1.本发明属于药物化学技术领域，具体涉及吲哚-3-甲酸衍生物与氟康唑联合在制备抗耐药白念珠菌药物中的应用。
背景技术：
2.白念珠菌(candiada albicans)作为一种机会性真菌病原体对人类的健康有很大威胁，尤其对于免疫缺陷人群，随着抗菌药物（氟康唑、伊曲康唑等）在临床上的大量应用，白念珠菌的耐药性逐渐增强，因此发现新的抗真菌药物或具有新的结合机制的抑制剂来治疗唑类侵袭性念菌株病具有重要意义。
3.吲哚及其衍生物作为许多药物以及天然产物的重要核心骨架，其合成研究备受关注。其中以吲哚为先导化合物进行结构修饰合成许多吲哚衍生物，且经研究发现这些化合物具有抗炎、抗肿瘤、抗菌等活性。吲哚及其衍生物可以通过调节影响白念菌株丝化和生物膜形成的转录因子nrg1来减弱真菌的毒性，且吲哚胺类衍生物对成熟的白念珠菌的细胞膜具有活性。基于文献报道和课题组在前期实验中发现3-取代吲哚衍生物具有抗白念珠菌活性的作用，所以我们合成了含有酰胺和酯的一系列化合物，将所有合成的化合物进行体外抗白念珠菌活性测试，希望为抗真菌药物的研发和克服耐药性提供新的思路。
4.申请人开展了吲哚-3-甲酸衍生物的合成研究工作。在研究过程中，申请人试验得出吲哚-3-甲酸衍生物与氟康唑联合产生协同抗耐药白念珠菌的作用。
技术实现要素：
5.本发明的目的在于提供吲哚-3-甲酸衍生物与氟康唑联合在制备抗耐药白念珠菌药物中的应用，吲哚-3-甲酸衍生物的化学结构为：。
6.吲哚-3-甲酸衍生物与氟康唑的质量比为1:1。
7.耐药白念珠菌为耐药白念珠菌sc5314-fr、atcc14053。
8.进一步的，吲哚-3-甲酸衍生物的化学结构为：
。
9.进一步的，吲哚-3-甲酸衍生物的化学结构为：。
10.进一步的，吲哚-3-甲酸衍生物的化学结构为：。
11.进一步的，吲哚-3-甲酸衍生物的化学结构为：。
12.进一步的，吲哚-3-甲酸衍生物的化学结构为： 。
13.进一步的，吲哚-3-甲酸衍生物的化学结构为：。
14.进一步的，耐药白念珠菌为耐药白念珠菌sc5314-fr、atcc14053。
15.吲哚-3-甲酸衍生物的制备的具体步骤为：（1）合成吲哚-3-甲酸衍生物1-4：以吲哚3-甲酸与不同的胺类化合物在1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride，edci]、1-羟基苯并三唑（1-hydroxybenzotriazole，hobt)、三乙胺(et3n)的条件下发生缩合反应得到化合物1-4，路线见图2。
[0016]
（2）合成3-取代吲哚衍生物5-6：具体合成路线为：以吲哚3-甲酸与不同的醇类化合物在edci、4-二甲氨基吡啶(4-dimethylaminopyridine，dmap)的条件下发生缩合反应得到化合物5-6，路线见图3。。
[0017]
本发明优点：
本发明提供吲哚-3-甲酸衍生物与氟康唑联合在制备抗耐药白念珠菌药物中的应用，吲哚-3-甲酸衍生物和氟康唑单独使用对耐药白念珠菌抗菌作用弱，联合使用化合物1、2、5、6对耐药白念珠菌有协同抗菌作用。本发明所提供的吲哚-3-甲酸衍生物制备方法简单，与氟康唑联合抗耐药白念珠菌效果显著，有望进一步解决耐药白念珠菌感染。
附图说明
[0018]
图1为本发明所述的吲哚-3-甲酸衍生物1、2、3、4、5、6的结构式；图2为合成化合物1、2、3、4的合成路线；图3为合成化合物5、6的合成路线；图4为吲哚-3-甲酸衍生物1的核磁共振氢谱(1h nmr) 图；图5为吲哚-3-甲酸衍生物1的核磁共振碳谱(
13
c nmr) 图；图6为吲哚-3-甲酸衍生物2的核磁共振氢谱(1h nmr) 图；图7为吲哚-3-甲酸衍生物2的核磁共振碳谱(
13
c nmr) 图；图8为吲哚-3-甲酸衍生物3的核磁共振氢谱(1h nmr) 图；图9为吲哚-3-甲酸衍生物3的核磁共振碳谱(
13
c nmr) 图；图10为吲哚-3-甲酸衍生物4的核磁共振氢谱(1h nmr) 图；图11为吲哚-3-甲酸衍生物4的核磁共振碳谱(
13
c nmr) 图；图12为吲哚-3-甲酸衍生物5的核磁共振氢谱(1h nmr) 图；图13为吲哚-3-甲酸衍生物5的核磁共振碳谱(
13
