一种可以负载并缓控释prp的生物医药材料的制备方法
技术领域
1.本发明涉及生物医药材料领域，具体为一种可以负载并缓控释prp的生物医药材料的制备方法。
背景技术：
2.现阶段，人类辅助生殖技术(assisted reproductive technology,art)是解决不孕不育问题的成熟策略及途径，优质的胚胎、良好的宫腔形态、理想的子宫内膜厚度在维持正常妊娠中起到关键作用。子宫内膜腺体的增殖与血管的生成是胚胎着床前子宫内膜准备的条件，临床体现于子宫内膜的厚度。然而，人工流产、频繁的宫腔手术等物理性因素，以及感染、激素类药物等生化性因素均能破坏子宫内膜微环境，造成子宫内膜受损、内膜再生障碍，引起炎症反应、异常血管生成、子宫内膜容受性下降，影响胚胎植入及着床，最终导致妊娠率降低、不良妊娠结局风险增加。损伤内膜的再生修复，是目前生殖领域最棘手的临床问题之一。薄型子宫内膜是子宫内膜损伤的主要表现，其在art的发生率约为2.4％-8.5％。
3.目前对于子宫内膜损伤后的修复与再生是临床治疗的瓶颈，也是临床医生面临的巨大挑战之一。现阶段临床治疗本病的方法主要包括激素治疗、低剂量阿司匹林、西地那非、粒细胞集落刺激因子(g-csf)宫腔灌注、仿生物电刺激、骨髓或经血来源的干细胞、富血小板血浆(platelet-rich plasma，prp)宫腔灌注治疗。prp是全血离心后富含高浓度血小板的血浆浓缩物，其能释放多种生长因子及细胞因子，如tgf-β、egf、igf-1、igf-2、bfgf、vegf等，prp宫腔灌注作为近些年出现的新的治疗方式治疗薄型子宫内膜取得一定效果，但临床上应用prp时因其生长因子释放快及灌注后反流限制疗效，通常需要3次以上的灌注治疗才会达到效果。因此，迫切需要探寻一种能够高效负载并缓释prp的生物材料。
技术实现要素：
4.针对现有技术的不足，本发明提供了一种可以负载并缓控释prp的生物医药材料的制备方法，解决了临床上应用prp时因其生长因子释放快及灌注后反流限制疗效，通常需要3次以上的灌注治疗才会达到效果的问题，实现延长prp的作用时间，代替传统prp多次宫腔灌注的治疗方式，减少资源浪费。
5.为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种可以负载并缓控释prp的生物医药材料的制备方法，包括以下步骤：
6.步骤一、配置引发剂标准溶液：取pbs缓冲液加入装有引发剂lap的棕瓶中，以水浴加热溶解，震荡数次，制得引发剂标准溶液；
7.步骤二、配置gelma溶液：取所需质量的gelma放入离心管中，将所述引发剂标准溶液加入所述离心管，震荡数次使gelma浸润，水浴避光加热溶解，期间震荡数次，用过滤器过滤除菌，得到纯净的gelma溶液；
8.步骤三、微球制备：准备混合prp的gelma与油相，分别由两个推进泵在gelma与油相接触后，gelma被剪切力制作成为微球，经紫外照射固化，收集，收集微球后，双蒸水多次
洗涤离心，得到负载prp的gelma微球；
9.步骤四、材料混合制备：将gelma微球加入水凝胶中得到所述负载并缓控释prp的生物医药材料。
10.优选的，所述步骤一中，采用20mlpbs缓冲液加入装有0.05g引发剂lap的棕瓶中。
11.优选的，所述步骤一中，采用40-50℃水浴加热溶解15min，震荡数次制得0.25％(w/v)引发剂标准溶液。
12.优选的，所述步骤二中，采用40-50℃水浴避光加热溶解30min。
13.优选的，所述步骤二中，采用0.22μm过滤器过滤除菌。
14.优选的，所述步骤三中，混合prp的甲基丙烯酰取代度为60的gelma与油相，分别采用两个推进泵，且速度分别为1.2ml/h，12ml/h。
15.优选的，所述步骤四中，所述gelma微球的质量浓度为200mg/ml，得到prp@gelma微球/水凝胶复合材料。
16.本发明提供了一种可以负载并缓控释prp的生物医药材料的制备方法。
17.具备以下有益效果：
18.1、本发明中，prp是血制品，获得成本低，内含多种生长因子，长期释放对子宫内膜的修复作用较强。
19.2、本发明微球/水凝胶复合材料相对于单一水凝胶及单一微球材料有优势，比微球释放性能好，对prp包裹性和可控性比水凝胶强，而水凝胶粘附性比微球好，可以帮助材料更好地黏附于子宫内膜上。
20.3、本发明可通过调整微球甲基丙烯酰取代度及质量浓度调整prp释放时间窗，实现控制性释放。
21.4、本发明为复合材料，释放性能及粘附性均强于单一材料，可通过调整微球甲基丙烯酰取代度及质量浓度调整prp释放时间窗。
附图说明
22.图1为本发明的方法流程示意图；
23.图2为本发明的生物医药材料用于子宫内膜基质细胞培养的第一天示意图；
24.图3为本发明的生物医药材料用于子宫内膜基质细胞培养的第七天示意图；
25.图4为本发明的生物材料可注射性示意图；
26.图5为本发明的prp@gelma微球/水凝胶复合材料示意图。
具体实施方式
