基于羟基酪醇、间萘二酚和zncdse/zns量子点的组合物及其荧光可视化检测cu
2
的方法与应用
技术领域
1.本发明涉及荧光传感分析检测技术领域，尤其涉及一种基于羟基酪醇、间萘二酚和zncdse/zns量子点的组合物及其荧光可视化检测cu
2
的方法与应用。
背景技术：
2.铜(cu
2
)不仅是生物体内多种蛋白质和金属酶的辅助因子，而且还是动植物不可或缺的微量金属元素。因此，当人体内cu
2
含量不足时会导致血液疾病的发生，如贫血和白细胞减少等，而cu
2
在人体内过量时则会导致帕金森病、威尔逊病、阿尔茨海默病等多种遗传性疾病。由于日常摄入的cu
2
主要来自食物和水，根据美国环境保护署(epa)规定，cu
2
在饮用水中的最大污染为1.3mg/l(ac.20μm)。除此之外，cu
2
还广泛应用于工业和农业生产过程中，已成为目前主要的重金属污染物之一。因此，cu
2
的现场测定对人体安全和环境控制具有重要意义。
3.目前已用于检测cu
2
的方法包括表面增强拉曼散射、荧光、化学发光、比色法和电化学等。在这些方法中，荧光法因其简单、灵敏度和可视化等的优点而受到广泛关注。然而，大多数的荧光传感器都集中在荧光的猝灭上，只有少数研究是基于荧光信号的增强，且两种类型的传感器均采用单一的荧光响应模式，因此实验的准确性和可靠性容易受到一些不可避免的因素影响，如环境干扰、入射光、探针浓度和生物背景等。相比之下，使用两个荧光探针的比率荧光策略可以通过双发射信号强度的比值来最大限度地减少上述干扰。近年来，半导体量子点因其吸收广、发射波长可调、耐光漂白等独特的光物理特性而受到越来越多的关注。一些基于量子点的比率型荧光探针已经被开发出来，用于离子、小分子、蛋白质和蛋白酶的检测。到目前为止，基于量子点与cu
2
之间特定的阳离子交换反应(cers)，已经报道了一些基于量子点的比率型传感器用于cu
2
的测定。例如，ma等通过一锅法将量子点和碳点封装到金属有机框架(mof)中，制备了一种新型的cu
2
双发射荧光传感器。tian等人通过结合苯并噻唑荧光团和嵌入二氧化硅纳米颗粒的量子点，开发了一种可视化检测cu
2
的方法。he等人通过简单的混合将量子点与cds组合在一起，设计了一种用于视觉检测cu
2
的比率型荧光纳米探针。yang等人提出了一种近红外双响应的荧光传感器，利用发红光的量子点和发蓝光的聚乙烯亚胺功能化cds之间的协同作用来对cu
2
进行测定。综上所述，为了可靠、灵敏地测定cu
2
，设计一种比例型荧光传感器是非常必要的。然而，由于这些比率型传感器往往存在显色性差、定量灵敏度低或选择性差等缺点，其实际应用较难被推广。yao等通过将红光量子点嵌入到二氧化硅纳米球中，并将绿光量子点通过共价连接到二氧化硅外壳表面，构建了一种双响应荧光纳米复合材料用于cu
2
的灵敏检测。这种比率型荧光法可以实现cu
2
简单可视化检测，随着cu
2
的增加会显示出明显的颜色变化，但该方法涉及到复杂的化学修饰，会对量子点的量子产率和稳定性产生不利影响。因此，开发一种新颖、简单、无修饰的cu
2
视觉半定量检测比例荧光传感器具有极其重要的意义。
4.最近，yang课题组首次报道了一种新型的荧光团，可以通过儿茶酚(如羟基酪醇、
多巴胺和左旋多巴)与间萘二酚(nr)之间发生的分子反应在室温下一步制备。并且该荧光团可以表现出较强的荧光信号，并具有较高的量子产率。受此启发，他们提出了一种简单灵敏的测定酪氨酸酶活性的方法。随后，tang和lu课题组又相继开发了基于多巴胺和nr反应的多模式传感器用于多巴胺检测。值得注意的是，由于这些方法是利用商业上可用的小分子作为前体来识别分析物，因而使检测体系变得更加简单和方便。然而，据我们所知，目前将这种特异的荧光反应应用于重金属离子检测还没有被报道，并且这种基于商业化小分子与量子点组合的设计理念也尚未被用于比率型荧光传感器的构建。
5.有趣的是，本发明人发现cu
2
可以作为催化剂，有效地促进羟基酪醇(hyt)和间萘二酚(nr)之间的荧光反应，所生成的荧光团在480nm处显示出强烈的荧光发射。在此基础上，本发明人开发了一种由hyt、nr和红荧光zncdse/zns量子点组合而成的简单的比例荧光化学传感器，即hyt-nr-qd，用于cu
2
的可视化检测。在cu
2
存在的情况下，cu
2
催化hyt与nr发生反应生成在480nm处具有强烈发射的荧光团，同时溶液cu
2
和cu
的氧化还原循环会产生一部分cu
