抗-pd-1抗体及其在制备治疗胆管癌患者的药物中的用途
技术领域
1.本发明属于抗体领域，具体的说，涉及一种抗-pd-1抗体及其在制备治疗胆管癌患者的药物中的用途。
背景技术：
2.胆管癌cancer of biliary duct是指原发于左右肝管汇合部至胆总管下端的肝外胆管恶性肿瘤原发性胆管癌较少见，占普通尸检的0.02％～0.45％，肿瘤病人尸检的2％胆道手术的0.3％～1.8％。在欧美胆囊癌为胆管癌的1.5～5倍，日本的资料则胆管癌多于胆囊癌男女之比约为1.5～3.0。发病年龄多为50～70岁，但也可见于年轻人。
3.胆管癌早期症状不论在哪一部位，其临床表现主要为伴有上腹部不适的进行性黄疸、食欲不振、消瘦、瘙痒等。如合并胆结石及胆道感染，可有发冷、发热等，且有阵发性腹痛及隐痛。如位于一侧肝管癌肿，开始常无症状，当影响至对侧肝管开口时，才出现阻塞性黄疸。如胆管中部癌不伴有胆石及感染，多为无痛性进行性阻塞性黄疸。黄疸一般进展较快，不呈波动性。检查可见肝肿大、质硬、胆囊不肿大。如为胆总管下端部，则可扪及肿大的胆囊。如肿瘤破溃出血，可有黑便或大便潜血试验阳性、贫血等表现。
4.虽然近年来对胆管癌的前期诊断、手术治疗、化疗药物的研究开发获得了一定的研究成果，但是胆管癌的死亡率和5年内的复发率仍然居高不下，也在另一方面证明了开发新的药物治疗和治疗策略的必要性。
技术实现要素：
5.为了克服背景技术中存在的问题，本发明提供了一种抗-pd-1抗体及其在制备治疗胆管癌患者的药物中的用途。
6.为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：
7.抗-pd-1抗体或其抗原结合片段在制备治疗胆管癌患者的药物中的用途，其中，所述抗体或其抗原结合片段包括：
8.重链可变区，其包括seq id no:1所示的cdr1、seq id no:2所示的cdr2和seq id no:3所示的cdr3；和轻链可变区，其包括seq id no:4所示的cdr1、seq id no:5所示的cdr2和seq id no:6所示的cdr3。
9.进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，其是全人源单克隆抗体。
10.进一步的，所述抗体或其抗原结合片段，其中所述全人源单克隆抗体由转基因大鼠生产。
11.进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，其阻断人pd-1与其配体结合，并且因此提供以下活性中的至少一个：
12.a)在cd4 t细胞中诱导il-2的产生；
13.b)在cd4 t细胞中诱导ifnγ的产生；
14.c)诱导cd4 t细胞的增殖；以及
15.d)逆转treg抑制功能。
16.进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，其是双功能抗体(diabody)、scfv、scfv二聚体、dsfv、(dsfv)2、dsfv-dsfv'、fv片段、fab、fab'或f(ab')2。
17.进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，所述双功能抗体是bsfv或ds双功能抗体(ds diabody)。
18.进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包括免疫球蛋白恒定区。
19.进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包括缀合物。
20.本发明的有益效果：本发明提供了一种抗-pd-1抗体，为胆管癌的治疗提供了一种新的途径。
具体实施方式