c nmr) 图；图14为吲哚-3-甲酸衍生物6的核磁共振氢谱(1h nmr) 图；图15为吲哚-3-甲酸衍生物6的核磁共振碳谱(
13
c nmr) 图。
具体实施方式
[0019]
下面对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明所作的任何变换，均属于本发明的保护范围。
[0020]
本发明的目的在于提供吲哚-3-甲酸衍生物与氟康唑联合在制备抗耐药白念珠菌药物中的应用。
[0021]
吲哚-3-甲酸衍生物与氟康唑的质量比为1:1。
[0022]
3吲哚-3-甲酸衍生物的化学结构为：。
[0023]
吲哚-3-甲酸衍生物的化学结构为：。
[0024]
吲哚-3-甲酸衍生物的化学结构为：。
[0025]
吲哚-3-甲酸衍生物的化学结构为：。
[0026]
吲哚-3-甲酸衍生物的化学结构为：。
[0027]
吲哚-3-甲酸衍生物的化学结构为：。
[0028]
耐药白念珠菌为耐药白念珠菌sc5314-fr、atcc14053。
[0029]
吲哚-3-甲酸衍生物的结构式见图1。
[0030]
吲哚-3-甲酸衍生物的制备的具体步骤为：（1）合成吲哚-3-甲酸衍生物1-4：以吲哚3-甲酸与不同的胺类化合物在edci-hobt-et3n的条件下发生缩合反应得到化合物1-4，路线见图2（2）合成吲哚-3-甲酸衍生物5-6：具体合成路线为：以吲哚3-甲酸与不同的醇类化合物在edci-dmap的条件下发生缩合反应得到化合物5-6；具体合成路线见图3。
[0031]
实施例1吲哚-3-甲酸衍生物的合成方法(1)的合成
[0032]
在干燥圆底瓶中加入吲哚3-甲酸(164 mg,1 mmol)，对甲氧基苯胺(123 mg,1 mmol)，edci(217 mg,1.1 mmol)，hobt(149 mg,1.1 mmol),加入干燥的dcm(5 ml)使其溶解后。在冰浴下缓慢加入et3n(321
ꢀµ
l,2.3 mmol),加入完毕后，升至室温搅拌反应过夜。tlc监测反应完全，反应结束后，将反应液旋干，经硅胶柱层析(洗脱剂:石油醚/乙酸乙酯=1.5/1，v/v)纯化，得化合物152 mg。
[0033]
(1)：白色固体，产率20%，m.p. 186.5-187.1℃.1h nmr (600 mhz, meod)δ8.17 (d, j = 7.8 hz, 1h), 8.04 (s, 1h), 7.56
ꢀ–ꢀ
7.53 (m, 2h,), 7.44 (d, j = 8.0 hz, 1h), 7.19 (tdd, j = 15.0, 10.6, 4.0 hz, 2h), 6.93
ꢀ–ꢀ
6.90(m, 2h), 3.79 (s, 3h,).
13
c nmr (150 mhz, meod) δ 166.80, 157.83, 138.15, 133.12, 129.19, 127.56, 124.02, 123.60, 122.0, 114.95, 112.76, 112.09,55.88.核磁共振氢谱(1h nmr) 图见图4；核磁共振碳谱(
13
c nmr) 图见图5。
[0034] (2)的合成
[0035]
在干燥圆底瓶中加入吲哚3-甲酸(164 mg,1 mmol)，苯胺(91
ꢀµ
l,1 mmol)，edci(217 mg,1.1 mmol)，hobt(149 mg,1.1 mmol),加入干燥的dcm(5 ml)使其溶解后。在冰浴下缓慢加入et3n(321
ꢀµ
l,2.3 mmol),加入完毕后，升至室温搅拌反应过夜。tlc监测反应完全，反应结束后，将反应液旋干，经硅胶柱层析洗脱剂:(石油醚/乙酸乙酯=1.5/1，v/v)纯化，得化合物243 mg。
[0036]
(2)：白色固体，产率18%，m.p. 159.9-161.1℃.1h nmr (600 mhz, meod)δ8.19 (d, j = 7.7 hz, 1h), 8.08 (s, 1h), 7.69
ꢀ–ꢀ
7.66 (m, 2h,), 7.44 (d, j = 8.1 hz, 1h), 7.34 (t, j =7.9 hz, 2h), 7.19 (dt, j = 14.9, 7.1 hz, 2h), 7.10 (t, j = 7.4 hz, 1h).