。而体系中加入量子点后，荧光团的青光几乎不受影响。然而，由于量子点与体系中cu
2
/cu
之间的cers原理以及量子点与荧光团之间的内滤效应(ife)，量子点在605nm处荧光强度显著降低。因此，通过荧光强度在480nm和605nm处比值变化可以对cu
2
的浓度进行直接定量检测。此外，随着cu
2
浓度的增加，青光荧光强度逐渐增加和红光荧光强度逐渐下降，使得溶液在405nm灯下，肉眼可以观察到颜色从红色转变为暗红色，再到棕色，最后变为青色的明显变化，因此可实现对cu
2
的可视化检测。
技术实现要素：
6.本发明的目的在于解决现有技术中存在的技术问题，提供基于羟基酪醇、间萘二酚和zncdse/zns量子点的组合物及其荧光可视化检测cu
2
的方法与应用。
7.为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一种基于羟基酪醇、间萘二酚和zncdse/zns量子点的组合物，该组合物是由羟基酪醇、间萘二酚、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、量子点和水组成，该组合物ph值为7.0-8.5，优选为8.0。
8.进一步的，量子点的成分为zncdse/zns或cdse或znse，优选为zncdse/zns；三羟甲基氨基甲烷缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-hno3或者三羟甲基氨基甲烷-hcl，优选为三羟甲基氨基甲烷-hcl缓冲液；cu
2
由可溶性铜盐提供，例如硫酸铜、氯化铜。
9.进一步的，羟基酪醇和间萘二酚的摩尔比为1:2～2:1，优选为1：1。
10.本发明还公开了一种基于羟基酪醇、间萘二酚和zncdse/zns量子点的组合物的荧光可视化检测cu
2
的方法，包括上述任一项所述的一种基于羟基酪醇、间萘二酚和zncdse/zns量子点的荧光可视化组合物，该方法包括以下步骤：
11.步骤(1)：取一定量的羟基酪醇、间萘二酚、三羟甲基氨基甲烷-hcl缓冲液和适量水配制溶液并混合，得混合液；
12.步骤(2)：金属离子的检测
13.步骤(a-1)：标准曲线的建立：将不同浓度的cu
2
溶液加入至步骤(1)的混合液中，在37℃下孵育25min，之后加入zncdse/zns量子点溶液；测量其380nm激发下480nm处和605nm处的荧光光谱，根据f
480
/f
605
比值与cu
2
浓度的线性关系建立标准曲线；其中，f
480
与f
605
分别代表荧光峰在480nm和605nm处的荧光值；
14.步骤(a-2)铜离子检测：将实际水样通过孔径为0.22μm的过滤膜进行过滤，然后加入不同浓度的cu
2
标准溶液制得一系列水样，将加标样品加入到含有一定量的羟基酪醇、间萘二酚、三羟甲基氨基甲烷-hcl缓冲液的混合液中，在37℃下孵育25min，测量其380nm激发下480nm处和605nm处的荧光光谱，根据标准曲线计算实际水样中cu
2
浓度。
15.进一步的，步骤(1)中羟基酪醇和间萘二酚的摩尔比均为1:2～2:1，优选为1：1；三羟甲基氨基甲烷-hcl缓冲液加入量均为使溶液ph值为7.0-8.5，优选为8.0。
16.进一步的，步骤(a-1)中f
480
/f
605
比值与cu
2
浓度在0～0.3μm和0.3～2μm两段范围内呈良好的线性关系，线性方程分别为：
17.f
480
/f
605
＝8.9531c 0.0693(r2＝0.9822)和
18.f
480
/f
605
＝34.314c－9.3348(r2＝0.9954)；
19.检出限为3.42nm。
20.进一步的，步骤(a-1)中还可以将孵育后的溶液直接在405nm蓝光下目视检测，随cu
2
浓度的增加，溶液在405nm光下由红色变为青色。
21.本发明还公开了一种基于羟基酪醇、间萘二酚和zncdse/zns量子点的组合物的荧光可视化检测cu
2
的应用，包括上述任一项所述的一种基于羟基酪醇、间萘二酚和zncdse/zns量子点的组合物或上述任一项所述一种基于羟基酪醇、间萘二酚和zncdse/zns量子点的组合物的荧光可视化检测cu
2
的方法应用于cu
2
的目视检测或应用于自来水或天然水体中cu
2
检测的用途。
22.本发明有益效果：
23.1.本发明基于特定的cu
2
使羟基酪醇hyt与间萘二酚nr发生的独特荧光反应，结合量子点，设计了一种简便的小分子hyt-nr-qds分析系统，用于cu