21.为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。
22.实施例1：抗体杂交瘤的生成
23.1.1免疫原的生成
24.合成编码pd-1和pd-l1的ecd的或二者全长的dna并插入表达载体pcdna3.3。大量制备质粒dna并经测序验证插入的dna序列。pd-1ecd和pd-l1ecd的融合蛋白包含多种标记，包括人源fc、小鼠fc和his标记，所述融合蛋白通过将人pd-1ecd基因转染进入cho-s或hek293细胞制备。5天后，将从所述瞬时转染的细胞培养中收获的上清液用于蛋白纯化。将所述融合蛋白纯化并定量以用于免疫和筛选。
25.1.2建立稳定细胞系
26.为了获得用于抗体筛选和验证的工具，建立了pd-1和pd-l1转染细胞系。简言之，根据厂商说明书使用lipofectamine 2000转染试剂盒将含有全长pd-1或pd-l1的pcnd3.3表达载体转染cho-k1、293f或ba/f3细胞。转染后48-72小时，在含有用于选择的杀稻瘟菌素(blasticidin)或g418的培养基中培养所述转染细胞。一段时间后，会选择出在基因组dna中稳定掺入了pd-1或pd-l1基因的细胞。同时，验证所述细胞是否具有目的基因pd-1和pd-l1的表达。一旦验证了所述表达，通过有限的稀释挑选目的单个克隆并放大到大容量。随后将建立的单克隆细胞系在含有低剂量抗生素杀稻瘟菌素(blasticidin)或g418的培养基中维持。
27.1.3抗体杂交瘤的建立
28.1.3.1免疫和细胞融合：使用8-10周龄omt-大鼠(获自open monoclonal technology,inc.,palo alto,us)用10μg titermax中的人源pd-1ecd蛋白在足垫上进行初次激发免疫，每3天用铝剂配置的pd-1ecd重复进行免疫。每2周对大鼠取血收集血清并通过elisa或facs测试测定抗体滴度。当所述抗体滴度达到足够高时，对大鼠给予最后的不含佐剂的激发(加入100μl 1xpbs替代)，按如下步骤进行细胞融合：将从免疫的omt-大鼠的淋巴结中分离的b淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合(以1:1比例)。用5-10ml ecf溶液洗涤并悬浮细胞混合物。加入ecf溶液将浓度调整至2x106细胞/ml。在细胞电融合后，将融合室中的细胞悬液立即转移进入含有更多体积培养基的无菌管中。在37℃培养超过24小时后，将所述细胞悬液混合并移液入96孔板(0.5x106细胞/板)。在37℃、5％co2条件下培养细胞。当
所述克隆足够大时，将100μl上清液从96孔板转移用于抗体筛选测试。
29.1.3.2杂交瘤上清液的第一轮和确认筛选：使用elisa测试作为第一轮筛选方法以测试杂交瘤上清液与pd-1蛋白的结合。简言之，用1μg/ml的人源pd-1胞外结构域的可溶性蛋白在4℃包被平板过夜。在封闭和洗涤后，将所述杂交瘤上清液转移至所述包被的平板并在室温下孵育1小时。之后洗涤所述平板并随后用山羊抗大鼠igg1 hrp(bethyl)和山羊抗大鼠igg2b hrp(bethyl)的二抗孵育45分钟。洗涤后，加入tmb底物并用2m hcl终止反应。使用酶标仪(molecular device)读取450nm处的吸收光值。为了确认pd-1抗体与在细胞膜上表达的构象pd-1分子的天然结合，在pd-1转染的cho-s细胞系上进行facs分析。以1x106细胞/ml的浓度将表达pd-1的cho-s细胞转移至96孔u形底平板(bd)。随后将所述杂交瘤上清液转移至所述平板并在4℃下孵育1小时。用1xpbs/1％bsa洗涤后，加入山羊抗大鼠fitc(jackson immunoresearch lab)二抗并在4℃下与细胞避光孵育1小时。之后洗涤所述细胞并在1xpbs/1％bsa中重悬或在4％福尔马林中固定所述细胞，并以流式细胞仪(bd)分析。使用相同方法进行抗体与母本cho-s细胞系的结合。