13
c nmr (150 mhz, meod) δ 166.81, 140.28, 138.15,129.74, 129.40, 127.60, 124.83,123.66, 122.13, 122.07, 122.03, 112.78, 112.08. 核磁共振氢谱(1h nmr) 图见图6；核磁共振碳谱(
13
c nmr) 图见图7。
[0037] (3)的合成
[0038]
在干燥圆底瓶中加入吲哚3-甲酸(164 mg,1 mmol)，苄胺(109
ꢀµ
l,1 mmol)，edci(217 mg,1.1 mmol)，hobt(149 mg,1.1 mmol),加入干燥的dcm(5 ml)使其溶解后。在冰浴下缓慢加入et3n(321
ꢀµ
l,2.3 mmol),加入完毕后，升至室温搅拌反应过夜。tlc监测反应完全，反应结束后，将反应液旋干，经硅胶柱层析洗脱剂:(二氯甲烷/甲醇=50/1，v/v)纯化，得化合物3180 mg。
[0039]
(3)：白色固体，产率72%，m.p. 176.2-177.2℃.1h nmr (600 mhz, meod) δ 8.12 (d, j = 7.9 hz, 1h), 7.90 (s, 1h), 7.42 (d, j = 8.1 hz, 1h), 7.38 (d, j = 7.6 hz, 2h), 7.32 (t, j =7.6 hz, 2h), 7.23 (t, j = 6.8 hz, 1h), 7.17 (dt, j = 14.9, 7.1 hz, 2h), 4.60 (s, 2h).
13
c nmr (150 mhz, meod) δ 168.44, 140.84, 138.11, 129.49, 129.04, 128.44, 128.00, 127.17, 123.48, 121.97, 121.78, 112.76, 111.80, 43.88. 核磁共振氢谱(1h nmr) 图见图8；核磁共振碳谱(
13
c nmr) 图见图9。
[0040]
(4)的合成
[0041]
在干燥圆底瓶中加入吲哚3-甲酸(164 mg,1 mmol)，十八胺(284 mg,1mmol)，edci(217 mg,1.1 mmol)，hobt(149 mg,1.1 mmol),加入干燥的dcm(5 ml)使其溶解后。在冰浴下缓慢加入et3n(321
ꢀµ
l,2.3 mmol),加入完毕后，升至室温搅拌反应过夜。tlc监测反应完全，反应结束后，将反应液旋干，经硅胶柱层析洗脱剂:(二氯甲烷/甲醇=50/1，v/v)纯化，得化合物4360 mg。
[0042]
(4)：白色固体，产率87%，m.p. 83.7-84.0℃.1h nmr (600 mhz, cdcl3) δ 9.29 (s, 1h), 7.92
ꢀ–ꢀ
7.89 (m, 1h), 7.72 (d, j = 2.6 hz), 7.45
ꢀ–ꢀ
7.42 (m, 1h), 7.27
ꢀ–ꢀ
7.23 (m, 2h),3.51 (dd, j = 13.2, 6.8 hz, 2h), 1.65 (dt, j = 14.9, 7.3 hz, 2h), 1.30
ꢀ–ꢀ
1.24 (m, 30h), 0.88 (t, j = 6.9 hz, 3h).
13
c nmr (150 mhz, cdcl3) δ 165.75, 136.61, 128.29, 124.65, 122.94, 121.66, 119.74, 112.66, 112.30,39.80, 32.07, 30.09, 29.85, 29.81, 29.77, 29.73, 29.53, 29.51, 27.25, 22.84, 14.27. 核磁共振氢谱(1h nmr) 图见图10；核磁共振碳谱(
13
c nmr) 图见图11。
[0043]
(5)的合成
[0044]
在干燥圆底瓶中加入吲哚3-甲酸(164 mg,1 mmol)，4-甲氧基苯甲醇(127
ꢀµ
l,1mmol)，edci(217 mg,1.1 mmol)，hobt(149 mg,1.1 mmol),加入干燥的dcm(5 ml)使其溶解后。在冰浴下缓慢加入et3n(321
ꢀµ
l,2.3 mmol),加入完毕后，升至室温搅拌反应过夜。tlc监测反应完全，反应结束后，将反应液旋干，经硅胶柱层析洗脱剂:(石油醚/乙酸乙酯=4/1，v/v)纯化，得化合物5155 mg。
[0045]
(5)：白色固体，产率55%，m.p. 124.1-125.7℃.1h nmr (600 mhz, cdcl3) δ 8.17
ꢀ–ꢀ
8.14 (m, 1h), 7.85 (s, 1h), 7.39 (d, j = 8.5 hz,1h), 7.27 (d, j = 7.8 hz, 1h), 7.25
ꢀ–ꢀ
7.20 (m, 1h), 6.91
ꢀ–ꢀ
6.86(m, 4h), 5.31 (s, 2h), 3.78 (d, j = 5.2 hz, 3h).