2
荧光可视化分析，可应用于实际水样中cu
2
的分析。
24.2.本发明与已知的比例荧光传感器相比，该hyt-nr-qds传感平台具有一些优势；首先，通过混合程序构建比例荧光传感平台，不仅保持了量子点良好的光学性能，缩短了反应时间，而且使检测体系更加简单方便；其次，利用荧光光谱仪，检测到该比率型荧光传感器的检出限为3.42nm，远低于美国环境保护署(epa)安全水平(20μm)；最后，由于cu
2
诱导荧光反应的特殊性以及量子点对cu
2
/cu
的识别能力，该方法对cu
2
具有良好的选择性。基于hyt-nr-qds的比率型荧光法对cu
2
的检测具有方便、灵敏、选择性高、准确的优点。
附图说明
25.此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
26.图1是本发明中用于cu
2
检测的可视化传感器示意图；
27.图2是本发明中hyt-nr传感系统在不同条件下对cu
2
的荧光光谱图和uv-vis吸收光谱；
28.图3是本发明中hyt-nr体系对于cu
2
的选择性研究图；
29.图4是本发明中hyt-nr体系响应cu
2
的可能的反应机理图；
30.图5是本发明中不同条件下量子点在605nm处的荧光信号和不同条件下hyt-nr-qds体系在605nm处的荧光光谱图；
31.图6是本发明中加入不同cu
2
浓度时的hyt-nr-qd体系的荧光和hyt-nr体系的荧光光谱变化图；
32.图7是本发明中随着cu
2
浓度的变化hyt-nr-qd体系在f
480
/f
605
的工作曲线图；
33.图8是本发明中基于hyt-nr-qd体系对cu
2
和不同金属离子的选择性研究图。
具体实施方式
34.为了解决现有技术中用于检测cu
2
的上述缺点，基于特定的cu
2
使羟基酪醇(hyt)与间萘二酚(nr)发生的独特荧光反应，结合量子点(qds)，设计了一种简便的小分子hyt-nr-qds分析系统，用于cu
2
荧光可视化分析。此外，该方法可应用于实际水样中cu
2
的分析。与已知的比率型荧光传感器相比，该hyt-nr-qds传感平台具有一些优势。首先，通过混合式步骤构建比例荧光传感平台，不仅保持了量子点良好的光学性能，缩短了反应时间，而且使检测体系更加简单方便。其次，利用荧光光谱仪，检测到该比率型荧光传感器的检出限为3.42nm，远低于美国环境保护署(epa)安全水平(20μm)。
35.最后，由于cu
2
诱导荧光反应的特殊性以及量子点对cu
2
/cu
的识别能力，该方法对cu
2
具有良好的选择性。基于hyt-nr-qds的比率型荧光法对cu
2
的检测具有方便、灵敏、选择性高、准确的优点。
36.本发明公开了一种基于羟基酪醇、间萘二酚和zncdse/zns量子点的组合物，该组合物是由羟基酪醇、间萘二酚、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、量子点和水组成，该组合物ph值为7.0-8.5，优选为8.0。
37.本实施例中，量子点的成分为zncdse/zns或cdse或znse，优选为zncdse/zns；三羟甲基氨基甲烷缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-hno3或者三羟甲基氨基甲烷-hcl，优选为三羟甲基氨基甲烷-hcl缓冲液；cu2 由可溶性铜盐提供，例如硫酸铜、氯化铜。
38.本实施例中，羟基酪醇和间萘二酚的摩尔比为1:2～2:1，优选为1：1。
39.本发明还公开了一种基于羟基酪醇、间萘二酚和zncdse/zns量子点的组合物的荧光可视化检测cu
2
的方法，包括上述任一项所述的一种基于羟基酪醇、间萘二酚和zncdse/zns量子点的荧光可视化组合物，该方法包括以下步骤：
40.步骤(1)：取一定量的羟基酪醇、间萘二酚、三羟甲基氨基甲烷-hcl缓冲液和适量水配制溶液并混合，得混合液；
41.步骤(2)：金属离子的检测
42.步骤(a-1)：标准曲线的建立：将不同浓度的cu
2
溶液加入至步骤(1)的混合液中，在37℃下孵育25min，之后加入zncdse/zns量子点溶液；测量其380nm激发下480nm处和605nm处的荧光光谱，根据f
480
/f
605
比值与cu
2
浓度的线性关系建立标准曲线；其中，f
480
与f
605