30.1.3.3杂交瘤亚克隆：一旦通过第一轮和确认筛选验证了特异性结合和阻断，可以使用所述阳性杂交瘤细胞系进行亚克隆。简言之，对于每个杂交瘤细胞系，将细胞进行计数并在克隆培养基中稀释至5细胞/孔、1细胞/孔和0.5细胞/孔。将200μl/孔铺板入96孔板，一个平板为5细胞/孔，一个平板为1细胞/孔和四个平板为0.5细胞/孔。将所有平板置于37℃、5％co2。孵育直至所有细胞系可以通过elisa测试进行检查。
31.实施例2：抗体杂交瘤细胞测序和全人源抗体表征
32.2.1抗体杂交瘤细胞测序：用trizol试剂从单克隆杂交瘤细胞中分离rna。用以下方案扩增pd-1抗体的vh和vl：简言之，首先如本技术描述的使用反转录酶将rna反转录成cdna，反应系统(20μl)：
33.取10μl的pcr反应产物进行与pmd18-t载体的连接反应。用10μl的连接产物转化top10感受态细胞并将所述混合物转移至按照标准方案预热的2-yt cab平板上，孵育过夜。使用m13-48和m13-47引物通过pcr检查阳性克隆，随后进行测序。
34.2.2全人源抗体分子构建：按上文的表述将pd-1抗体的vh和vl进行扩增。所述pcr反应产物通过pcr clean-up试剂盒进行纯化并用限制性酶pme i和bssh ii在37℃消化vl和pci载体2小时。将所述反应产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳并按照厂商说明书进行凝胶提取。用以下步骤连接经消化的vl和pci载体：
35.在16℃下孵育所述混合物30分钟。用10μl反应产物进行转化和克隆增长。使用确认的克隆进行质粒pci-vl dna的提取。随后将所述pci-vl载体和vh片段用xbal和sal i进行消化并用t4dna连接酶在16℃下连接纯化的经消化的vh和载体30分钟。一旦经测序验证插入的vl和vh的序列，使用包含全人源pd-1抗体的整个igg的表达载体进行瞬时转染和建立稳定细胞系。
36.实施例3：全人源抗体的表征
37.3.1表面等离子体共振(spr)测定的全动力学结合亲和性：通过spr法使用proteon xpr36(bio-rad)对抗体与pd-1的亲和性和结合动力学进行表征。将蛋白a蛋白(sigma)通过胺偶联固定于glm传感芯片上(bio-rad)。使纯化的抗体流过传感器芯片并被蛋白a捕获。将芯片旋转90
°
并用电泳缓冲液洗涤(1xpbs/0.01％tween20,bio-rad)直至基线稳定。使5个
浓度的人pd-1和电泳缓冲液以流速100μl/min流经所述抗体流动单元，先为结合相流动240s，随后解离相600s。在每次运行后用ph 1.7的h3po4再生所述芯片。使用proteon软件将结合和解离曲线拟合至1:1的langmiur结合模型。
38.3.2流式细胞仪(facs)测定的pd-1抗体与细胞表面pd-1分子的结合亲和性：经facs分析测试抗体与细胞表面pd-1的结合亲和性。以5x105细胞/ml的浓度将表达pd-1的cho-s细胞转移至96孔u形底平板(bd)。待测抗体用洗涤缓冲液以1:2系列稀释(1xpbs/1％bsa)并在4℃下孵育1小时。加入二抗山羊抗-人igg fc fitc(3.0摩尔fitc每摩尔igg，(jackson immunoresearch lab))并在4℃下避光孵育1小时。随后洗涤一次细胞并在1xpbs/1％bsa中重悬，使用流式细胞术(bd)分析。基于被定量的小珠(quantumtm mesf kit(bangs laboratories,inc.))，将荧光强度转换为每个细胞上结合的分子。使用graphpad prism5计算kd。