13
c nmr (150 mhz, cdcl3) δ 165.45, 159.56, 136.28, 133.16, 130.01, 128.80, 125.91, 123.21, 122.13, 121.56, 114.07, 114.06, 111.74, 108.59, 65.55, 65.10, 55.39. 核磁共振氢谱(1h nmr) 图见图12；核磁共振碳谱(
13
c nmr) 图见图13。
[0046] (6)的合成
[0047]
在干燥圆底瓶中加入吲哚3-甲酸(164 mg,1 mmol)，环己甲醇(126
ꢀµ
l,1mmol)，edci(217 mg,1.1 mmol)，hobt(149 mg,1.1 mmol),加入干燥的dcm(5 ml)使其溶解后。在冰浴下缓慢加入et3n(321
ꢀµ
l,2.3 mmol),加入完毕后，升至室温搅拌反应过夜。tlc监测反应完全，反应结束后，将反应液旋干，经硅胶柱层析洗脱剂:(石油醚/乙酸乙酯=4/1，v/v)纯化，得化合物6123 mg。
[0048]
(6)：白色固体，产率48%，m.p. 115.4-116.5℃.1h nmr (600 mhz, cdcl3) δ 8.93 (s, 1h), 8.18 (dd, j = 8.1, 6.8 hz), 7.90 (d, j = 2.9 hz, 1h), 7.40 (dd, j = 6.9, 1.7 hz, 1h), 7.29
ꢀ–ꢀ
7.27 (m,1h), 7.26
ꢀ–ꢀ
7.23 (m, 1h), 4.17 (d, j = 6.4 hz, 2h), 1.89
ꢀ–ꢀ
1.73 (m,5h), 1.71
ꢀ–ꢀ
1.67 (m, 1h), 1.34
ꢀ–ꢀ
1.16 (m, 3h), 1.09 (qd, j = 12.4, 3.4 hz, 2h).
13
c nmr (150 mhz, cdcl3) δ 165.92, 136.35, 131.43, 125.88, 123.23, 122.13, 121.58, 111.80, 109.06, 69.29, 37.56, 30.04, 26.56, 25.89. 核磁共振氢谱(1h nmr) 图见图14；核磁共振碳谱(
13
c nmr) 图见图15。
[0049]
实施例2抗真菌活性测试一、材料和方法1、药物和样品吲哚3-甲酸衍生物1、2、3、4、5、6由实施例1制备。
[0050]
阳性对照药物氟康唑（flc）溶于dmso，超声10 min，离心取上清液，储存浓度为50 mg/ml，于4℃冰箱密封保存。样品1、2、3、4、5、6均用dmso溶解，浓度为50 mg/ml，于4℃冰箱密封保存。
[0051]
2、培养基及菌株（1）培养基沙氏液体培养培养基、沙氏固体培养基。
[0052]
（2）菌株白念珠菌氟康唑敏感株sc5314、白念珠菌氟康唑耐药株sc5314-fr、atcc14053。
[0053]
3、实验方法取96孔培养板，样品及氟康唑均稀释成初浓度为200μg/ml，每孔100μl，进行5倍倍比稀释，6个浓度梯度，每个浓度梯度3个重复孔。菌株活化2次后制备菌悬液，在96孔板内各孔加入真菌菌悬液100μl，使白念珠菌的终浓度为1
×
105cfu/ml，于37℃恒温培养箱内孵育24h。酶标仪测定625nm下的od值。实验同时设置培养基空白对照、菌液对照以及氟康唑阳性药物对照。样品与氟康唑的质量比为1：1。
[0054]
4、计算公式真菌活性抑制率（%）=（1
–
样品od值/实验对照孔od值）
×
100%联合指数（fici）：fici=mica/a micb/b（式中a和b分别为两药单用时的mic值，mica和micb分别为两药联合时的mic值。当mic值高于检测最高限时以最高限浓度的两倍值用以计算fici。本实验中mic50值的计算以氟康唑的最小真菌生长50%时的抑制百分数来计算。当fici≤0.5时，两药的作用方式为协同；当0.5＜fici≤4时，两药的作用方式为无关；当fici＞4时，两药的作用方式为拮抗。
[0055]
二、结果
表1待测样品与氟康唑对白念珠菌的抑菌活性实验汇总表。
[0056]
与氟康唑联合只对耐药白念珠菌有协同抗菌作用的样品有：1、2、5、6。
[0057]
综上所述，吲哚-3-甲酸衍生物和氟康唑单独使用对耐药白念珠菌抗菌作用弱，吲哚-3-甲酸衍生物1、2、5、6分别与氟康唑联合使用对耐药白念珠菌有协同抗菌作用。