分别代表荧光峰在480nm和605nm处的荧光值；
43.步骤(a-2)铜离子检测：将实际水样通过孔径为0.22μm的过滤膜进行过滤，然后加入不同浓度的cu
2
标准溶液制得一系列水样，将加标样品加入到含有一定量的羟基酪醇、间萘二酚、三羟甲基氨基甲烷-hcl缓冲液的混合液中，在37℃下孵育25min，测量其380nm激发下480nm处和605nm处的荧光光谱，根据标准曲线计算实际水样中cu
2
浓度。
44.步骤(a-1)中加入系列不同浓度的cu
2
溶液，使cu
2
终浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0μm。
45.本实施例中，步骤(1)中羟基酪醇和间萘二酚的摩尔比均为1:2～2:1，优选为1：1；三羟甲基氨基甲烷-hcl缓冲液加入量均为使溶液ph值为7.0-8.5，优选为8.0。
46.本实施例中，步骤(a-1)中f
480
/f
605
比值与cu
2
浓度在0～0.3μm和0.3～2μm两段范围内呈良好的线性关系，线性方程分别为：
47.f
480
/f
605
＝8.9531c 0.0693(r2＝0.9822)和
48.f
480
/f
605
＝34.314c－9.3348(r2＝0.9954)；
49.检出限为3.42nm。
50.本实施例中，步骤(a-1)中还可以将孵育后的溶液直接在405nm蓝光下目视检测，随cu
2
浓度的增加，溶液颜色由红色转变为暗红色、棕色，最后转变为青色；通过比色法，使得可以在405nm灯下，可视化检测到0.2μm cu
2
。
51.本发明还公开了一种基于羟基酪醇、间萘二酚和zncdse/zns量子点的组合物的荧光可视化检测cu
2
的应用，包括上述任一项所述的一种基于羟基酪醇、间萘二酚和zncdse/zns量子点的组合物或上述任一项所述一种基于羟基酪醇、间萘二酚和zncdse/zns量子点的组合物的荧光可视化检测cu
2
的方法应用于cu
2
的目视检测或应用于自来水或天然水体中cu
2
检测的用途。
52.本发明主要基于cu
2
可以催化hyt与nr之间荧光反应的进行，产生一个发青光的荧光团，该荧光团在480nm处有较强的发射。加入zncdse/zns量子点后，由于量子点与上述反应中游离的cu
2
和尚存的cu
之间的阳离子交换反应，以及量子点与溶液中荧光团之间的内滤效应(ief)，量子点在605nm处的红色荧光显著下降。因此，随着不同浓度cu
2
的加入可以明显的观察到溶液在405nm紫外灯下由红光到青光的颜色变化。该方法在0～0.3μm和0.3～2μm两段范围内与cu
2
浓度具有良好的线性关系，且灵敏度较高，其检测下限达到3.42nm。此外，该方法对铜离子有较好的选择性。本发明还公开了cu
2
触发荧光反应的可能机制，cu
2
在羟基酪醇与间萘二酚的荧光反应中起催化剂的作用。本发明的传感器对实际水样中cu
2
的检测结果与电感耦合等离子体质谱(icp-ms)的检测结果吻合较好。
53.实施方式：参照图1-图8；图1为用于cu
2
检测的可视化传感器示意图。
54.图2是本发明中hyt-nr传感系统在不同条件下对cu
2
的荧光光谱图和uv-vis吸收光谱，其中a图是hyt-nr传感系统在不同条件下对cu
2
的荧光光谱图，a图中还有在405nm灯下的插图a-f，b图是hyt-nr传感系统在不同条件下对cu
2
的uv-vis吸收光谱；其中，(a)hyt，(b)nr，(c)hyt nr，(d)cu
2
hyt，(e)cu
2
nr，(f)cu
2
hyt nr。cu
2
：6μm；hyt：20μm；nr：20μm；tris-hcl：ph 8.0，10mm。
55.图3是本发明中hyt-nr体系对于cu
2
的选择性研究图；其中：na
、k
、mg
2
、ca
2
、zn
2
、pb
2
、fe
2
、co
2
、hg
2
、zr
4
、mn
2
、ni
2
、cd
2
、ag
均为2.5μm；cu
2
：1μm；hyt、nr：20μm；tris-hcl：ph 8.0，10mm。
56.图4为hyt-nr体系响应cu
2
的可能的反应机理图；
57.图5是本发明中不同条件下量子点在605nm处的荧光信号和不同条件下hyt-nr-qds体系在605nm处的荧光光谱图。其中a图是在不同条件下量子点在605nm处的荧光信号；其中，a图中(a)qds；(b)hyt qds；(c)nr qds；(d)hyt nr qds；(e)cu
