1.本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种苯并氮杂卓类化合物在制备预防或治疗结核病药物中的应用。
背景技术：
2.结核病(tuberculosis)是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，mtb)引起的一种传染病，它会损害身体的所有器官，最常见的是对肺部的影响，是全球范围内传染病导致死亡的重要原因之一。据估计，2020年全球有1000万人患上肺结核，约132万人死亡，与2019年相比有所增加。随着耐药结核病的出现也开始对公共健康造成威胁，加剧了治疗的难度。为了减轻结核病治疗的沉重负担，迫切需要更多的新型抗结核病药物来缓解其对公共健康造成影响。
技术实现要素：
3.为解决上述技术问题，本发明提出了一种苯并氮杂卓类化合物(gsk-j4hydrochloride)在制备预防或治疗结核病药物中的应用。
4.为实现上述目的，本发明提供了一种苯并氮杂卓类化合物gsk-j4hydrochloride在制备预防或治疗结核病药物中的应用，gsk-j4 hydrochloride的结构如下：
[0005][0006]
进一步地，所述结核病是由结核分枝杆菌感染而引起的全身性慢性传染病。
[0007]
进一步地，所述结核病是由结核分枝杆菌感染引起的肺结核。
[0008]
进一步地，所述结核病是由结核分枝杆菌感染引起的骨结核。
[0009]
进一步地，所述结核病是由结核分枝杆菌感染引起的淋巴结核。即由结核分枝杆菌感染而引起的全身性慢性传染病包括肺结核、骨结核或淋巴结核。
[0010]
gsk-j4 hydrochloride对结核分枝杆菌具有靶向性，而对其他组织、活细胞或微生物无毒。
[0011]
进一步地，在gsk-j4 hydrochloride预防或者治疗结核病过程中，gsk-j4hydrochloride通过抑制结核分枝杆菌甲硫氨酸氨基肽酶发挥抗结核作用。
[0012]
进一步地，预防或者治疗结核病药物的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂或注射剂。
[0013]
苯并氮杂卓类化合物在制备抑制结核分枝杆菌活性药物中的应用，gsk-j4hydrochloride的结构如下：
[0014][0015]
与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：
[0016]
本发明提供了苯并氮杂卓类化合物gsk-j4 hydrochloride的新用途，其可以用于制备预防或者治疗结核病药物，gsk-j4 hydrochloride通过抑制结核分枝杆菌甲硫氨酸氨基肽酶发挥抗结核作用，且对结核分枝杆菌具有靶向性，而对其他组织、活细胞或微生物无毒。
附图说明
[0017]
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0018]
图1为苯并氮杂卓类化合物gsk-j4 hydrochloride的1h nmr图谱；
[0019]
图2为苯并氮杂卓类化合物gsk-j4 hydrochloride的
13
c nmr图谱；
[0020]
图3为苯并氮杂卓类化合物gsk-j4 hydrochloride抗结核分枝杆菌h37ra的效果；
[0021]
图4为苯并氮杂卓类化合物gsk-j4 hydrochloride对革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌的抑制效果，(a)为gsk-j4 hydrochloride对革兰氏阴性菌的抑制效果图，(b)为gsk-j4 hydrochloride对革兰氏阳性菌的抑制效果图；
[0022]
图5为苯并氮杂卓类化合物对活细胞的影响，(a)为gsk-j4 hydrochloride对a549的影响图，(b)为gsk-j4 hydrochloride对rko的影响图，(c)为gsk-j4hydrochloride对mcf-7的影响图；
[0023]
图6为苯并氮杂卓类化合物对结核分枝杆菌菌体的影响，(a)为空白对照组和gsk-j4 hydrochloride对结核分枝杆菌菌体影响的扫描电镜图，(a)中左图为空白对照组，(a)中右图为gsk-j4 hydrochloride对结核分枝杆菌菌体的影响，(b)为空白对照组和gsk-j4 hydrochloride对结核分枝杆菌菌体影响的透射电镜图，(b)中左图为空白对照组，(b)中右图为gsk-j4 hydrochloride对结核分枝杆菌菌体的影响；
[0024]
图7为苯并氮杂卓类化合物对结核分枝杆菌来源甲硫氨酸氨基肽酶的影响。
具体实施方式
[0025]
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
[0026]
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包
括或排除在范围内。
[0027]
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
[0028]
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
[0029]
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
[0030]
本发明实施例中苯并氮杂卓类化合物按照文献li y,et al.therapeutic potential of gsk-j4,a histone demethylase kdm6b/jmjd3 inhibitor,for acute myeloid leukemia[j].j cancer res clin oncol.2018,144(6):1065-1077.记载的方法合成。
[0031]
实施例1
[0032]
苯并氮杂卓类化合物gsk-j4 hydrochloride，结构如下：
[0033][0034]
如图1-2所示，其波谱数据如下：
[0035]1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ12.92(1h,d,j＝2.4hz)，9.04(1h,d,j＝2.4hz)，8.84(1h,d,j＝4.2hz)，8.52(1h,d,j＝7.8hz)，8.18(1h,s)，8.05(1h,s)，7.80(1h,s)，7.21(2h,m)，8.20(1h,d,j＝7.8hz)，8.11(1h,d,j＝7.8hz)，7.81(4h,m)，7.62(1h,m)，7.08(2h,d,j＝7.2hz)，4.71(1h,m)，1.30(6h,d,j＝6.0hz)。
[0036]
13
c nmr(150mhz,dmso-d6)δ171.74,160.99,140.32,130.42,128.48,126.94,60.78,37.64,33.39,14.58.