27.下面将结合本发明说明书附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
28.参考图1-5，本发明实施例提供一种可以负载并缓控释prp的生物医药材料的制备方法，包括以下步骤：
29.步骤一、配置引发剂标准溶液：取pbs缓冲液加入装有引发剂lap的棕瓶中，以水浴
加热溶解，震荡数次，制得引发剂标准溶液；
30.步骤二、配置gelma溶液：取所需质量的gelma放入离心管中，将所述引发剂标准溶液加入所述离心管，震荡数次使gelma浸润，水浴避光加热溶解，期间震荡数次，用过滤器过滤除菌，得到纯净的gelma溶液；
31.步骤三、微球制备：准备混合prp的gelma与油相，分别由两个推进泵在gelma与油相接触后，gelma被剪切力制作成为微球，经紫外照射固化，收集，收集微球后，双蒸水多次洗涤离心，得到负载prp的gelma微球；
32.步骤四、材料混合制备：将gelma微球加入水凝胶中得到所述负载并缓控释prp的生物医药材料。
33.组织工程学是一门可以研制生物替代品以修复和重建器官结构、维持改善器官功能的新兴学科，组织工程能够为组织修复与重建提供理想的生物材料支架。目前常见生物材料有水凝胶、纤维膜、壳聚糖、微球等类型，根据其表现出不同的理化特性应用于不同疾病领域中。近年，组织工程为促进子宫内膜的再生提供了新视角，但目前仍处于起步阶段。水凝胶属于天然生物材料，其具有良好的生物相容性以及细胞粘附性；微球是一种微米尺寸球状或类球状聚集体的高分子生物材料，其尺寸便于调节，微球间形成的间隙利于细胞侵袭与迁移、血管生成、营养物质的输送，为细胞生长及组织再生提供良好的微环境；水凝胶和微球都是较好的药物缓释载体，能通过调节材料和性能调控负载物的释放曲线和释放时间窗，在组织修复与再生中有很好的应用价值。随着对生物材料研究的不断深入，发现由两种或两种以上不同材料复合而成的生物医学材料不仅能够提高材料的生物相容性，更具备优越的理化特性，能够弥补单一生物材料在应用过程中的局限性，能够更好的满足机体结构和功能恢复的不同要求。
34.因此，考虑到可注射微球/水凝胶复合材料理化性可调、生物相容性好，作为药物缓释载体具有诸多优势，将其与prp结合，负载并缓慢释放prp，延长prp的作用时间，代替传统prp多次宫腔灌注的治疗方式，减少资源浪费，利于子宫内膜原位再生及功能重建。
35.本发明prp是血制品，获得成本低，内含多种生长因子，长期释放对子宫内膜的修复作用较强。微球/水凝胶复合材料相对于单一水凝胶及单一微球材料有优势，比如微球释放性能好，对prp包裹性和可控性比水凝胶强，而水凝胶粘附性比微球好，可以帮助材料更好地黏附于子宫内膜上。可通过调整微球甲基丙烯酰取代度及质量浓度调整prp释放时间窗，实现控制性释放。负载并缓控释prp的生物医药材料为复合材料，释放性能及粘附性均强于单一材料，可通过调整微球甲基丙烯酰取代度及质量浓度调整prp释放时间窗。
36.实施例：
37.1、gelma水凝胶制备
38.①
配置0.25％(w/v)引发剂标准溶液：取20mlpbs加入装有0.05g引发剂lap的棕瓶中，以40-50℃水浴加热溶解15min，震荡数次。
39.②
配置gelma溶液(5-30％w/v)：取所需质量的gelma放入离心管，将所配置的引发剂标准溶液加入上述离心管，震荡数次使gelma浸润，40-50℃水浴避光加热溶解30min，期间震荡数次，将所得gelma用0.22μm过滤器过滤除菌，得到纯净的gelma溶液。
40.2、微球制备——液滴微流控法
41.准备混合prp的甲基丙烯酰取代度为60的gelma与油相，分别由两个推进泵，速度
分别为1.2ml/h，12ml/h，在gelma与油相接触后，gelma被剪切力制作成为微球，经紫外照射固化，收集，收集微球后，双蒸水多次洗涤离心，得到负载prp的gelma微球。
42.3.材料混合：将gelma微球以200mg/ml的质量浓度加入水凝胶中得到prp@gelma微球/水凝胶复合材料。
43.其中，甲基丙烯酰化明胶(gelma)由于具有生物兼容性好、可见光固化的特点，已广泛应用于细胞3d培养、组织工程、生物3d打印等研究领域。pbs缓冲液，是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液，主要成分为na2hpo4、kh2po4、nacl和kcl，起溶解保护试剂的作用。
44.附图1所示为生物医药材料用于子宫内膜基质细胞培养的第一天示意图；
45.附图2所示为生物医药材料用于子宫内膜基质细胞培养的第七天示意图；
46.附图3所示为生物材料可注射性示意图。
47.prp是血制品，获得成本低，内含多种生长因子，长期释放对子宫内膜的修复作用较强，微球/水凝胶复合材料对prp包裹性和可控性比水凝胶强，而水凝胶粘附性比微球好，可以帮助材料更好地黏附于子宫内膜上。
48.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。