2
qds；(f)cu
2
hyt qds；(g)cu
2
nr qds；b图是在不同条件下hyt-nr-qds体系在605nm处的荧光光谱图：(i)hyt nr qds；(ii)cu
2
hyt qds；(iii)cu
2
nr qds；(iv)cu
2
hyt nr qds；cu
2
：1μm；hyt、nr：20
μm；qd：10nm；tris-hcl：ph 8.0,10mm，b图中的插图为溶液在405nm灯下的照片。
58.图6是本发明中加入不同cu
2
浓度时的hyt-nr-qd体系的荧光和hyt-nr体系的荧光光谱变化图，其中，a图是加入不同cu
2
浓度时hyt-nr-qd体系的荧光光谱变化图，b图是加入不同cu
2
浓度时的hyt-nr体系的荧光光谱变化图；a图和b图中的插图为不同浓度cu
2
时体系在405nm灯下的颜色变化。
59.图7为随着cu
2
浓度的变化hyt-nr-qd体系在f
480
/f
605
的工作曲线图。hyt、nr：20μm；qd：10nm；tris-hcl：ph8.0,10mm。
60.图8是本发明中基于hyt-nr-qd体系对cu
2
和不同金属离子的选择性研究图，其中，a图是hyt-nr-qd体系对cu
2
的选择性研究图，b图是hyt-nr-qd体系对不同金属离子的荧光响应。加入其他金属离子浓度均为5μm；cu
2
：1μm；hyt、nr：20μm；qd：10nm；tris-hcl：ph 8.0,10mm。插图为在405nm灯下相对应的图片。
61.试剂和设备
62.羟基酪醇(hyt)，间萘二酚(nr)，三羟甲基氨基甲烷(tris)购于安耐吉化学(安徽，中国)，无水硫酸铜(cuso4)和其他金属盐购于中化科技有限公司(北京，中国)。zncdse/zns量子点购于武汉珈源量子点技术开发有限责任公司。所有的化学试剂均为分析级无需其他处理，整个实验过程所使用的超纯水电阻率大于18.2mωcm-1
。
63.荧光光谱和紫外-可见吸收光谱分别测定于荧光分光光度计(日立，f-7000)和紫外-可见光谱仪(uv-9000s,metash)上。荧光图像在405nm蓝色灯(zluv lamp,深圳)下拍摄。透射电镜(tem)图像和能谱(eds)是在fei tabs f200x场发射显微镜(thermo scientific,美国)上获得的。使用axis ultra dld光谱仪(kratos,uk)记录x射线光电子能谱(xps)。1h nmr和13c nmr谱数据在nmr光谱仪(bruker 500mhz)上采集，并在dmso-d6中完成。液相色谱分析和质谱采用高效液相色谱/飞行时间质谱(hplc/tof-ms,agilent technologies,1260-6224)。
64.实验例1
65.hyt-nr体系对于cu
2
的响应
66.将不同浓度的cu
2
溶液加入在含有10μl 100mm tris-hcl、10μl 200μmhyt和10μl 200μm nr的混合液中，补充超纯水至溶液体积为100μl，在37℃下孵育25min，随后在385nm的激发波长下测量其荧光光谱。
67.实验例2
68.基于hyt-nr-qd体系检测cu
2
69.铜离子检测：将10μl不同浓度的cu
2
溶液加入含有10μl 100mm tris-hcl、10μl 200μm hyt和10μl 200μm nr的混合液中，补充超纯水至溶液体积为90μl，在37℃下孵育25min，反应完后向溶液中加入10μl 100nm的qd溶液，随后在385nm的激发波长下测量其荧光光谱。
70.实验例3
71.选择性研究试验
72.用该比率型传感器对cu
2
的选择性进行了评价。简单地说，将10μl 100mm tris-hno3、10μl 200μm hyt、10μl 200μm nr的反应溶液与10μl不同的金属离子(cu
2
1μm；na
、k
、ca
2
、mg
2
、zn
2
、cd
2
、fe
2
、hg
2
、zr
4
、mn
2
、ni
2
、pb
2
、co
2
、ag
均为5μm)，之后的其他操作步骤
与实施例1相似。
73.实验例4
74.实际水样检测试验
75.自来水和湖水样品从南昌航空大学校园内采集，江水样品为赣江江水，水样通过孔径为0.22μm的过滤膜进行过滤。然后加入不同浓度的cu
2