[0037]
实施例2
[0038]
苯并氮杂卓类化合物gsk-j4 hydrochloride抗结核分枝杆菌h37ra的效果：
[0039]
基于微孔板的alamarblue实验，检测苯并氮杂卓类化合物对结核分枝杆菌的最小抑菌浓度，具体实验步骤如下：
[0040]
(1)准备浓度为106cfu/ml的病原菌悬液，以500μl/孔加入至48孔板；
[0041]
(2)将苯并氮杂卓类化合物gsk-j4 hydrochloride按照二倍稀释法加入到步骤(1)所得含菌液的48孔板，浓度梯度设置为10μm、5μm、2.5μm、1.25μm、1μm、0.5μm、0.25μm、0.125μm；同时设置添加抗结核药物异烟肼(inh浓度为0.4μm)处理孔为阳性对照组，只含有
菌液的处理孔为空白对照组；
[0042]
(3)将步骤(2)所得48孔板用封口膜密封，放至37℃恒温培养箱，培养7天后，每个孔分别取出100μl放入到96孔板中，再加入50μl刃天青显色液进行显色；
[0043]
(4)显色期间，实时观察96孔板中每个孔液体的颜色变化，直到空白对照组颜色由蓝色变为粉色，取出96孔板，观察，拍照。
[0044]
结果如图3所示，观察gsk-j4 hydrochloride对敏感菌株h37ra抑制效果。可以发现，gsk-j4 hydrochloride对上述结核分枝杆菌具有显著的抑制活性，且当gsk-j4 hydrochloride浓度为5μm以上时，其抑制活性与inh对照组相似。
[0045]
实施例3
[0046]
苯并氮杂卓类化合物gsk-j4 hydrochloride对革兰氏阴性菌(大肠杆菌)及革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)的抑制效果：
[0047]
基于微孔板的alamarblue实验，检测苯并氮杂卓类化合物对对革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌最小抑菌浓度，具体实验步骤如下：
[0048]
(1)准备浓度为105cfu/ml的病原菌悬液，以100μl/孔加入至96孔板；
[0049]
(2)将苯并氮杂卓类化合物加入到步骤(1)所得含菌液的96孔板，浓度梯度设置为100μm、50μm、20μm、10μm、1μm；同时设置添加氨苄霉素(amp浓度为50μg/ml)处理孔为阳性对照组，只含有菌液的处理孔为空白对照组；
[0050]
(3)将步骤(2)所得96孔板用封口膜密封，放至37℃恒温培养箱，培养1天后，加入50μl刃天青显色液进行显色；
[0051]
(4)显色期间，实时观察96孔板中每个孔液体的颜色变化，直到空白对照组颜色由蓝色变为呈黄色(受培养基颜色影响)，取出96孔板，观察，拍照。
[0052]
结果如图4所示，观察gsk-j4 hydrochloride对革兰氏阴性菌基本无毒，在10μm以内对革兰氏阳性菌基本无毒。
[0053]
将实施例2和实施例3结果进行整理，结果如表1所示。
[0054]
表1
[0055][0056]
实施例4
[0057]
苯并氮杂卓类化合物对活细胞的影响：
[0058]
基于微孔板的cck-8实验，检测苯并氮杂卓类化合物gsk-j4 hydrochloride对细胞的毒性，验证药物的安全性，具体实验步骤如下：
[0059]
(1)选择a549(人肺癌细胞)、rko(人结肠癌细胞)、mcf-7(人乳腺癌细胞)三种细胞(均购自美国atcc细胞库)进行实验，将细胞分别进行消化、计数后，调整细胞浓度为5
×
104个/ml，作为铺板的细胞悬液，以100μl/孔的添加量加入到96孔板中，然后放至37℃co2恒温培养箱培养12h；
[0060]
(2)将gsk-j4 hydrochloride加入到步骤(1)中所得的96孔板中，浓度梯度设置为
100μm、50μm、20μm、10μm、1μm；同时设置添加紫杉醇(浓度为10μm)处理孔为阳性对照组，只含有细胞的处理孔为对照组，只含有培养基的孔为空白组(blank)，然后放置回37℃co2恒温培养箱培养48h；