39.3.3人pd-1抗体对t细胞增殖的作用。使用同种异体反应测试pd-1抗体对t淋巴细胞增殖的作用。在96孔u底形组织培养板中在包含10％fcs和抗生素的200μl rpmi 1640中进行原代树突细胞(dc)-刺激的mlr。将dc与1x105的同种异体总cd4
t细胞以1:10和1:100的dc:t细胞的比例混合。在存在或不存在中和mab的条件下进行培养：人pd-1抗体和基准抗体a和b的使用浓度为10μg/ml。孵育测试5天，在最后16小时过程中加入1uci/孔的[3h]胸苷。通过闪烁计数测定[3h]胸苷的掺入，用三复孔的平均[3h]胸苷掺入(每分钟计数)表示增殖反应。仅有dc的计数常规为《1000cpm。显示的结果是进行了最少5次试验的代表性的示例。
[0040]
人树突细胞(dc)和以上同种异体mlr中使用的cd4
t、cd8
t和总细胞以如下步骤从pbmc中生成：通过使用人单核细胞浓缩试剂盒(human monocyte enrichment cocktail kit)根据厂商(stemcell meylan)的说明书经负性筛选从pbmc中纯化人单核细胞。简言之，使用ficoll-paque梯度从健康的供体血液中分离pbmc。用pbs洗涤细胞两次，随后在分离缓冲液中以1x108细胞/ml重悬，并用单核细胞浓缩ab混合物在4℃下孵育30分钟。收集通过macs柱的未标记的单核细胞。为生成idc，将单核细胞在含有10％fcs和抗生素的rpmi 1640的培养基中与gm-csf(peprotech,rocky hill,nj；800u/ml)和il-4(peprotech；500u/ml)培养，细胞浓度为2x106细胞/ml。每天用含有gm-csf和il-4的培养基置换一半的培养基。在第5天用lps(026:b6；sigma-aldrich,st.louis,mo；1μg/ml)额外刺激idc 24小时以生成成熟dc。通过根据厂商说明书(stemsep)将pbmc与人cd4
t、cd8
t和总t细胞浓缩混合物和磁性胶体孵育进行负性选择，纯化cd4
t、cd8
t和总t细胞。
[0041]
在pd-1抗体1.7.3hab、1.49.9hab、1.103.11hab、1.139.15hab和1.153.7hab存在或不存在的情况下，用同种异体dc刺激人cd4
t细胞。经[3h]胸苷的掺入评估cd4
t细胞的增殖。1.7.3hab、1.49.9hab、1.103.11hab、1.139.15hab和1.153.7hab提高了浓度依赖的t细胞增殖。
[0042]
3.4体外人源pd-1抗体对细胞因子ifnγ分泌的作用：为了评估人源pd-1抗体对细胞因子ifnγ的产生的阻断作用，我们在同种异体-mlr中进行了ifnγ的产生的实验。简言之，根据厂商的说明书用cd4
t细胞浓缩试剂盒(cd4
t cell enrichment cocktail kit)经负性筛选将人源cd4
t细胞从pbmc中纯化出来。在gm-csf和il-4中培养5天的单核细胞中生成未成熟dc，并用lps以1μg/ml刺激过夜，分化成成熟的dc。将cd4
t细胞和idc/mdc以10:1和100:1的t:dc比例混合。在存在或不存在人源pd-1抗体和基准抗体的情况下进行培养。5