标准溶液制得一系列水样。将这些加标样品(50μl)与含有10μl 100mm tris-hcl、10μl200μm hyt和10μl 200μm nr混合，补充超纯水至溶液体积为90μl，在37℃下孵育25min，反应完后向溶液中加入10μl 100nm的qd溶液，随后在385nm的激发波长下测量其荧光光谱。
76.测试例1
77.cu
2
触发hyt-nr反应的验证
78.首先考察了hyt-nr混合物在ph 8.0的tris-hcl缓冲液中对cu
2
的荧光响应。如图2中的a图所示，与仅存在hyt或nr的溶液类似(曲线a和曲线b)，hyt和nr的混合溶液也所产生的荧光基本可以忽略不计(曲线c)。此外，可以观察到只有hyt或nr与cu
2
混合时(曲线d、e)，也只能产生很低的fl信号。然而，当cu
2
加入到hyt-nr混合溶液中在37℃下反应25分钟后，值得注意的是，在405nm照射下，共存的cu
2
、hyt和nr产生一个明亮的青光(插图f)，并可以在相应的荧光光谱中检测到一个在480nm的强荧光发射峰(曲线f)，这与文献报道的在强碱条件下(碳酸盐缓冲液，ph 11.0)hyt与nr反应生成的荧光产物的荧光特征光谱一致。hplc/tof-ms结果表明，弱碱性条件下cu
2
存在时hyt和nr反应产物的摩尔质量(310.08g.mol-1
)和停留时间与在强碱性溶液中无cu
2
加入的hyt和nr反应产物相同，说明加入cu
2
后发生hyt-nr反应，形成荧光团化合物(即fluo)。
79.为了验证cu
2
可诱导hyt与nr的反应，采集了不同条件下hyt与nr的紫外-可见光谱。如图2中b图所示，hyt和nr的混合溶液(曲线c)是hyt和nr吸收带的简单总和，对照实验表明cu
2 -hyt组(曲线d)或cu
2 -nr组(曲线e)在可见区域内不能产生任何可识别的吸收。相反，cu
2 -hyt-nr基溶液极大地削弱了hyt和nr原有的吸收峰，并在458nm处出现了一个显著的新吸收峰(曲线f)。此外，通过nmr谱确定了cu
2 -hyt-nr体系产生的主要荧光产物的结构。这些结果证实了cu
2
、hyt和nr在fluo形成中的关键作用。随后，进一步研究了其他金属离子和阴离子对hyt-nr体系的影响。从图3可以看出，只有cu
2
能诱导出强的fl信号，说明该系统对cu
2
具有较高的识别选择性。另外，荧光光谱也验证了cu
2
诱导hyt-nr的浓度依赖性反应(见图6中的b图)。
80.测试例2
81.cu
2
检测可能的机理
82.为了确定hyt-nr体系对cu
2
的特征响应，讨论了可能的反应机理。据文献报道，cu
2
具有氧化酶活性可以催化儿茶酚氧化成相应的半醌自由基，再氧化成邻醌结构，由此我们推测cu
2
在hyt-nr体系中可能是作为催化剂作用加速了荧光团的产生。为了证实这一假设，我们分析了在含有cu
2
(6μm)和nr(20μm)的溶液中，加入不同浓度hyt，该溶液在458nm处随着时间增长吸光度的变化。可以观察到，cu
2
催化hyt与nr的反应的确受到hyt浓度的控制，随着hyt浓度的增加，荧光团的生成速率加快。我们还发现在不同浓度cu
2
的存在下随着hyt浓度的增加，体系中形成荧光团速率变化趋势，cu
2
浓度越高，形成荧光团过程就越快。利用michaelis-menten模式分析曲线可知每1μm cu
2
催化剂的vmax值为0.18μm min-1
。同时，对
照实验表明，溶液中不存在cu
2
时并不会有荧光团生成，证明cu
2
的确是促进hyt-nr反应的有效催化剂。根据这一结果，我们对hyt-nr与cu
2
反应可能发生的机理进行了推测，如图4所示，图4是本发明中hyt-nr体系响应cu
2
的可能的反应机理图；cu
2
存在时，hyt会与cu
2
发生氧化还原反应，生成cu
和半醌自由基，而半醌自由基又被溶液中所存在的o2氧化成邻醌结构，同时生成超氧自由基(
·o2-)。由此所得到的邻醌结构通过分子间迈克尔加成进一步与nr反应，随后进行分子内环化，最终形成荧光团。值得注意的是，在反应过程中，生成的cu
会被o2和
·o2-再次氧化为cu
2
，而产生的cu
2
又会氧化hyt，从而开始一个新的荧光反应循环，直到hyt全部被反应完。
83.为了验证溶解的o2在反应体系中的作用，溶液加入cu
2
之前，向hyt和nr混合溶液中充入n2来去除溶液中的o2。结果显示，该溶液在405nm灯下的青光与在氧气条件下反应相比颜色较浅，并且可以明显观察到在480nm处荧光强度明显降低，表明氧气确实参与了荧光反应。后续通过紫外-可见光谱以及利用典型的cu