[0061]
(3)将步骤(2)中的96孔板从恒温培养箱中取出，弃除上清，避光，加入100μl cck-8(10％)，然后放置回37℃co2恒温培养箱孵育，每隔30min，用荧光酶标仪检测96孔板中每个孔的液体在450nm发射波长下的吸收值，去除培养基和cck-8的背景后，计算活性存活率；其中，活性存活率＝(实验组od值-空白组od值)/(对照组od值-空白组od值)
×
100％。
[0062]
结果如图5所示，gsk-j4 hydrochloride对三种细胞的ic
50
》15μm，大于抗结核浓度，因此，作为临床药物的开发具有一定的安全性。
[0063]
实施例5
[0064]
苯并氮杂卓类化合物gsk-j4 hydrochloride对结核分枝杆菌菌体的影响：
[0065]
基于电镜实验，观察gsk-j4 hydrochloride对结核分枝杆菌菌体的影响，具体实验步骤如下：
[0066]
(1)将m.tb h37ra培养两瓶，每瓶20ml，待菌液od
595
值为0.3左右时，其中一瓶菌液加入终浓度为2
×
mic的苯并氮杂卓类化合物，作为实验组；另一瓶菌液加入与实验组化合物等体积的dmso，作为空白对照组。将2瓶菌液放置于37℃摇床振荡培养24h；
[0067]
(2)将步骤(1)中的菌液各平分为两份，转移至50ml无菌离心管中，4℃，3000
×
g离心10min，收集菌体沉淀；
[0068]
(3)向步骤(2)中得到的两份沉淀(实验组和空白对照组)中加入5ml pbs(0.1m，ph 7.4)洗涤菌体沉淀，洗涤3次，最后加入适量体积(500μl左右)的2.5％戊二醛，4℃固定过夜，待测扫描电镜。
[0069]
(4)向步骤(2)中得到的两份沉淀(实验组和空白对照组)中适量体积(500μl左右)的2.5％戊二醛，4℃固定过夜，待测透射电镜；
[0070]
(5)将步骤(3)(4)所得的菌体进行电镜检测，观察苯并氮杂卓类化合物对结核分枝杆菌菌体的影响。
[0071]
结果如图6中(a)所示，与空白对照组比较，实验组菌体长度明显缩短，表面起皱扭曲，甚至部分断裂，可见碎片；此外，如图6中(b)所示，实验组菌体菌壁完整性被破坏，轮廓变得模糊。这些结果表明gsk-j4 hydrochloride通过破坏细菌细胞壁表现出抗结核作用。
[0072]
实施例6
[0073]
苯并氮杂卓类化合物gsk-j4 hydrochloride对结核分枝杆菌来源甲硫氨酸氨基肽酶的影响：
[0074]
基于体外代谢实验，研究gsk-j4 hydrochloride对结核分枝杆菌来源甲硫氨酸氨基肽酶的影响，具体实验步骤如下：
[0075]
(1)基于结核分枝杆菌h37ra蛋白信息rv0734，设计结核分枝杆菌来源甲硫氨酸氨基肽酶mtmet-ap1，选择bl 21(de3)感受态细胞，通过itpg(1mm，16℃低温诱导24h)，镍柱纯化获得纯化蛋白；
[0076]
(2)利用步骤(1)中获得的蛋白验证gsk-j4 hydrochloride的抑制作用，反应体系(200μl)包括:hepes(100mm)，nacl(50mm)，cocl2(200μm)，mtmet-ap1(11μg/ml)以及用于检测结核分枝杆菌来源甲硫氨酸氨基肽酶mtmet-ap1的荧光探针ddan-mt(2.5μm)，设抑制剂
终浓度(μm)：1、1.5、2、2.5、3、5、8、10，控制dmso体积《1％，37℃下反应30min；
[0077]
(3)向步骤(2)中加入100μl乙腈终止实验，于20000g，20min离心，去除蛋白。吸取200μl上清液通过酶标仪分析其荧光响应值(激发/发射波长：λex 600/λem 668nm)。
[0078]
结果如图7所示，通过结果可知gsk-j4 hydrochloride的ic
50
为0.85μm，其通过抑制结核分枝杆菌中甲硫氨酸氨基肽酶活性表现出抗结核作用。
[0079]
以上，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。