天后，收集每个培养物的上清液测定细胞因子ifnγ。上清液中的ifnγ水平通过elisa测试测定。简言之，用在包被缓冲液中稀释的抗人ifnγmab包被maxisorp平板(0.75μg/ml；即稀释为1/1360)，50μl/孔(即对一个满的96孔板加入3.7μl的抗体至5ml的包被缓冲液中)并在4℃孵育过夜。加入200μl/孔的封闭缓冲液2小时，以封闭多余的蛋白结合能力。准备重组ifnγ稀释液作为标准液，用完全培养基从8000pg/ml进行两倍稀释直至125pg/ml，加上只有完全培养基的情况。洗涤平板，加入标准液和测试上清液(100μl/孔)，孵育2-4小时。加入在封闭缓冲液中的生物素化抗-ifnγmab(1/1333)，之后加入额外亲和素过氧化物酶。加入tmb底物进行所述反应，用2m hcl终止反应。在450nm测定吸光值。
[0043]
结果显示，存在或不存在1.7.3hab、1.49.9hab、1.103.11hab、1.139.15hab和1.153.7hab抗体的情况下，用同种异体dc刺激人cd4
t细胞。用elisa测定ifnγ水平。结果显示全人源pd-1抗体以剂量依赖的方式增加ifnγ的分泌。
[0044]
3.5体外人源pd-1对白介素2(il-2)的产生的作用：将cd4
t细胞和idc/mdc以10:1和100:1的t:dc比例混合。在存在或不存在人源pd-1抗体和基准抗体的情况下进行培养。5天后，收集每个培养物的上清液测定细胞因子。上清液中的il-2水平通过elisa测试测定。
[0045]
结果显示了在存在或不存在本技术的抗体或对照抗体的情况下，用同种异体dc刺激人cd4
t细胞。用elisa测定il-2水平。结果显示全人源pd-1抗体以剂量依赖的方式增加ifnγ的分泌。所述结果显示抗pd-1抗体以剂量依赖的方式增加il-2的分泌。
[0046]
3.6人源pd-1抗体通过自体抗原特异性免疫反应对细胞增殖和细胞因子的生产的作用：在本测定中，t细胞和dc细胞来自相同供体。简言之，从pbmc中纯化cd4
t细胞并在cmv pp65肽和低剂量的il2(20u/ml)中培养，同时，从在gm-csf和il-4中的相同供体的pbmc中培养的单核细胞中生成dc。5天后，用将用cmv pp65肽处理的cd4
t细胞与dc共培养，所述dc在存在或不存在人源pd-1抗体和基准抗体(作为对照)的条件下脉冲式加入pp65肽。
[0047]
在第5天，从每个培养物中取100μl的上清液用于测定细胞因子ifnγ和il-2。通过elisa测试检测ifnγ和il-2的产生的水平。针对脉冲式加入cmv pp65肽的dc的特异性t细胞增殖通过[3h]胸苷的掺入测定。
[0048]
结果显示，pd-1抗体提高了由装载了cmv pp65肽的自体dc所刺激的浓度依赖的cmv
-cd4
t细胞的增殖。
[0049]
3.7人源pd-1抗体对调节性t细胞(tregs)抑制功能的作用：tregs是t细胞的一个亚群，其是关键的免疫调节子，在维持自体耐受中起到关键作用。
[0050]
cd4
cd25
调节性t细胞与肿瘤相关，因为在多种癌症病人中发现了增加的tregs数量，且其与较差的预后相关。为了直接评估人源pd-1抗体对免疫抑制响应的作用，我们进行了tregs实验。使用特异性抗-cd25微珠(miltenyi biotec,auburn,ca)和阳性或负性选择，分别分离cd4
cd25
和cd4
cd25-t细胞。开始时，根据厂商说明书(stemsep)，使用人cd4
t细胞浓缩混合物和磁性胶体孵育pbmc，经负性选择纯化cd4
t细胞。之后在macs缓冲液中重悬cd4
t细胞，在冰上与cd25
微珠孵育30分钟，洗涤并装柱。从流出溶液中收集不与柱结合的cd4
cd25-t细胞，并在使用前洗涤。随后从所述柱中恢复cd4
cd25
t细胞并在使用前洗涤。在存在或不存在10μg/ml浓度的人源pd-1抗体的条件下，将tregs与cd4