显色剂-新亚铜灵试剂，证实了该hyt-nr-cu
2
体系中cu
的生成。之后我们还考察了与hyt结构相似的物质(如左旋多巴、多巴胺)。结果显示，左旋多巴和多巴胺在cu
2
与nr的混合溶液中也会有相似的荧光信号产生，这主要是由于cu
2
也可以催化左旋多巴或多巴胺氧化成相应的邻醌结构，邻醌结构进一步与nr反应，通过分子内环化反应生成具有强发射的化合物。以上实验结果表明了我们所提出的反应机理是合理的。
84.测试例3
85.荧光团与量子点的内滤效应
86.在该方法中，我们选择商业化的红色荧光zncdse/zns量子点(qds)用于双发射荧光传感器的构建。值得注意的是，在400～600nm范围内，qds的激发带和荧光团的吸收带之间存在较大的光谱重叠，这意味着qds与荧光团(fluo)之间可能会有ief的产生。为了验证量子点与荧光团之间的确存在ief过程，研究了加入纯化的荧光团(20μm)前后量子点的荧光光谱变化。正如我们所预期的，随着纯化后的荧光团的加入，量子点在605nm处的荧光发射降低了25.05％，这一结果证实了荧光团(fluo)对量子点的荧光猝灭主要源于量子点与荧光团之间的ief效应。
87.测试例4
88.cu
2
和cu
对量子点的猝灭效应
89.据文献报道，cu
2
和cu
都可以淬灭半导体量子点的荧光。而上述实验结果表明，在hyt和nr存在的情况下，cu
2
会转化为cu
，cu
则又被o2进一步氧化为cu
2
，因此我们推测cu
2 -hyt-nr溶液的加入会导致量子点的荧光强度下降。为了验证我们的猜想，我们进行了验证实验。从图5a可知，cu
2
先与hyt和nr混合溶液反应，再与量子点混合后，量子点的荧光强度显著下降，这与单独的cu
2
作用量子点时的荧光信号接近。随后我们进一步将含有cu
2 -hyt或cu
2 -nr的溶液作为对照实验并对其荧光光谱进行了测定，可以观察到量子点的荧光强度也大大降低。此外，我们还注意到nr和hyt本身对量子点的荧光强度均没有明显影响。这些实验结果证明了我们的推测是合理的，即cu
2
在hyt-nr体系中的存在可以导致量子点的荧光发生猝灭。
90.之后我们还对cu
2
/cu
对量子点的猝灭机理进行了研究。结果显色，cu
2
的吸收光谱中几乎没有可见峰的出现，因此可以排除量子点是与cu
2
之间发生了荧光共振能量转移
(fret)这一可能性。此外，tem图像显示，hyt、nr和cu
2
的反应混合物并没有引起量子点聚集，量子点在溶液中仍然呈分散状态。因此，我们猜测cu
2
/cu
引发zncdse/zns量子点的荧光猝灭机制与之前文献中报道的cu
2
/cu
对cdse量子点的荧光猝灭机制相似。cu
2
/cu
可以穿透zncdse/zns量子点核壳结构的间隙，并与量子点的核表面发生强烈的相互作用。由于表面的zn
2
/cd
2
与cu
2
/cu
之间发生特定的阳离子交换反应，在量子点表面形成了低可溶性的cuse或cu2se粒子，从而使zncdse/zns量子点的荧光发生猝灭。
91.测试例5
92.可行性分析试验
93.为了证明nr-hy-qds比率型荧光传感平台可以被成功构建，通过荧光光谱(图5b)和可视化检测(图5b插图)在不同条件下进行了研究。我们将含有nr、hyt和qds的混合溶液作为对比(即不含cu
2
)，从图5b的曲线i可知，在385nm光激发下，只观察到由量子点引发的在605nm的强荧光发射。相反，当cu
2
加入到nr和hyt混合液中反应25min后加入qds，可以注意到，qds在605nm处的荧光强度被明显猝灭，而在480nm处出现了一个新的源自于荧光团的荧光发射峰(曲线iv)。相反，不含hyt或nr的对照样在480nm处荧光信号基本可以忽略不计，并且在605nm处的荧光强度也很低(曲线ii和iii)。此外，基于荧光强度比值f
480
/f
605
的变化，hyt-nr-qds传感器在405nm灯下显示了依赖于cu
2
的由红光变为青光的荧光颜色变化(如图5b插图所示)。以上结果表明，该比率型传感器在cu
2
的可视化分析中具有潜在的应用价值。
94.实验例6
95.为了提高hyt-nr-qds测cu
2
的灵敏度和效率，对一些重要的参数如hyt与nr反应的孵育ph、反应时间和温度进行了优化。首先，考察了反应ph值对实验的影响。结果显示，hyt nr的样在ph 6.0-8.0范围内几乎没有明显的信号变化，但当ph》8.0时，荧光信号开始逐渐增加。cu
