜厚仪来对基底上的蒸镀金层厚度进行控制，最终镀金厚度为50nm左右。
72.图2是本发明中二元微纳基底修饰适体以及进行ctcs捕获的示意图。
73.步骤s5，基底上的适体孵育；
74.所述的步骤s5中，所述的基底上的适体孵育的步骤为：将上述镀金基底置于提前配好的浓度为100nmol.l-1
的特异性适体溶液中，将装有特异性适体和镀金基底的离心管悬吊在漩涡振荡器的边缘，进行轻微的振荡，促进适体与二元微纳基底进行结合；如上振荡2h后取出，用pbs进行适当冲洗2-3遍，得到经过适体修饰的sers二元微纳阵列基底。
75.图3是制备的二元微纳阵列基底表面形貌的sem表征图，经过rie刻蚀，二元微纳阵列基底表面形成了大量的纳米线及纳米线簇，这种纳米结构不仅对sers增强起到了重要作用，也对基底的适体修饰，ctcs的着床生长提供了良好的条件。
76.步骤s6，微流控芯片的制备。
77.所述的步骤s6中，所述的微流控芯片的制备的步骤为：通过uv紫外光刻技术将设计的芯片掩膜制备成芯片的硅阳模板，使用聚二甲基硅氧烷(pdms)，pdms使用ab胶使用比例为10:1，搅拌均匀后置于真空腔室去除气泡，对制备的阳模板进行注塑倒模，置于70℃烘箱2h；后使用刀具将pdms芯片分割切成单块，即得到了单层的微流控芯片。
78.最后，经过步骤s7，微流控芯片与基底的封接，
79.具体为：将制备的微流控芯片使用无水乙醇进行超声清洗，置于加热台70℃进行烘干；将烘干的pdms芯片进行氧等离子处理60s，之后将步骤s5完成适体修饰的二元微纳阵列基底嵌入微流控芯片上预留的腔室中，并迅速将微流控芯片与玻璃片贴合，完成组装封接。
80.优选的，本发明还包括步骤s8，基底表征，
81.表征的方法为：通过扫描电子显微镜(sem)对基底的形貌进行表征；将基底浸泡在不同浓度的孔雀石绿异硫氰酸盐(mgitc)，使用labram hr evolution激光共聚焦拉曼光谱系统进行检测，通过拉曼报告分子mgitc对基底的sers增强性能进行表征。
82.图4使用mgitc作为拉曼报告分子，配置了10-6
、10-7
、10-8
、10-9
、10-10
mol.l-1
的mgitc溶液，将镀金的二元微纳阵列基底浸泡在预制的溶液中，浸泡3h，取出基底使用去离子水进行冲洗，去除未经过连接的mgitc。然后使用633nm波长的激光进行激发，对五种基底sers检测，激光功率设置为5％，积分时间10s，积分3次。并用用labspec6.0软件对信号进行去噪与基线化处理，每条谱线的结果均为该浓度下的五次不同采点平均谱线。从图可以观测到mgitc分子的信号，在1614cm-1
处的标准的特征峰，随着浓度减低信号峰值也逐渐降低
83.图5是二元微纳阵列基底的sers均一性检测，制备了浓度为10-6
mol.l-1
的mgitc溶液，将镀金基底浸泡在预制溶液中3h，用去离子水进行冲洗，然后使用633nm波长的激光进行激发，激光功率设置为5％，积分时间10s，积分3次，随机选取20个点进行sers检测并用用labspec6.0软件对信号进行去噪与基线化处理，得到的20条谱线组成的瀑布图如图5(a)所示。根据统计学原理，计算了相对标准偏差(rsd)为5.31％，如图5(b)所示。
84.基底放置在浓度为10-5
mol.l-1
的罗丹明6g(r6g)溶液中2h，晾干后，进行拉曼mapping检测。调节拉曼检测的参数，根据r6g其中的一个特征峰609cm-1
，我们将扫描的检测范围定在590cm-1
到640cm-1
，选用633nm波长的激光作为激发波长，激光功率选为50％，积分时间为1s，积分次数为1次，步长设置为2μm，采集50x50个单元点，如图5。从图可以看出基底有良好的均一性。
85.图6是将基底浸泡在上述预制的浓度为10-6
mol.l-1
的mgitc溶液，经过去离子水冲洗后，使用633nm波长的激光进行激发，激光功率设置为5％，积分时间1s，积分1次，将检测范围限制为1590cm-1
到1650cm-1
区间进行扫描形成的mapping图，由于齿轮与四叶草的聚焦平面不同，在齿轮的mapping图中，能够明显分辨出四叶草的形状。
86.图7是微流控各个部分的功能示意图，分别指出了液体入口，废液出口，以及基底嵌合的位置，形成了完整的微流控平台。
87.图8是捕获到癌细胞的sem图。对基底进行适体修饰后，将细胞和培养液加在基底上，在常温环境进行静态孵育，使用戊二醛对细胞进行固定，并用不同浓度的酒精对细胞进行脱水，使用sem对基底上的细胞进行表征。如图所示，较大的比表面积，使得ctcs着床的选择变多，sem图显示，细胞附着在基底表面，结构侧壁等。
88.图9是对基底进行了不同浓度的细胞进行静态孵育，在倒置荧光显微镜下进行观察；分别取10μl含有10、50、100、200、500个ctcs进行静态孵育2h，后将基底取出，用pbs进行冲洗，进行观察的结果图。
89.以上所述，所含的谱图数据根据本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆为本发明权利要求的范围所涵盖。