cd25-t细胞和dc(treg:teff比例为1:1)培养。不用抗体或使用同种型抗体作为阴性对照。在第5天取所述培养物的上清液用于elisa检测细胞因子，通过以1uci/孔的浓度加入[3h]胸苷并进一步培养
18小时，检测细胞增殖。[3h]胸苷的掺入通过闪烁计数。结果显示所述pd-1抗体去除了treg抑制性功能并恢复了响应的t细胞增殖和ifnγ分泌。
[0051]
3.8adcc/cdc测定：为了使健康的pd-1
细胞不需要的毒性降到最低，对选择的抗pd-1全人源抗体进行确认不含adcc和cdc功能。
[0052]
3.9adcc：使用表达高水平细胞表面pd-1的活化t细胞作为靶细胞并用不同浓度的全人源抗体在96孔板中预孵育30分钟，随后以50:1的效应/靶细胞比例加入il-2激活的pbmc(作为天然杀伤(nk)细胞源使用，即效应细胞)。在37℃、5％co2的温箱中孵育所述平板6小时。经细胞毒性检测试剂盒(roche)测定靶细胞裂解。通过molecular devices spectramax m5e酶标仪测定光密度。结果显示，测试的全人源抗pd-1抗体不介导adcc。
[0053]
cdc：将靶细胞(活化t细胞)、稀释的人血清补体(quidel-a112)和不同浓度的全人源pd-1抗体在96孔板中混合。在37℃、5％co2的温箱中孵育所述平板4小时。经celltiter glo(promega-g7573)测定靶细胞裂解。rituxan(roche)和人b淋巴细胞细raji(cd20阳性)作为阳性对照。数据显示pd-1抗体不介导cdc。
[0054]
实施例4：抗pd-1抗体治疗胆管癌有效性和安全性人体试验研究
[0055]
目的：初步评估抗pd-1抗体治疗晚期难治性淋巴瘤和多种实体瘤有效性和安全性。
[0056]
方法：该研究纳入标准为年龄18-75岁、ecog 0-1、未接受过pd-1/ctla-4治疗、病例学确认的难治性实体瘤或淋巴瘤。研究包含ⅰa和ⅰb期两阶段，ⅰa期为剂量递增阶段，ⅰb期为剂量扩展阶段。ⅰa期纳入的患者接受抗pd-1抗体治疗，剂量分别为1、4或10mg/kg每2周一次(q2w)，或240mg q3w或q2w，其主要目的是评估抗pd-1抗体的剂量限制毒性(dlt)以确认rp2d。ⅰb期纳入胆管癌患者接受抗pd-1抗体rp2d单药治疗并评估其疗效，每8周(前12个月)或12周(12个月以后)评估一次，评估标准为recist 1.1(实体瘤)或lugano 2014(淋巴瘤)。主要研究终点为dlt(ⅰa)和疗效(ⅰb)，次要研究终点包括rp2d、最大耐受剂量(mtd)和药代/药效动力学(pk/pd)等。
[0057]
结果：截至2020年4月18日，研究共入组289例患者(ⅰa期24例，ⅰb期265例)。ⅰa期未发生dlt事件，确定的rp2d为240mg q2w；ⅰb期纳入的瘤种为胆管癌(n＝21)。ⅰb期可疗效评估患者260例，62例患者获得客观缓解(完全缓解或部分缓解)，总体客观缓解率(orr)为23.8％，中位无进展生存期(pfs)2.86月(95％ ci:1.4-3.2)。中位总生存期(os)为13.01月(95％ ci:10.38,15.61)(ⅰa/ⅰb期)。ⅰb期阶段(265例)任何治疗中出现的不良事件(teae)发生率为95.1％，3级或以上teae发生率38.5％；药物相关不良反应(trae)发生率为79.2％；免疫相关不良反应(irae)发生率33.6％(3级或以上,4.9％)。
[0058]
胆管疗效详见下表1。
[0059][0060]
表1抗pd-1抗体治疗胆管癌的疗效
[0061]
结论：抗pd-1抗体240mg每2周一次静脉滴注(q2w)治疗胆管癌疗效确切，安全性良好。
[0062]
最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。