2
hyt nr的样在ph 6.0-8.0范围内，荧光随ph的增加而显著增强，然而，当ph》8.0后荧光开始下降，因此，我们选择ph 8.0作为实验的最佳ph。有趣的是，本发明人发现溶液的ph值对反应速率也有相当大的影响。当ph值从7.0增加到8.0时，cu
2
的反应时间从80min明显减少到25min，因此25min为最佳孵育时间。在前面研究的基础上，考察了反应温度的影响。结果显色，体系的相对荧光值在37℃达到了最高点，因此，我们将37℃确定为最佳反应温度。基于以上实验数据，我们确定实验的最佳反应条件为ph 8.0的溶液中，37℃培育25min。
96.测试例7
97.比率型荧光法测定cu
2
98.在上述优化条件下，对hyt-nr-qds传感器检测cu
2
的分析性能进行了评价。图6中a图显示了不同浓度cu
2
从0到1μm时体系的荧光光谱和溶液的颜色变化，可以观察到，在该比例型荧光传感体系中，所产生荧光团在480nm处的荧光强度逐渐增大，而量子点在605nm处的荧光强度不断降低。图7显示f
480
/f
605
在0.0～0.3μm(r2＝0.9822)和0.3～2μm(r2＝0.9954)范围内与cu
2
浓度有着较好的线性，其线性方程分别为f
480
/f
605
＝8.9531c
cu2
0.0693和f
480
/f
605
＝34.314c
cu2
－9.3348，并通过计算得出检出限为3.42nm(3δ/斜率)。值得一提的是，在405nm灯下，随着铜离子浓度的增加，溶液颜色呈现由红色，变为暗红色，再到棕色，最后变为青色的变化，肉眼最低可以检测到0.2μm cu
2
，这大大低于美国环境保护
署(epa)规定的饮用水安全限值(20μm)。我们将本方法与以往基于不同有机染料/纳米材料/dna cu
2
的分析方法做比较。如表1所示，该方法不需要复杂的合成及化学修饰，对cu
2
的检测下限相比其他方法相当或低很多。此外，由图6中b图所示可知，该比率型荧光传感器与基于hyt-nr体系检测cu
2
的单发射传感器在可视化检测方面相比溶液颜色变化更丰富且更容易识别，由此表明，比率型荧光传感器相较于单发射传感器在可视化检测方面更加灵敏可靠。
99.表1：cu
2
检测方法的比较
[0100][0101]
测试例8
[0102]
选择性评价测试
[0103]
为了考察hyt-nr-qds体系对cu
2
的选择性，将体系中cu
2
用其他金属离子代替进行了研究，主要包括na
、k
、ca
2
、mg
2
、zn
2
、cd
2
、fe
2
、hg
2
、zr
4
、mn
2
、ni
2
、pb
2
、co
2
、ag
。如图8中的b图所示，cu
2
的加入可以使480nm处的荧光强度明显增加，605nm处的荧光强度急剧下降，同时在405nm灯下溶液颜色发生了明显的变化，由红色变为青色(如图8中a图中的插图所示)。然而，其他金属离子都不能引起相似的荧光光谱和颜色变化。进一步在cu
2
存在的情况下，我们通过加入上述金属阳离子，进行了共存干扰实验的研究。从图中可以看出，共存的金属离子对体系识别cu
2
的影响基本可以忽略。这主要是由于hyt-nr体系对cu
2
的检测具有良好的选择性和抗干扰性能以及量子点对cu
2
的良好识别能力。
[0104]
测试例5
[0105]
为了评价本方法在实际水样中检测cu
2
的实用性，我们对学校内的湖水以及自来水样品外加赣江水样通过标准加入法对cu
2
进行了检测，采集来的样品通过0.22μm滤膜进行了过滤预处理，在之后的实验中直接使用。结果如表2所示，
[0106]
表2：比率型分析方法与icp-ms法检测水样中cu
2
的性能比较(n＝3)
[0107][0108]
实际水样中的回收率在94.90％～108.80％，rsd在2.5％～6.4％，为了进一步考察该方法的准确性，我们使用icp-ms法对上述实际样品中cu
2
的含量进行了测定，结果显示，我们建立的比率型传感器与icp-ms法得到的结果相近，表明该方法具有较高的准确度，可以用于实际样品中cu
2
的检测。
[0109]
在不出现冲突的前提下，本领域技术人员可以将上述附加技术特征自由组合以及叠加使用。
[0110]
以上所述仅为本发明的优先实施方式，只要以基本相同手段实现本发明目的的技术方案都属于本发明的保护范围之内。